Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) und dem Bronson Foundation Award (H.Z.) der University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) unterstützt.

1. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie die Saatgutsterilisationslösung vor, indem Sie 15 ml Bleichmittel mit 35 ml destilliertem Wasser und 50 μl Triton X-100 mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie Brefeldin A (BFA)-Lösung vor, indem Sie das BFA-Pulver in Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 10 mM (Stamm) auflösen. Bereiten Sie die Wortmannin (Wm)-Lösung vor, indem Sie das Wm-Pulver in DMSO auf eine Endkonzentration von 10 mM (Stamm) auflösen.</li>
</ol>2. Aussaat der Samen
<ol><li>Aliquotieren Sie 10-50 Samen von jeder der erforderlichen transgenen Pflanzen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 1 ml Saatgutsterilisationslösung in jedes Röhrchen und mischen Sie es gründlich, indem Sie das Röhrchen 10 Minuten lang vorsichtig auf einem Schüttler umdrehen.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Samensterilisationslösung und waschen Sie die Samen fünfmal mit 1 ml autoklaviertem destilliertem Wasser.</li>
	<li>Geben Sie 300 μl autoklaviertes destilliertes Wasser in jedes Röhrchen und säen Sie die Samen auf halbstarken MS-Medien mit 1 % (w/v) Saccharose und 0,75 % (w/v) Agar. Ergänzen Sie das Medium bei Bedarf mit den entsprechenden Antibiotika.</li>
	<li>Bewahren Sie die Platte 2 Tage lang kopfüber bei 4 °C im Dunkeln auf, um die Keimung zu synchronisieren.</li>
	<li>Nach 2 Tagen wird die Platte in einen Wachstumsraum mit einem 16 h Licht/8 h Dunkelzyklus (80 μmol/m2/s1) bei 22 °C überführt. Dies gilt als der erste Tag nach der Keimung (1 dpg).</li>
	<li>Verpflanze die Sämlinge mit 10 dpg in die Erde, um weiter wachsen zu können.</li>
</ol>3. Herstellung von zweifarbigen transgenen F1-Pflanzen
<ol><li>In einem Wachstumsraum mit einem Zyklus von 16 h Licht / 8 h (80 μmol/m2/s1) bei 22 °C werden homozygote transgene Pflanzen, die ein RFP-markiertes Markerprotein RFP-Ara7 (Pflanze B)20 tragen, und homozygote transgene Pflanzen, die ein RFP-markiertes Markerprotein RFP-Ara7 (Pflanze B)20 tragen, bis zur Blüte nebeneinander gezüchtet.</li>
	<li>Wähle einen jungen Blütenstand von Pflanze A. Behalte eine Blüte, die sich gerade auf dem Blütenstand öffnet, für genetische Kreuzungen. Entferne alle älteren Blüten und Siliques. Entfernen Sie außerdem vorsichtig die jüngeren Blüten und Blütenmeristeme, um zukünftige Verwechslungen zu vermeiden.</li>
	<li>Zerlege die ungeöffnete Blüte vorsichtig, indem du die Kelchblätter, Blütenblätter und Staubblätter mit einer scharfen Pinzette entfernst. Lassen Sie den Stempel nur am Blütenstand.</li>
	<li>Nimm ein reifes Staubblatt von einer geöffneten Blüte auf Pflanze B und lege die Pollenkörner auf die Narbe des präparierten Stempels von Pflanze A.</li>
	<li>Beschriften Sie diese manuell gekreuzte Blume, indem Sie ihren Vater, ihre Mutter und das Datum der genetischen Kreuzung angeben. Lassen Sie die Blüte reifen und ernten Sie die F1-Samen, wenn die Kieselsäure gelb/braun wird (~20 Tage nach der Kreuzung). Prüfen Sie, ob es sich um eine erfolgreiche F1-Anlage handelt, die sowohl YFP- als auch RFP-Signale enthält.</li>
</ol>4. Pharmakologische Behandlung
<ol><li>Für die BFA-Behandlung werden die Keimblätter von 7 Tage alten Keimlingen entfernt, der Rest der Keimlinge entweder in eine Scheinlösung (0,3 % Ethanol) oder eine 30 μM BFA-Lösung getaucht, 1 Minute lang Vakuum angelegt und die Probe vor der Bildgebung 30 Minuten lang eingetaucht.</li>
	<li>Für die Wortmannin-Behandlung entfernen Sie die Keimblätter von 7 Tage alten Sämlingen, tauchen Sie den Rest der Keimlinge entweder in 0,25%ige DMSO-Lösung oder 25 mM Wortmannin, legen Sie 1 Minute lang Vakuum an und lassen Sie die Probe 30 Minuten lang eingetaucht, bevor Sie sie bebildern.</li>
	<li>Für die Vakuumbehandlung von Proben werden in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 500 μl der entsprechenden Arzneimittellösung hinzugefügt und die präparierten Keimlinge in die Lösung getaucht. Befestigen Sie eine 10-ml-Spritze fest am Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie 1 Minute lang Vakuum an (Abbildung 1). Entfernen Sie die Spritze und bewahren Sie die Probe für die erforderliche Zeit in der Lösung auf. Nimm die Sämlinge vorsichtig heraus, um sie bildgebend vorzubereiten.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig01.jpg"> Abbildung 1: Einfaches Vakuumgerät. Für die Vakuumbehandlung wird eine 10-ml-Spritze an ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen angeschlossen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
5. Probenvorbereitung für die Bildgebung
<ol><li>Sezieren Sie das echte Blatt der behandelten Probe mit einer scharfen Rasierklinge. Lege das echte Blatt vorsichtig in einen Wassertropfen auf einen Objektträger und halte die abaxiale Seite nach oben. Decken Sie das echte Blatt langsam mit einem Deckglas ab und vermeiden Sie es, Blasen einzufangen.</li>
</ol>6. Konfokale Bildgebung
HINWEIS: In dieser Arbeit wurde ein inverses konfokales Scanning-Mikroskop Leica SP8 verwendet, um das Fluoreszenzsignal der Proben abzubilden.
<ol><li>Einrichtung des Strahlwegs<ol><li>Wählen Sie einen 514-nm-Laser für die YFP-Anregung. Verwenden Sie eine hohe Laserleistung, um die Signalintensität zu erhöhen und so eine hohe Bildqualität zu erzielen. Bei Laserleistungen über 5 % besteht jedoch die Gefahr eines Photobleichens, und die Gesundheit der Probe kann beeinträchtigt werden. Wenn das Probensignal nicht zu schwach ist, beginnen Sie mit niedriger Laserintensität.</li>
		<li>Schalten Sie PMT/HyD für die Detektion ein und definieren Sie die oberen und unteren Emissionsbandschwellen basierend auf dem Spektrum für den YFP-Fluorophor. Stellen Sie ein Detektionsfenster von 530-570 nm ein, um das YFP-Signal zu erfassen.</li>
		<li>Sequenzielle Bildgebung für die zweite Farbe: Klicken Sie auf die Schaltfläche Seq und fügen Sie einen neuen Kanal hinzu. Standardmäßig ist der zuvor entworfene YFP-Strahlengang Seq 1. Wählen Sie in Seq 2 einen 561-nm-Laser für die RFP-Anregung aus und stellen Sie ein Detektionsfenster von 570-630 nm ein, um das RFP-Signal zu erfassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Einrichten der Scanbedingungen (Abbildung 2)<ol><li>Um die Aktivität des subzellulären Membranverkehrs in den Stomata-Vorläuferzellen abzubilden, wählen Sie eine 63x/1,2-W-Corr-Linse auf dem System für die Bildgebung.</li>
		<li>Das Format bezieht sich auf die Bildgröße in Pixeln. Beginnen Sie mit 1.024 x 1.024 Pixeln und optimieren Sie diese dann anhand des Zoomfaktors und der Objektiveinstellungen für eine gute Auflösung der Publikationsqualität.</li>
		<li>Die Geschwindigkeit bezieht sich auf die Geschwindigkeit des Scankopfes, wenn der Laser über jedes Pixel fährt. Obwohl langsame Scangeschwindigkeiten oft zu einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis führen, können sie die sich schnell ändernden Membranverkehrsereignisse möglicherweise nicht effizient erfassen. Beginnen Sie mit einer Geschwindigkeit von 400 Hz und optimieren Sie diese basierend auf der spezifischen Situation der Proben.</li>
		<li>Der Zoomfaktor wird verwendet, um einen Interessenbereich zu vergrößern, ohne das Objektiv zu wechseln. Beginnen Sie mit einem Zoomfaktor von 1 und optimieren Sie diesen basierend auf den spezifischen Anforderungen des Experiments.</li>
		<li>Der Zeilendurchschnitt bezieht sich darauf, wie oft jede X-Linie gescannt wird, um ein durchschnittliches Ergebnis zu erhalten. Ein größerer Linienmittelwert reduziert das Rauschen im resultierenden Bild, erhöht aber auch die Scanzeit und die Belichtungszeit für das Laserlicht. Verwenden Sie zum Abbilden von Membrantransportereignissen keinen hohen Liniendurchschnitt. Beginnen Sie mit einem 2-fachen Liniendurchschnitt und optimieren Sie nach Bedarf.</li>
	</ol></li>
	<li>Erfassen einer Zeitreihe HINWEIS: Bei der Untersuchung von Membrantransportereignissen wird häufig eine Zeitreihe benötigt, um die schnelle Bewegung der subzellulären Endosomen aufzuzeichnen.<ol><li>Wählen Sie im Erfassungsmodus den xyt-Scanmodus aus, um das Zeitreihendienstprogramm zu aktivieren.</li>
		<li>Legen Sie unter Zeitintervall eine Wartezeit zwischen den Zeitpunkten fest. Alternativ können Sie auch auf Minimieren klicken, um die Bilder sofort nacheinander aufzunehmen. Im folgenden Zeitreihenexperiment wurde ein Zeitintervall von 7 s verwendet.</li>
		<li>Wählen Sie Dauer aus, und geben Sie die Gesamtzeit für die Ausführung des Experiments ein. Alternativ können Sie die Anzahl der zu erfassenden Frames definieren, indem Sie Frames auswählen (Abbildung 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Um die dreidimensionalen Informationen über das Membrantransportereignis innerhalb der gesamten Zelle zu sammeln, verwenden Sie den Z-Stapel-Scan-Modus. Für die Analyse wird häufig die Projektion mit maximaler Intensität der Z-Stapelbilder verwendet.<ol><li>Wählen Sie den xyz-Scanmodus im Erfassungsmodus aus, und dann wird auf das Dienstprogramm Z-Stapel zugegriffen.</li>
		<li>Wählen Sie die Option Z-breit aus. Definieren Sie im Scan-Modus das obere und das untere Bild des Z-Stapels mit den Schaltflächen " Anfang " und " Ende" .</li>
		<li>Definieren Sie die Dicke des z-Schritts, indem Sie auf z-Schrittgröße klicken. Alternativ können Sie festlegen, wie viele Bilder aufgenommen werden sollen, um den gesamten Bereich des Z-Stapels abzudecken. Um die Konsistenz zwischen den Proben sicherzustellen, definieren Sie die z-Schrittweite (Abbildung 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Bildverarbeitung<ol><li>Die maximale Intensitätsprojektion der Z-Stack-Bilder wird von der konfokalen Software (http://www.leica-microsystems.com) erzeugt. Wählen Sie auf der primären Registerkarte "Prozess " zunächst die gewünschte Z-Stack-Datei unter der Registerkarte " Projekte öffnen" ganz links aus. Wechseln Sie dann zur mittleren Registerkarte mit dem Namen Prozesswerkzeuge, wählen Sie die Projektionsfunktion , wählen Sie Maximum im Dropdown-Bereich von Methode und klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden . Ein Z-Stapel-Projektionsbild wird auf der Registerkarte "Projekte öffnen" generiert.</li>
		<li>Das Video der Zeitreihenbilder stammt von Fidschi (https://imagej.net/Fiji). Verwenden Sie auf der Registerkarte Datei die Funktion Öffnen , um alle Zeitreihenbilder in der richtigen Reihenfolge zu öffnen. Suchen Sie auf der Registerkarte Bild die Funktion Stapeln , und wählen Sie Zu stapelnde Bilder aus , um ein Video zu generieren. Speichern Sie die Datei im .avi-Format mit der gewünschten Bildrate (5 Bilder/s für Video 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig02.jpg"> Abbildung 2: Der Scan-Modus-Bereich der XY-Bemaßung. Das Bedienfeld "Scanmodus" wird verwendet, um die Bedingungen für das Scannen von Bildern einzurichten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig03.jpg"> Abbildung 3: Das Zeitreihendienstprogramm im xyt-Scan-Modus. Das Zeitreihendienstprogramm wird verwendet, um die Bildverarbeitungsbedingungen einzurichten, um eine Reihe von Bildern nacheinander zu erfassen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig04.jpg"> Abbildung 4: Das Z-Stack-Dienstprogramm im xyz-Scan-Modus. Das Z-Stapel-Dienstprogramm wird verwendet, um die Bildgebungsbedingungen einzurichten, um eine Reihe von Bildern auf der Z-Achse zu erfassen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Raum-zeitliche Untersuchung der ERL1-Dynamik mittels konfokaler Bildgebung

<ol>
	<li>Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+endomembrane+trafficking+in+plants.">Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants.</a> Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).</li><li>Sigismund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+and+signaling:+Cell+logistics+shape+the+eukaryotic+cell+plan.">Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan.</a> Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).</li><li>Lyu, Z., Genereux, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+measuring+protein+trafficking+across+cellular+membranes.">Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes.</a> ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).</li><li>Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+roads:+Chemical+tools+and+cell+biology+to+study+unconventional+protein+secretion.">Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion.</a> Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).</li><li>Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+wortmannin-induced+reorganization+of+the+trans-Golgi+network+the+key+to+explain+charasome+formation.">Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).</li><li>Qi, X., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+and+environmental+signals+guiding+stomatal+development.">Hormonal and environmental signals guiding stomatal development.</a> BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).</li><li>Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+lineage+control+by+developmental+program+and+environmental+cues.">Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).</li><li>Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid-induced+stomatal+closure:+An+important+component+of+plant+defense+against+abiotic+and+biotic+stress.">Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).</li><li>Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , (2021).</li><li>Yang, M., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+too+many+mouths+and+four+lips+mutations+affect+stomatal+production+in+Arabidopsis.">The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).</li><li>Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+peptide+gene+EPF1+enforces+the+stomatal+one-cell-spacing+rule.">The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule.</a> Genes &amp; Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).</li><li>Hara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cell+density+is+autoregulated+via+a+secretory+peptide,+EPIDERMAL+PATTERNING+FACTOR+2+in+Arabidopsis+leaves.">Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).</li><li>Hunt, L., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signaling+peptide+EPF2+controls+asymmetric+cell+divisions+during+stomatal+development.">The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development.</a> Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).</li><li>Sugano, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis.">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li><li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule.">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li><li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signalling+peptide+EPFL9+is+a+positive+regulator+of+stomatal+development.">The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development.</a> New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).</li><li>Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+patterning+and+differentiation+by+synergistic+interactions+of+receptor+kinases.">Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.</a> Science. 309 (5732), 290-293 (2005).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor-like+protein+acts+as+a+specificity+switch+for+the+regulation+of+stomatal+development.">A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development.</a> Genes &amp; Development. 31 (9), 927-938 (2017).</li><li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning.">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes &amp; Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+manifold+actions+of+signaling+peptides+on+subcellular+dynamics+of+a+receptor+specify+stomatal+cell+fate.">The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate.</a> Elife. 9, e58097 (2020).</li><li>MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+control+of+asymmetric+cell+divisions+that+establish+the+stomatal+lineage.">Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage.</a> Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).</li><li>Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Termination+of+asymmetric+cell+division+and+differentiation+of+stomata.">Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata.</a> Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).</li><li>Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+FAMA+controls+the+final+proliferation/differentiation+switch+during+stomatal+development.">Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development.</a> Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).</li><li>Kanaoka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCREAM/ICE1+and+SCREAM2+specify+three+cell-state+transitional+steps+leading+to+Arabidopsis+stomatal+differentiation.">SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation.</a> Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase.">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).</li><li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis.">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).</li><li>Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulators+of+stomatal+lineage+signal+transduction+alter+membrane+contact+sites+and+reveal+specialization+among+ERECTA+kinases.">Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases.</a> Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).</li><li>Le, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+transport+and+activity+regulate+stomatal+patterning+and+development.">Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development.</a> Nature Communications. 5, 3090 (2014).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GNOM+ARF-GEF+mediates+endosomal+recycling,+auxin+transport,+and+auxin-dependent+plant+growth.">The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth.</a> Cell. 112 (2), 219-230 (2003).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+stomatal+differentiation+potential+by+EPF1+and+ERECTA-LIKE1+ligand-receptor+signaling.">Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling.</a> Elife. 6, 24102 (2017).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+super-resolution+imaging+techniques.">Label-free super-resolution imaging techniques.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy:+Present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), (2019).</li><li>Nwaneshiudu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+confocal+microscopy.">Introduction to confocal microscopy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Das Endomembransystem trennt das Zytoplasma einer eukaryotischen Zelle in verschiedene Kompartimente, was die spezialisierte biologische Funktion dieser Organellen ermöglicht. Um Frachtproteine und Makromoleküle zum richtigen Zeitpunkt an ihren endgültigen Bestimmungsort zu bringen, werden zahlreiche Vesikel zwischen diesen Organellen hin- und hergeleitet. Hochregulierte Membrantransportereignisse spielen eine grundlegende Rolle für die Lebensfähigkeit, Entwicklung und das Wachstum von Zellen. Der Mechanismus, der d...

Der Membrantransport ist ein konservierter zellulärer Prozess, der Membrankomponenten (auch bekannt als Frachten), einschließlich Proteine, Lipide und andere biologische Produkte, zwischen verschiedenen Organellen innerhalb einer eukaryotischen Zelle oder über die Plasmamembran zum und vom extrazellulären Raum verteilt1. Dieser Prozess wird durch eine Ansammlung von Membranen und Organellen erleichtert, die als Endomembransystem bezeichnet werden und aus der Kernmembran, dem endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Apparat, den Vakuolen/Lysosomen, der Plasmamembran und mehreren Endosomen bestehen1. Das Endomembransystem ermöglicht die Modifikation, Verpackung und den Transport von Membrankomponenten mithilfe dynamischer Vesikel, die zwischen diesen Organellen pendeln. Membrantransportereignisse sind entscheidend für die Zellentwicklung, das Wachstum und die Anpassung an die Umwelt und unterliegen daher einer strengen und komplexen Regulierung2. Derzeit wurden mehrere Ansätze in der Molekularbiologie, der chemischen Biologie, der Mikroskopie und der Massenspektrometrie entwickelt und auf das Gebiet des Membrantransports angewendet und haben das Verständnis der raumzeitlichen Regulation des Endomembransystems erheblich vorangebracht 3,4. Die Molekularbiologie wird für klassische genetische Manipulationen der mutmaßlichen Akteure verwendet, die am Membrantransport beteiligt sind, wie z. B. die Veränderung der Genexpression des interessierenden Proteins oder die Markierung des interessierenden Proteins mit bestimmten Markierungen. Zu den Werkzeugen in der chemischen Biologie gehört die Verwendung von Molekülen, die spezifisch in den Verkehr bestimmter Routen eingreifen 4,5. Die Massenspektrometrie ist leistungsfähig für die Identifizierung der Komponenten in einer Organelle, die durch biochemische Ansätze mechanisch isoliert wurde 3,4. Der Membranverkehr ist jedoch ein dynamischer, vielfältiger und komplexer biologischer Prozess1. Um den Prozess des Membrantransports in lebenden Zellen unter verschiedenen Bedingungen sichtbar zu machen, ist die Lichtmikroskopie ein wesentliches Werkzeug. Kontinuierliche Fortschritte wurden bei fortschrittlichen Mikroskoptechniken erzielt, um die Herausforderungen bei der Messung der Effizienz, Kinetik und Vielfalt der Ereignisse zu bewältigen4. Hier konzentriert sich diese Studie auf die weit verbreiteten Methoden in der chemischen/pharmakologischen Biologie, Molekularbiologie und Mikroskopie, um Membrantransportereignisse in einem natürlich vereinfachten und experimentell zugänglichen System, dem stomatären Entwicklungsprozess, zu untersuchen.
Spaltöffnungen sind Mikroporen auf pflanzlichen Luftoberflächen, die sich öffnen und schließen, um den Gasaustausch zwischen den inneren Zellen und der Umgebung zu erleichtern 6,7,8. Daher sind Spaltöffnungen essentiell für die Photosynthese und Transpiration, zwei Ereignisse, die für das Überleben und Wachstum von Pflanzen entscheidend sind. Die Stomaentwicklung wird dynamisch durch Umwelteinflüsse angepasst, um die Anpassung der Pflanze an die Umgebung zu optimieren9. Die Identifizierung des Rezeptorproteins Too Many Mouths (TMM) aus dem Jahr 2002 eröffnete eine neue Ära der Erforschung der molekularen Mechanismen der Stomataentwicklung in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana10. Bereits nach wenigen Jahrzehnten wurde ein klassischer Signalweg identifiziert. Von Upstream zu Downstream umfasst dieser Signalweg eine Gruppe von sekretorischen Peptidliganden aus der Familie der epidermalen Musterungsfaktoren (EFP), mehrere Zelloberflächen-Leucin-Rich-Repeat (LRR)-Rezeptorkinasen in der EREECTA (ER)-Familie, das LRR-Rezeptorprotein TMM, eine MAPK-Kaskade und mehrere bHLH-Transkriptionsfaktoren, darunter SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA und SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Frühere Arbeiten deuten darauf hin, dass eine der Rezeptorkinasen, ER-LIKE 1 (ERL1), aktives subzelluläres Verhalten bei EPF-Wahrnehmung zeigt20. ERL2 transportiert auch dynamisch zwischen der Plasmamembran und einigen intrazellulären Organellen27. Die Blockierung der Membrantransportschritte führt zu einer abnormen Stomatamusterbildung, die zu Stomataclustern auf der Blattoberflächeführt 28. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Membranverkehr eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung der Spaltöffnungen spielt. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur räumlichen und zeitlichen Untersuchung der ERL1-Dynamik mittels Protein-Protein-Subzellulär-Kolokalisationsanalyse in Kombination mit pharmakologischer Behandlung mit einigen Membrantransportinhibitoren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309695</td>
			<td>Vacuum samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A (BFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td>membrane trafficking drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Lecia SP8 TCS with LAS-X software package</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-402</td>
			<td>Genetic cross</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS AF software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>http://www.leica-microsystems.com</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic seeds of ERL1-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic seeds of RFP-Ara7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin (Wm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td>membrane trafficking drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based methods to study membrane trafficking events in stomatal lineage cells

In eukaryotischen Zellen werden Membrankomponenten, darunter Proteine und Lipide, innerhalb des Endomembransystems räumlich und zeitlich an ihren Bestimmungsort transportiert. Dazu gehören der sekretorische Transport von neu synthetisierten Proteinen an die Zelloberfläche oder die Außenseite der Zelle, der endozytäre Transport von extrazellulären Ladungen oder Plasmamembrankomponenten in die Zelle und das Recycling oder der Shuttletransport von Ladungen zwischen den subzellulären Organellen usw. Membrantransportereignisse sind entscheidend für die Entwicklung, das Wachstum und die Anpassung an die Umwelt aller eukaryotischen Zellen und unterliegen daher einer strengen Regulierung. Zelloberflächenrezeptorkinasen, die Ligandensignale aus dem extrazellulären Raum wahrnehmen, durchlaufen sowohl sekretorischen als auch endozytären Transport. Häufig verwendete Ansätze zur Untersuchung der Membrantransportereignisse unter Verwendung einer Plasmamembran-lokalisierten Leucin-Rich-Repeat-Rezeptorkinase, ERL1, werden hier beschrieben. Zu den Ansätzen gehören die Vorbereitung des Pflanzenmaterials, die pharmakologische Behandlung und die konfokale Bildgebung. Um die räumlich-zeitliche Regulation von ERL1 zu überwachen, beschreibt diese Arbeit die Kolokalisationsanalyse zwischen ERL1 und einem multivesikulären Körpermarkerprotein, RFP-Ara7, die Zeitreihenanalyse dieser beiden Proteine und die Z-Stapel-Analyse von ERL1-YFP, die mit den Membrantransportinhibitoren Brefeldin A und Wortmannin behandelt wurde.

Membrane traffic is a conserved cellular process that distributes membrane components (also known as cargoes), including proteins, lipids, and other biological products, between different organelles within a eukaryotic cell or across the plasma membrane to and from the extracellular space1. This process is facilitated by a collection of membranes and organelles named the endomembrane system, which consists of the nuclear membrane, the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the vacuole/lysosomes, the plasma membrane, and multiple endosomes1. The endomembrane system enables the modification, packaging, and transport of membrane components using dynamic vesicles that shuttle between these organelles. Membrane trafficking events are crucial to cell development, growth, and environmental adaptation and, thus, are under stringent and complex regulation2. Currently, multiple approaches in molecular biology, chemical biology, microscopy, and mass spectrometry have been developed and applied to the field of membrane trafficking and have greatly advanced the understanding of the spatiotemporal regulation of the endomembrane system3,4. Molecular biology is used for classical genetic manipulations of the putative players involved in membrane trafficking, such as altering the gene expression of the protein of interest or labeling the protein of interest with certain tags. Tools in chemical biology include the usage of molecules that specifically interfere with the traffic of certain routes4,5. Mass spectrometry is powerful for identifying the components in an organelle that has been mechanically isolated by biochemical approaches3,4. However, membrane traffic is a dynamic, diverse, and complex biological process1. To visualize the membrane trafficking process in live cells under various conditions, light microscopy is an essential tool. Continuous progress has been made in advanced microscope techniques to overcome the challenges in measuring the efficiency, kinetics, and diversity of the events4. Here, this study focuses on the widely adopted methodologies in chemical/pharmacological biology, molecular biology, and microscopy to study membrane trafficking events in a naturally simplified and experimentally accessible system, the stomatal developmental process.
Stomata are micropores on plant aerial surfaces that open and close to facilitate gas exchange between the inner cells and the environment6,7,8. Hence, stomata are essential for photosynthesis and transpiration, two events that are crucial for plant survival and growth. Stomatal development is dynamically adjusted by environmental cues to optimize the plant&#39;s adaptation to the surroundings9. Dating back to studies in 2002, the identification of the receptor protein Too Many Mouths (TMM) opened the door to a new era of investigating the molecular mechanisms of stomatal development in the model plant Arabidopsis thaliana10. After just a few decades, a classical signaling pathway has been identified. From upstream to downstream, this pathway includes a group of secretory peptide ligands in the epidermal patterning factors (EFP) family, several cell-surface leucine-rich-repeat (LRR) receptor kinases in the EREECTA (ER) family, the LRR receptor protein TMM, a MAPK cascade, and several bHLH transcription factors including SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, and SCREAM (SCRM)11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Previous work indicates that one of the receptor kinases, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstrates active subcellular behaviors upon EPF perception20. ERL2 also dynamically traffics between the plasma membrane and some intracellular organelles27. Blocking the membrane trafficking steps causes abnormal stomatal patterning, resulting in stomatal clusters on the leaf surface28. These results suggest that membrane traffic plays an essential role in stomatal development. This study describes a protocol to spatiotemporally investigate the ERL1 dynamics using protein-protein subcellular co-localization analysis combined with pharmacological treatment using some membrane trafficking inhibitors.

Autor im Rampenlicht: Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in Zellen der Stomata-Linie  

Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in stomatalen Zellen

This technique studies the membrane trafficking events in stomatal development, the micropores on plant aerial surface, to facilitate photosynthesis and the transpiration. Various techniques are used to study plant stomatal development. This includes molecular biology, cell biology or microscopy, chemical biology, mass spectrometry, biochemistry, and structural biology.Individual stomata form asynchronously. Each stoma is formed by three transcend cell fate transitions. So collecting enough stomata lineage cells at a particular cell fate is one of the big challenges.Membrane trafficking is essential for cell survival and growth. Stomata lineage cell is no exception. This protocol addresses the commonly used approach to study membrane trafficking events in stomata lineage cells.Plants face challenging environment in the face of climate change. Stomata are passages for plant gas exchange, and are highly flexible to environmental stress for adaptation. We are interested in studying how abiotic stress affects the stomata development by focusing on the membrane trafficking of certain proteins in stomata lineage cells.

Eine frühere Studie deutete darauf hin, dass ERL1 eine aktive Rezeptorkinase ist, die dynamische Membrantransportereignisse durchläuft20. ERL1 ist eine Transmembran-LRR-Rezeptorkinase auf der Plasmamembran. Neu synthetisiertes ERL1 im endoplasmatischen Retikulum wird in den Golgi-Körpern prozessiert und weiter zur Plasmamembran transportiert. Die ERL1-Moleküle auf der Plasmamembran können EPF-Liganden mit Hilfe ihrer extrazellulären LRR-Domäne18 wahrnehmen. Nach der ...

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Hier werden mehrere häufig verwendete Methoden vorgestellt, um die Membrantransportereignisse einer Plasmamembranrezeptorkinase zu untersuchen. Dieses Manuskript beschreibt detaillierte Protokolle, einschließlich der Vorbereitung des Pflanzenmaterials, der pharmakologischen Behandlung und der konfokalen Bildgebung.

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Diese Technik untersucht die Membrantransportereignisse in der Stomataentwicklung, die Mikroporen auf der Oberfläche der Pflanzenluft, um die Photosynthese und die Transpiration zu erleichtern. Es werden verschiedene Techniken verwendet, um die Entwicklung der Pflanzenstomaten zu untersuchen. Dazu gehören Molekularbiologie, Zellbiologie oder Mikroskopie, chemische Biologie, Massenspektrometrie, Biochemie und Strukturbiologie.Einzelne Spaltöffnungen bilden sich asynchron. Jedes Stoma wird durch drei transzendierende Zellschicksalsübergänge gebildet. Daher ist es eine der großen Herausforderungen, genügend Stomata-Stammzellen zu einem bestimmten Zellschicksal zu sammeln.Der Transport von Membranen ist für das Überleben und Wachstum von Zellen unerlässlich. Die Stomata-Abstammungszelle ist da keine Ausnahme. Dieses Protokoll befasst sich mit dem häufig verwendeten Ansatz zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in Stomata-Linienzellen.Pflanzen stehen angesichts des Klimawandels vor einer schwierigen Umwelt. Spaltöffnungen sind Durchgänge für den Austausch von Pflanzengasen und sind sehr flexibel gegenüber Umweltbelastungen zur Anpassung. Wir sind daran interessiert, zu untersuchen, wie sich abiotischer Stress auf die Entwicklung von Spaltöffnungen auswirkt, indem wir uns auf den Membrantransport bestimmter Proteine in Stomatazellen konzentrieren.

image-based-methods-to-study-membrane-trafficking-events-stomatal

Research

JoVE Journal

Biology

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

550 Aufrufe.  Rutgers University. Diese Technik untersucht die Membrantransportereignisse in der Stomataentwicklung, die Mikroporen auf der Oberfläche der Pflanzenluft, um die Photosynthese und die Transpiration zu erleichtern. Es werden verschiedene Techniken verwendet, um die Entwicklung der Pflanzenstomaten zu untersuchen. Dazu gehören Molekularbiologie, Zellbiologie oder Mikroskopie, chemische Biologie, Massenspektrometrie, Biochemie und Strukturbiologie.Einzelne Spaltöffnungen bilden sich asynchron. Jedes Stoma...

Serie: Autor im Rampenlicht: Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in Zellen der Stomata-Linie  

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Forschung

Biologie

﻿Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana  

To begin, grow homozygous transgenic Arabidopsis thaliana plants bearing ERL1-YFP and a red fluorescent protein, or RFP-labeled marker protein RFP ARA7 side-by-side in a growth room until flowering. On the young inflorescence of plant A, remove all the older flowers and calyx, except for one recently opened flower. Carefully remove the younger flowers and floral merostems.In the recently opened flower, remove the sepals, petals, and stamen using a pair of sharp tweezers, leaving only the pistil on the inflorescence. From plant B, take mature stamen from an opened flower and deposit the pollen grains into the stigma of the dissected pistil of plant A.Label this manually crossed flower, indicating its parents and the date of the genetic cross. When the calyx turns yellow or brown, harvest the F1 seeds to check for a successful F1 plant having yellow fluorescent protein, or YFP, and RFP signals.

Herstellung von zweifarbiger transgener F1-Arabidopsis thaliana

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana   

To begin the pharmacological analysis of dual-colored F1 Arabidopsis thaliana, dissect and remove the cotyledons of seven-day old transgenic seedlings. Add 500 microliters of a 30-micromolar Brefeldin A, or BFA solution, in a 1.5-milliliter micro-centrifuge tube. Immerse the dissected seedlings in it.Tightly attach a 10-milliliter syringe to the micro-centrifuge tube and apply a vacuum for one minute. Remove the syringe before incubating the sample in the solution for 30 minutes before imaging. Next, immerse the dissected seven-day old seedling into 25-millimolar wortmannin.Apply the vacuum for one minute before incubating the immersed sample for 30 minutes. Examining ERL-1 trafficking routes in transgenic plants showed that 30 minutes of exposure to Brefeldin A solution resulted in ERL-1-YFP detection in large compartments known as BFA bodies. It indicated that Brefeldin A could block ERL-1 trafficking suggesting recycling or endocytosis of ERL-1.When transgenics were treated with wortmannin for 30 minutes, ring-like structures called WM bodies were highlighted by ERL-1-YFP. It showed that ERL-1-YFP were transported to multivesicular bodies indicating that ERL-1 followed the route to vacuoles for degradation.

Pharmakologische Analyse der zweifarbigen transgenen F1-Arabidopsis thaliana

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana   

To begin the sample preparation, dissect the true leaf from the pharmacologically treated Arabidopsis thaliana transgenic sample using a sharp razor blade. Place the true leaf on a glass slide in a drop of water with the abaxial side up. Slowly cover the true leaf with a cover slip without air bubbles.For imaging, set up the beam path by selecting a 514-nanometer laser for yellow fluorescent protein, or YFP excitation. Obtain high image quality by using high laser power. Turn on PMT or HYD and define the upper and lower emission band thresholds based on the spectrum for the YFP fluorophore.Set a detection window of 530 to 570 nanometers to collect the YFP signal. for the sequential image of the second color, click on the seek button and add a new channel. In seek two, select a 555-nanometer laser for the red fluorescent protein, or RFP excitation, and set a detection window of 570 to 630 nanometers to collect the RFP signal.Select a 63X, 1.2W core lens on the system for imaging the subcellular membrane traffic activity within stomatal precursor cells. Start the format with an image size of 1024 by 1024 pixels, then optimize it based on the zoom factor and the objective settings for a good resolution. Next, set up the speed of the scan head, starting with a speed of 400 hertz, and optimize this based on the specific situation of the samples.To zoom on a region of interest without changing the objective lens, enter a zoom factor of one and optimize this based on the specific needs of the experiment. The line average refers to the number of times each X line will be scanned to obtain an average result. Start with a 2X line average For imaging the membrane trafficking events and optimize as needed.select the XYT scan mode in the acquisition mode to enable the time series utility. Next, select the waiting period between the time points under time interval. Define the number of frames to be collected by selecting frames.Use the Z-stack scan mode with the maximum intensity projection to collect the three-dimensional information regarding the membrane trafficking event within The entire cell. Then select the XYZ scan mode in acquisition mode and then the Z-stack utility will become accessible. Select the Z wide option.Under the scan mode, define the Z stack's top and bottom images using the begin and end buttons. Next, define the thickness of the Z step by clicking on the Z step size. To process the image, click on the primary process tab in Confocal software.Under the open projects tab on the far left side, select the interested Z-stack file. Then, in the middle tab named process tools, select the projection function. Choose maximum in the dropdown panel of method and click on the apply button.A Z-stack projection image will be generated under the open projects tab. To generate the video from the time series images, click the file tab in Fiji software and open function to open all the time series images one by one in the correct order. Alternatively, drag the images onto image J to open the data in the correct order.Then find the stack function in the image tab and choose images to stack to generate a video. Once done, save the file in the avi format with the desired frame rate. In the true leaf of seven-day-old transgenic plants bearing ERL1 promoter ERL1 YFP, scattered cells were highlighted by the YFP signal where ERL1 YFP labeled the plasma membrane.Multiple punctate signals were also observed, suggesting that ERL1 was also localized to the endosomes. RFP Ara7 highlighted multiple punctate signals in almost all the cells, indicating the multivesicular bodies, or MVBs, in these cells. When RFP Ara7 merged with the ERL1 YFP signal, most punctates overlapped, suggesting that some ERL1 YFP molecules were transported to the MVBs.Time series of true leaves bearing ERL1 YFP and MVB marker protein RFP Ara7 showed that YFP-labeled endosomes moved together with RFP Ara7 within the stomatal lineage cells. It confirmed that ERL1 YFP was localized to the multivesicular bodies.