Diese experimentelle Methode ermöglicht die Langzeitlagerung der wiederverwendbaren Einzelzellen für epigenomische Tests. Es ermöglicht auch die Analyse vieler epigenetischer Markierungen und Transkriptionsfaktoren in derselben einzelnen Zelle. Bei aktuellen Methoden zur Einzelzell-Epigenomanalyse können dieselben Einzelzellen nicht erneut analysiert werden.
Bei wiederverwendbaren Einzelzellen können jedoch dieselben Einzelzellen viele Male neu analysiert werden. Diese Technik ist nützlich für die Diagnose und das Design einer epigenetischen Therapie, insbesondere wenn die Anzahl der Patientenzellen begrenzt ist. Diese Methode eignet sich am besten für die Untersuchung des Epigenoms, der Regulation der Genexpression und anderer Systeme, solange spezifische Antikörper für epigenetische Markierungen verfügbar sind.
Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, empfehlen wir Ihnen, mit Proben zu üben, die nicht zu wertvoll sind, und das Experiment mithilfe einer flachen Sequenzierung wie MiSeq oder iSeq 100 zu validieren. Mischen Sie zunächst in einer sauberen Laminar-Flow-Haube einen Milliliter Zellsuspension und 199 Milliliter eines millimolaren EDTA-PBS, das einen Interkalatorfarbstoff für die DNA enthält. Übertragen Sie nach dem Mischen 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit flachem Boden.
Setzen Sie die Abdeckung auf die 96-Well-Platte und scannen Sie die Platte mit einem Rastermikroskop. Als nächstes kippen Sie die Platte und warten einige Minuten, bis die einzelne Zelle an den unteren Rand des Brunnens gesunken ist. Setzen Sie dann die Pipettenspitze auf die untere Ecke und übertragen Sie die einzelne Zelle und den Puffer in ein PCR-Röhrchen.
Überprüfen Sie die Vertiefung mit einem Fluoreszenzmikroskop, um die Übertragung zu bestätigen. Wenn sich noch eine einzelne Zelle in der Vertiefung befindet, fügen Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung eines millimolaren EDTA PBS hinzu, das einen Interkalatorfarbstoff für DNA enthält, und wiederholen Sie den Transfer. Legen Sie nach dem Transfer eine Abdeckung auf die 96-Well-PCR-Platte und zentrifugieren Sie die Platte mit einem Ausschwingrotor ohne Pause.
Entfernen Sie am nächsten Tag das Mineralöl durch Pipettieren und waschen Sie die Zellen fünfmal mit 200 Mikrolitern TP-Magnesium-Negativpuffer. Entfernen Sie nach dem letzten Waschgang den Überstand, fügen Sie 15 Mikroliter Glühpuffer hinzu und inkubieren Sie ihn eine Stunde lang auf Eis. Nach der Inkubation werden die PCR-Röhrchen auf einen Thermocycler gelegt und drei Minuten lang auf 94 Grad Celsius erhitzt.
Anschließend werden die Röhrchen auf einen eisgekühlten Metallblock übertragen und zwei Minuten lang inkubiert. Als nächstes fügen Sie vier Mikroliter Magnesiumsulfat-Natriumchlorid hinzu, DNTP mischen und mischen Sie durch Wirbeln bei maximaler Geschwindigkeit. Fügen Sie dann einen Mikroliter BST-Polymerase-Großfragment hinzu, mischen Sie es durch Vortexen und inkubieren Sie es vier Stunden lang auf einem Shaker.
Legen Sie das PCR-Röhrchen nach der Inkubation auf einen Thermocycler und führen Sie ein vierstündiges oder über Nacht durchgeführtes Programm durch, wie im Text beschrieben. Für die Antikörperbindung werden 1,625 Mikroliter Natriumchlorid-EDTA-BSA-Lösung in das Röhrchen gegeben. Mischen Sie durch Vortexen bei niedriger Geschwindigkeit und inkubieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang auf Eis.
Fügen Sie dann 0,1 Mikrogramm pro Milliliter Antikörper hinzu und kontrollieren Sie das mit der Antikörpersonde konjugierte IgG. Nachdem Sie die Antikörper hinzugefügt haben, inkubieren Sie die Röhrchen auf Eis unter leichtem Schütteln. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal mit 200 Mikrolitern TPM-T-Puffer auf Eis.
Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie ihn einmal mit T4-DNA-Ligase-Puffer. Als nächstes fügen Sie 19 Mikroliter Ligationsadapterlösung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius. Fügen Sie dann einen Mikroliter T4-DNA-Ligase hinzu und mischen Sie das Röhrchen durch Vortexen bei mittlerer Geschwindigkeit.
Legen Sie das Röhrchen auf einen Thermocycler und führen Sie das Proximity-Ligaturprogramm durch. Waschen Sie die Zellen nach dem Lauf zweimal mit 200 Mikrolitern BST-Magnesium-negativ-EDTA-positivem Puffer und lagern Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal mit 200 Mikrolitern BST-Magnesium-negativ-EDTA-Negativpuffer und fügen Sie 20 Mikroliter einer Mischung hinzu, die BST, DNTPs und Magnesiumsulfat enthält.
Anschließend mit einem Wirbelmischer mischen und das Röhrchen vier Stunden lang auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Legen Sie das Röhrchen nach der Inkubation auf einen Thermocycler und führen Sie das vollständige Verlängerungsprogramm aus, wie im Textmanuskript beschrieben. Als nächstes fügen Sie für die Mehrfachverdrängungsverstärkung 0,4 Mikroliter eines 100 Mikromolar zweiten zufälligen Primers hinzu und mischen Sie durch Vortexen.
Inkubieren Sie das Röhrchen dann zwei Stunden lang auf einem Orbitalschüttler, bevor Sie das Röhrchen auf einen Thermocycler legen, um es auf 94 Grad Celsius zu erhitzen. Legen Sie die Röhrchen nach drei Minuten in einen eisgekühlten Metallblock und fügen Sie einen Mikroliter BST-DNA-Polymerase hinzu. Wirbeln Sie die Rohre mit langsamer Geschwindigkeit.
Legen Sie dann die Röhrchen auf einen Thermocycler, um das Mehrfachverdrängungsverstärkungsprogramm auszuführen. Nach dem Programm ca. 20 Mikroliter Überstand in ein PCR-Röhrchen umfüllen und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Als nächstes geben Sie 20 Mikroliter 0,05%TWEEN 20 und 0,1X TE-Puffer in ein PCR-Röhrchen, das die wiederverwendbare Einzelzelle enthält, und inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius.
Sammeln Sie am nächsten Tag den Überstand und kombinieren Sie ihn mit dem zuvor gesammelten Überstand. Weichen Sie dann den wiederverwendbaren Einzelzell- und TBS-Puffer ein, der 50 % Glycerin, fünf millimolare EDTA, 0,5 % BSA und 0,05 % TWEEN 20 enthält, und inkubieren Sie ihn dann 30 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler. Lagern Sie die wiederverwendbare Einzelzelle nach der Inkubation bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius.
Zum Schluss fügen Sie 40 Mikroliter Exo-Negativ-Mastermix hinzu und legen Sie das Röhrchen auf einen Thermocycler, um das Programm wie im Textmanuskript beschrieben auszuführen. Mit diesem Protokoll wurden wiederverwendbare K562-Einzelzellen generiert. Einzelne Zellen wurden in die äußere Schicht des Polyacrylamid-Beads eingebettet und mit einem Interkalatorfarbstoff für die DNA-Färbung visualisiert.
DNA-Produkte vor und nach dem BciVI-Verdau sind hier dargestellt. Der Restriktionsenzymverdau erzeugte die erwarteten 19 bis 20, 31 bis 32, 49 und mehr als 49 Basenpaarfragmente. Des Weiteren wurde die konstruierte DNA-Bibliothek mittels Kapillarelektrophorese auf die gewünschten Produkte analysiert.
Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass die eindeutig kartierten Reads von Anti-Histon H3 acetyliertem Lysin 27 und Anti-Histon H3 trimethyliertem Lysin 27 signifikant zahlreicher waren als von der Kontroll-IgG. Die REpi-Sequenzierungssignale wurden durch den Vergleich von REpi-Sequenzierungsdaten mit ChIP-Sequenzierungsdaten ausgewertet. Im Durchschnitt überlappten etwa 91 % der Histon-H3-acetylierten Lysin-27-Signale aus der REpi-Sequenzierung die Peaks von Histon-H-3-acetyliertem Lysin 27 in der Bulk-ChIP-Sequenzierung.
Die Präzision der REpi-Sequenzierung für die inaktive Histonmarkierung, Histon H3 trimethyliertes Lysin 27, betrug 52%Die Sensitivität der REpi-Sequenzierung wurde analysiert, um zu messen, wie viele Peaks der Bulk-ChIP-Sequenzierung durch REpi-Sequenzierung deproduziert wurden. Die Sensitivität der REpi-Sequenzierung betrug 55,30 % in Histon-H3-acetyliertem Lysin 27 und 50,94 % in Histon-H3-trimethyliertem Lysin 27. Bitte stellen Sie sicher, dass Sie DNS-freie Reagenzien verwenden.
Außerdem sollten alle Vorgänge, bei denen die Öffnungsröhrchen- oder Reagenzleitungen beteiligt sind, in einer sauberen Haube durchgeführt werden. DNA-Produkte dieses Verfahrens werden sequenziert und dann auf das Genom kartiert, um zu zeigen, welche Histonmodifikationen in welchen Regionen des Genoms in einzelnen Zellen vorhanden sind. Diese Technologie ermöglichte es, mehrere epigenetische Markierungen in derselben einzelnen Zelle zu analysieren, und ebnete den Weg für die Multiomics-Analyse in jeder einzelnen Zelle.
