Unseres Wissens ist dieses Protokoll das erste, das dezellularisierte Matrices aus fetaler Skelettmuskulatur herstellt, was einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung von Myopathien bietet, die sich in utero entwickeln. Dieses Protokoll generiert eine entwicklungs- und gewebespezifische Metrik, die verwendet werden kann, um das Verhalten von Muskelzellen und die Interaktionen mit der extrazellulären Matrix in einer kontrollierten Umgebung zu untersuchen. LAMA2-CMD ist eine angeborene Muskeldystrophie, die sich bereits bei der Geburt manifestiert.
Dieses Modell kann dazu beitragen, die Mustermechanismen zu entschlüsseln, die an der Entstehung beteiligt sind, und zu neuen Zieltherapien führen. Dieses Protokoll kann an verschiedene Gewebe und Krankheitsmodelle angepasst werden. Je nach Matrix- und Zelltyp können unterschiedliche Komplexitätsgrade erreicht werden, was die Vielseitigkeit des Systems demonstriert.
Dies ist ein sehr einfaches Protokoll. Die größte Herausforderung ist die Entnahme und das Handling der Proben. Aber mit etwas Übung können die technischen Fähigkeiten leicht verbessert werden.
Beginnen Sie damit, einen euthanasierten Fötus nach dem anderen in eine Petrischale mit eiskaltem PBS zu übertragen. Nachdem Sie die Haut und die Gliedmaßen herausgeschnitten haben, schneiden Sie die ventrale Seite des Brustkorbs durch. Entfernen Sie das Brustbein und die darunter liegenden Organe.
Positionieren Sie die Feten mit der Rückenseite nach oben und entfernen Sie den zervikalen Teil der Wirbelsäule. Als nächstes werden die dorsalen Fettdepots und das Bindegewebe der tiefen Rückenmuskulatur entfernt. Verankern Sie nun den Brustkorb mit einer chirurgischen Pinzette.
Kratzen Sie mit einem Mikroskalpell vorsichtig ab, um die tiefe Rückenmuskulatur vom umgebenden Gewebe zu lösen. Lagern Sie das Gewebe in PBS in einer 12-Well-Zellkulturplatte bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Lagern Sie das Gewebe über einen längeren Zeitraum in einem leeren Mikrozentrifugenröhrchen bei minus 80 Grad Celsius.
Verwenden Sie am ersten Tag die gesamte epaxiale Muskelmasse. Geben Sie drei Milliliter hypotonen Puffer mit 1 % Penicillin und Streptomycin in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Geben Sie ein Muskelgewebefragment in jede Vertiefung und inkubieren Sie es über Nacht 18 Stunden lang unter Rühren.
Entfernen Sie den Puffer am zweiten Tag mit einer Pipette mit feiner Spitze. Waschen Sie nun die Proben dreimal mit drei Millilitern PBS unter jeweils einstündigem Rühren. Nach dem Verwerfen des PBS werden die Proben in drei Millilitern 0,05%iger SDS-Detergenzienlösung 24 Stunden lang unter Rühren inkubiert.
Entfernen Sie am dritten Tag das SDS-Reinigungsmittel mit einer feinen Pipette und waschen Sie die Fragmente dreimal mit drei Millilitern hypotonem Waschpuffer unter jeweils 20-minütigem Rühren. Ersetzen Sie die Lösung der Vertiefungen durch zwei Milliliter DNase-Lösung und inkubieren Sie die Gewebefragmente bei 37 Grad Celsius drei Stunden lang unter Rühren. Nachdem Sie die DNase-Lösung entfernt haben, waschen Sie die Fragmente dreimal mit drei Millilitern PBS unter jeweils 20-minütigem Rühren und lassen Sie die letzte Wäsche über Nacht.
In einen T-25-Kolben, der mit subkonfluenten C2C12-Zellen besiedelt ist, werden 500 Mikroliter Trypsin gegeben und in einem Milliliter des vollständigen Mediums resuspendiert. Mischen Sie 10 Mikroliter der Suspension mit 10 Mikrolitern Trypanblau-Farbstoff und laden Sie sie in ein Hämozytometer, um die Zellzahl zu zählen und die Lebensfähigkeit abzuschätzen. Legen Sie die dezellularisierten Matrizen oder dEZMs in einer Laminar-Flow-Haube in eine Petrischale, die PBS mit 1 % Penicillin und Streptomycin enthält.
Trennen Sie die Matrizen mit einem Mikroskalpell und einer Pinzette in kleine Stücke. Übertragen Sie die Fragmente in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte und platzieren Sie drei bis vier Stücke pro Well. Geben Sie 200 Mikroliter vorgewärmtes komplettes Nährmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.
Entsorgen Sie das Medium in der Well-Platte und geben Sie 200 Mikroliter komplettes Nährmedium mit 50.000 lebensfähigen C2C12-Zellen in jede Well. Inkubieren Sie die Well-Platte zwei Tage lang. Übertragen Sie die dECMs mit den Zellen auf eine 48-Well-Platte, die 400 Mikroliter komplettes Nährmedium enthält.
Saugen Sie das Medium alle zwei Tage vorsichtig ab, um eine Ablösung der Matrix zu verhindern, und füllen Sie es bis zum achten Tag mit dem frischen Medium auf. Zur Differenzierung wird das komplette Nährmedium durch ein Differenzierungsmedium ersetzt und vier Tage bis zum 12. Tag inkubiert. Das Muskelgewebe war unmittelbar nach der Isolation rötlich und verfärbte sich durch Zelllyse nach Inkubation in hypotonem Puffer weiß.
SDS bewirkt, dass die Muskeln durchsichtig werden. Nach der DNase-Behandlung wurde eine kleinere, transparente dECM erhalten. Die DNA-Quantifizierung zeigt eine fast 100%ige Abnahme der dEZMs im Vergleich zum nativen Gewebe.
Die dEZMs und das native Gewebe zeigten eine ähnliche tubuläre Färbung für Laminin alpha zwei und Lamininprotein. Die Western-Blot-Analyse des nativen Gewebes zeigte zwei Banden für die Laminin-alpha-Zwei-Untereinheit, während drei kleinere Banden in der dEZM nachgewiesen wurden. Für die Gesamtlaminine zeigten dECM-Proben eine Proteinfragmentierung im Vergleich zum nativen Gewebe.
Fibronektin und Kollagen I waren im interstitiellen Raum zwischen Zellen des nativen Gewebes und den dEZMs vorhanden. Ähnliche Fibronektinbanden waren in beiden Proben vorhanden, was darauf hindeutet, dass es nicht von der Dezellularisierung betroffen ist. In den dEZMs wurden weniger Kollagen-I-Banden beobachtet.
Für Kollagen IV zeigten beide Proben eine ähnliche tubuläre Färbung. Das Molekulargewicht der dEZM-Banden war jedoch geringer. C2C12-Zellen kolonisierten und vermehrten sich in den dEZMs und fusionierten zu mehrkernigen Myotuben.
Diese exprimierten myosin-schwerkettige Proteine nach viertägiger Inkubation in Differenzierungsmedium. Intrazelluläre und perizelluläre Färbungen wurden für Laminin-alpha-Zweiketten, Gesamtlaminine und Fibronektin beobachtet. Dezellularisierte fetale Mausskelettgerüste können verwendet werden, um Zellen in Kokultursystemen zu züchten, was sie näher an die In-vivo-Situation bringt und somit zum Verständnis von Muskelerkrankungen beiträgt.
