Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82270352), dem Beijing Research Ward Construction Clinical Research Project (2022-YJXBF-04-03), der National High Level Hospital Clinical Research Funding (2022-NHLHCRF-YSPY-01), Capital's Founds for Health Improvement and Research (Nr. 2022-1-4062), dem National Key Clinical Specialty Discipline Construction Program (Grant No. 2020-QTL-009) und der Stiftung der Chinese Society of Cardiology (Nr. CSCF2021B02).

Alle Versuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Universität Peking genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden 8-12 Wochen alte männliche C57-Mäuse verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Vorbereitung der Tiere
<ol><li>Entfernen Sie die Haare aus dem präkordialen Bereich mit einer Haarentfernungscreme (siehe Materialtabelle). Fahren Sie dann mit der Aufnahme der Ultraschallbilder fort, indem Sie Schritt 2 befolgen.</li>
</ol>2. Ultraschallbildgebung vor der IR-Operation
<ol><li>Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in die Isofluran-Induktionskammer legen (siehe Materialtabelle) und initiieren Sie die Isofluranabgabe in einer Konzentration von 1,5 % mit einem Durchfluss von 1,5-2,0 l/min O2 .</li>
	<li>Positionieren Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage auf der physiologischen Überwachungsplattform (Bildgebungsplattform des Ultraschallsystems, siehe Materialtabelle). Tragen Sie eine kleine Menge leitfähiges Gel auf das Kupferblech des physiologischen Überwachungstisches auf und befestigen Sie die Mauspfoten mit niedrigem Klebeband, um physiologische Informationen über EKG und Atmung zu erhalten. Halten Sie die Körpertemperatur mit der eingebauten Wärmeplattform auf 37-38 °C. HINWEIS: Schalten Sie den Steuerschalter des Gasanästhesiegeräts von der Kammer auf die Maske und halten Sie die Anästhesiedosis während dieser Zeit konstant bei 1,5%. Die Herzfrequenz der Mäuse sollte zu diesem Zeitpunkt etwa 350-450 Schläge/min betragen.</li>
	<li>Tragen Sie vor der Bildgebung ophthalmic vet Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.</li>
	<li>Die transthorakale Echokardiographie ist mit einer linearen 40-MHz-Sonde9 (z. B. MS550-Sonde für Mäuse) durchzuführen (Abbildung 1A). HINWEIS: Das Ultraschallgerät ist mit der Sonde MS550 ausgestattet.</li>
	<li>Tragen Sie das Ultraschall-Transmissionsgel großzügig auf (siehe Materialtabelle), um eine optimale Bildqualität zu gewährleisten.</li>
	<li>Passen Sie die Position der Sonde und der Plattform an, um eine modifizierte parasternale Langachse (PLAX) Ansicht9 (Abbildung 1A) zu bilden, um die linke anteriore absteigende Arterie (LAD) im B-Modus zu untersuchen. Stellen Sie sich kurz das Herz mit einer parasternalen Längsachsenansicht vor, bei der die Plattform seitlich ausgerichtet und in einem kleinen Winkel zwischen Sonde und Plattform positioniert ist.</li>
	<li>Suchen Sie das passende Herzteil im B-Modus und aktivieren Sie den Farbdoppler auf dem Touchscreen (Abbildung 1B). Der LAD (weißer Pfeil) ist innerhalb der linken Ventrikelwand zu erkennen (Abbildung 1B). Die rote Echtzeitfarbe zeigt die Richtung des Blutflusses an (d. h. der Blutfluss erfolgt in Richtung der Sonde). HINWEIS: Durch die Anpassung der x-Achse ermöglicht der Farbdoppler die Visualisierung der gesamten LAD (vom Aortensinus bis zur distalen Aststelle) innerhalb dieses Bildfensters.</li>
	<li>Bewegen Sie die Sonde leicht, um die richtige Position zu finden und den Einfluss des Lungenvenenblutflusses zu verringern. HINWEIS: Um den Einfluss des Blutflusses der Lungenvene zu verringern, stellen Sie die Sonde leicht ein und unterscheiden Sie die LAD von der Lungenvene. Die LAD verläuft in der linken Ventrikelwand, während die Lungenvene in den linken Vorhof abfließt. Suchen Sie den LAD mit dem Farbdoppler und verwenden Sie den B-Modus, um den geeigneten Abschnitt auszuwählen.</li>
	<li>Nachdem Sie den LAD im Farbdoppler-Modus visualisiert haben, drücken Sie die Pulswellen-Taste (PW) und wechseln Sie in den PW-Modus. Positionieren Sie die gelbe Indikatorlinie auf der Koronararterie und stellen Sie sicher, dass sie parallel zur Flussrichtung verläuft. Drücken Sie dann die Schaltfläche Clip speichern , um die Basisdaten aufzuzeichnen.</li>
	<li>Erhöhen Sie die Isoflurankonzentration auf 3% und warten Sie 30 s. Stellen Sie sicher, dass die Strömungsgeschwindigkeit mit der Zeit allmählich zunimmt. Drücken Sie die Schaltfläche Clip speichern häufig, um die höchste Blutflussgeschwindigkeit zu erfassen. HINWEIS: Der Isofluran-Stimulus bewirkt, dass das Herz härter arbeitet, was zu einer möglichen Bewegung des Herzens und des LAD führt. Sobald das Bild im PW-Modus aufgenommen oder im Kino gespeichert wurde, klicken Sie auf den PW-Modus , um sicherzustellen, dass sich die gelbe Anzeigelinie auf dem KOP befindet. Wenn eine Verschiebung auftritt, stellen Sie die gelbe Indikatorlinie leicht auf den Punkt des Blutflusses ein und setzen Sie die Aufzeichnung fort. Dieser Prozess erfordert eine schnelle Beherrschung und Umschaltung.</li>
	<li>Schalten Sie nach dem Sammeln von Bildern des koronaren Blutflusses das Anästhetikum aus und stellen Sie die Sonde auf die normale PLAX-Ansicht ein. Warten Sie, bis die Herzfrequenz der Maus langsam auf etwa 500 Schläge pro Minute ansteigt, und messen Sie dann die Herzfunktion der Maus, indem Sie die Sonde auf den parasternalen Kurzachsenabschnitt (PSAX) umschalten.</li>
	<li>Nach Abschluss der echokardiographischen Bildgebung nehmen Sie das Tier von der Plattform und lassen Sie es sich in seinem Käfig erholen. Entfernen Sie das Gel und lassen Sie das Tier trocknen, um eine Unterkühlung zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie die Funktionswerkzeuge Peak Vel und LV , um die diastolischen Spitzengeschwindigkeiten bzw. die systolische Funktion des Herzens aus den Bildern zu erhalten.</li>
	<li>Berechnen Sie CFR als das Verhältnis der diastolischen maximalen koronaren Flussgeschwindigkeit (CFV) bei maximalem Fluss zu diastolischer Peak-CFV zu Studienbeginn.</li>
</ol>3. Verfahren der myokardialen Ischämie-Reperfusion
HINWEIS: Die erste Messung war zu Studienbeginn, dann wurde eine Operation am selben Tier durchgeführt.

<ol><li>Betäuben Sie die Mäuse mit Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg) und verabreichen Sie das schmerzstillende Carprofen (5 mg/kg, subkutane Injektion). Verwenden Sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs ein vorgewärmtes Heizkissen (37 °C). Stellen Sie eine angemessene Anästhesietiefe sicher, indem Sie keinen Entzugsreflex für Zehenkneif- und Blinzelreflexe haben. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf das Heizkissen und tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Führen Sie eine endotracheale Intubation zur mechanischen Beatmung durch: Desinfizieren Sie den Bereich mit 3 abwechselnden Peelings mit Betadin oder Chlorhexidin und 70% Alkohol vor und nach der Entfernung der Halshaare. Lokalisieren Sie die Luftröhre und führen Sie den Katheter vorsichtig ein. Schließen Sie dann die Mäuse an das Beatmungsgerät an (inspiratorisches Atemzugvolumen von 250 μl bei 120 Atemzügen/min) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Haut des präkordialen Bereichs mit 3 abwechselnden Peelings aus Betadin oder Chlorhexidin und 70% Alkohol. Legen Sie das Herz frei, indem Sie eine linke Thorakotomie10 im vierten Interkostalraum durchführen.</li>
	<li>Ligatten Sie die linke vordere absteigende Arterie (LAD) mit einem Gleitknoten unter Verwendung einer 5-0-Seidennaht (siehe Materialtabelle) und setzen Sie sie 1-2 mm unterhalb der Wurzel des linken Vorhofohrs ein. Achten Sie darauf, dass die Nährichtung parallel zur Unterkante des linken Vorhofohrs verläuft. Visuelle Bestätigung der Ischämie bei allen Mäusen durch lokale Farbverdunkelung des ischämischen Myokards.</li>
	<li>Verschluss der LAD-Arterie für 30 min11. Nach 30 min lösen Sie die Ligatur und überprüfen die Reperfusion, indem Sie die Rötung des zuvor verfärbten Bereichs des Herzmuskels 1-2 min lang beobachten.</li>
	<li>Nach dem Koronarverschluss/der Reperfusion schließen Sie die Brust in Schichten und lassen Sie die Mäuse etwa eine halbe Stunde lang erholen11.</li>
</ol>4. Ultraschallbildgebung nach einer IR-Operation
<ol><li>Messen Sie den CFR erneut 1 h, 3 h, 5 h, 8 h, 24 h bzw. 48 h nach der Reperfusion gemäß den in Abschnitt 2 beschriebenen Schritten. Vergleichen Sie diese Messungen mit den CFR-Werten, die vor dem Ischämie-Reperfusions-Verfahren (IR) erhalten wurden.</li>
</ol>5. Statistische Auswertung
<ol><li>Führen Sie statistische Analysen mit einer geeigneten statistischen Analysesoftware durch (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Verwenden Sie für den Vergleich kontinuierlicher Variablen zwischen gepaarten Stichproben gepaarte t-Tests , wenn die Daten normalverteilt sind. Für nicht normalverteilte Daten oder wenn die Annahmen der Normalverteilung nicht erfüllt sind, verwenden Sie die Friedman-ANOVA. Betrachten Sie p < 0,05 als statistisch signifikant.</li>
</ol>

CFR-Veränderungen nach Ischämie: Implikationen für mikrovaskuläre Dysfunktion

<ol>
	<li>O'Farrell, F. M., Mastitskaya, S., Hammond-Haley, M., Freitas, F., Wah, W. R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+mediate+coronary+no-reflow+after+myocardial+ischaemia.">Capillary pericytes mediate coronary no-reflow after myocardial ischaemia.</a> Elife. 6, e29280 (2017).</li><li>Dimitrow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transthoracic+Doppler+echocardiography-noninvasive+diagnostic+window+for+coronary+flow+reserve+assessment.">Transthoracic Doppler echocardiography-noninvasive diagnostic window for coronary flow reserve assessment.</a> Cardiovascular ultrasound. 1, 4 (2003).</li><li>Picano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+echocardiography:+a+historical+perspective.">Stress echocardiography: a historical perspective.</a> The American Journal of Medicine. 114 (2), 126-130 (2003).</li><li>Lim, D. S., Kim, Y. H., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+flow+reserve+is+reflective+of+myocardial+perfusion+status+in+acute+anterior+myocardial+infarction.">Coronary flow reserve is reflective of myocardial perfusion status in acute anterior myocardial infarction.</a> Catheterization and Cardiovascular Interventions: Official Journal of The Society For Cardiac Angiography &amp; Interventions. 51 (3), 281-286 (2000).</li><li>Feldman, L. J., Himbert, D., Juliard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion+syndrome:+relationship+of+coronary+blood+flow+reserve+to+left+ventricular+function+and+infarct+size.">Reperfusion syndrome: relationship of coronary blood flow reserve to left ventricular function and infarct size.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (5), 1162-1169 (2000).</li><li>Cortigiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+flow+reserve+during+dipyridamole+stress+echocardiography+predicts+mortality.">Coronary flow reserve during dipyridamole stress echocardiography predicts mortality.</a> JACC Cardiovascular imaging. 5 (11), 1079-1085 (2012).</li><li>Han, B., Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximal+coronary+hemodynamic+changes+evaluated+by+intracardiac+echocardiography+during+myocardial+ischemia+and+reperfusion+in+a+canine+model.">Proximal coronary hemodynamic changes evaluated by intracardiac echocardiography during myocardial ischemia and reperfusion in a canine model.</a> Echocardiography (Mount Kisco, NY). 25 (3), 312-320 (2008).</li><li>Kelm, N. Q., Beare, J. E., LeBlanc, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+coronary+flow+reserve+after+myocardial+ischemia+reperfusion+in+rats.">Evaluation of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. 148, e59406 (2019).</li><li>Batra, A., Warren, C. M., Ke, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+P21-activated+kinase-1+induces+age-dependent+increased+visceral+adiposity+and+cardiac+dysfunction+in+female+mice.">Deletion of P21-activated kinase-1 induces age-dependent increased visceral adiposity and cardiac dysfunction in female mice.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1337-1349 (2021).</li><li>Lv, B., Zhou, J., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Induction of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 179, e63257 (2022).</li><li>Huang, G., Lu, X., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSK9+knockdown+can+improve+myocardial+ischemia/reperfusion+injury+by+inhibiting+autophagy.">PCSK9 knockdown can improve myocardial ischemia/reperfusion injury by inhibiting autophagy.</a> Cardiovascular Toxicology. 22 (12), 951-961 (2022).</li><li>Lenzarini, F., Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Faita, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+isoflurane-induced+vasodilation:+a+Doppler+ultrasound+study+of+the+left+coronary+artery+in+mice.">Time course of isoflurane-induced vasodilation: a Doppler ultrasound study of the left coronary artery in mice.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 42 (4), 999-1009 (2016).</li><li>Chowdhury, S. A. K., Rosas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echocardiographic+characterization+of+left+ventricular+structure,+function,+and+coronary+flow+in+neonate+mice.">Echocardiographic characterization of left ventricular structure, function, and coronary flow in neonate mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 182, e63539 (2022).</li><li>Sadauskiene, E., Zakarkaite, D., Ryliskyte, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+evaluation+of+myocardial+reperfusion+by+transthoracic+Doppler+echocardiography+and+single-photon+emission+computed+tomography+in+patients+with+anterior+acute+myocardial+infarction+.">Non-invasive evaluation of myocardial reperfusion by transthoracic Doppler echocardiography and single-photon emission computed tomography in patients with anterior acute myocardial infarction .</a> Cardiovascular Ultrasound. 9, 16 (2011).</li><li>Bax, M., de Winter, R. J., Schotborgh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+recovery+of+left+ventricular+function+predicted+at+the+time+of+primary+percutaneous+coronary+intervention+in+anterior+myocardial+infarction.">Short- and long-term recovery of left ventricular function predicted at the time of primary percutaneous coronary intervention in anterior myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 43 (4), 534-541 (2004).</li><li>Lee, S., Otsuji, Y., Minagoe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+evaluation+of+coronary+reperfusion+by+transthoracic+Doppler+echocardiography+in+patients+with+anterior+acute+myocardial+infarction+before+coronary+intervention.">Noninvasive evaluation of coronary reperfusion by transthoracic Doppler echocardiography in patients with anterior acute myocardial infarction before coronary intervention.</a> Circulation. 108 (22), 2763-2768 (2003).</li><li>Kelshiker, M. A., Seligman, H., Howard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+flow+reserve+and+cardiovascular+outcomes:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Coronary flow reserve and cardiovascular outcomes: a systematic review and meta-analysis.</a> European Heart Journal. 43 (16), 1582-1593 (2022).</li><li>Taqueti, V. R., Di Carli, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+microvascular+disease+pathogenic+mechanisms+and+therapeutic+options:+JACC+state-of-the-art+review.">Coronary microvascular disease pathogenic mechanisms and therapeutic options: JACC state-of-the-art review.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (21), 2625-2641 (2018).</li><li>Wikstr&#246;m, J., Gr&#246;nros, J., Gan, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+induces+dilation+of+epicardial+coronary+arteries+in+mice:+relationship+between+coronary+flow+velocity+reserve+and+coronary+flow+reserve+in+vivo+using+transthoracic+echocardiography.">Adenosine induces dilation of epicardial coronary arteries in mice: relationship between coronary flow velocity reserve and coronary flow reserve in vivo using transthoracic echocardiography.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 34 (7), 1053-1062 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden kommerziellen oder finanziellen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

In dieser Studie wird ein Protokoll vorgestellt, das eine modifizierte parasternale Längsachsenansicht verwendet, um die CFR nach Ischämie-Reperfusion dynamisch zu beurteilen. Die wichtigsten Ergebnisse deuten auf eine signifikante Abnahme der CFR bei IR-Mäusen hin, wobei die ausgeprägteste Reduktion 1 h nach der Reperfusion beobachtet wurde. Die Herzfunktion war jedoch innerhalb von 48 h nicht beeinträchtigt.
CFR dient als Indikator für die myokardiale Blutversorgung und bietet einen nicht-invasiven Ansatz zur Beurteilung sowohl der Koronararterienstenose als auch der koronaren mikrovaskulären Zirkulation. Klinische Studien haben gezeigt, dass niedrigere CFR-Werte mit schlechteren Prognosen verbunden sind 14,15,16, und ein CFR-Cut-off-Wert von 1,75 wurde als optimal für die Risikostratifizierung festgelegt 14. Eine kürzlich durchgeführte Metaanalyse zeigte außerdem, dass das Sterberisiko um 16 % für jede Abnahme der CFR um 0,1 Einheiten steigt, was darauf hindeutet, dass CFR ein Kontinuum des Risikos darstellt, wobei niedrigere Werte die Patienten für schlechtere klinische Ergebnisse prädisponieren17. In dieser Studie zeigte sich ein Trend zur Zunahme der Reperfusionszeit, blieb aber niedriger als vor dem Eingriff, was die Bedeutung der Überwachung der Patienten nicht nur unmittelbar nach der Öffnung des verursacherlichen Gefäßes durch PCI, sondern auch nach 48 Stunden unterstreicht. Darüber hinaus dient die CFR als Maß für die koronare mikrovaskuläre Dysfunktion, indem sie die hämodynamischen Effekte von fokalen, diffusen und kleinen Gefäßerkrankungen auf die Perfusion des Myokardgewebes integriert18. Daher ist CFR eine wichtige nicht-invasive Technik zur Diagnose von koronaren mikrovaskulären Erkrankungen. Da CFR auf LAD ein starker und unabhängiger Indikator für die Mortalitätist 6,7, zielt diese Studie darauf ab, Referenzwerte für klinische Entscheidungen zu liefern. Darüber hinaus kann der Einsatz von Ultraschallgeräten den Bedarf an Koronarangiographie in einer kostensenkenden Umgebung im Gesundheitswesen reduzieren. Durch die entsprechende Schulung und Aufrüstung der Technologie kann die Risikostratifizierung auf die individuellen Bedürfnisse der Patienten zugeschnitten werden.
Die modifizierte PLAX-Ansicht bietet mehr Komfort und Zeitersparnis für wissenschaftliche Forscher. Die kontinuierliche Verbesserung dieser Technologie wird ihre breitere Anwendung bei anderen koronaren mikrovaskulären Erkrankungen erleichtern. Zu den wichtigsten Schritten in diesem Protokoll gehören die Visualisierung der Koronararterie und die Erstellung hochwertiger PW-Geschwindigkeitsbilder. Die Blutflussgeschwindigkeit nimmt mit zunehmender Anästhesiekonzentration allmählich zu, daher wird eine kontinuierliche Erfassung empfohlen, um die maximale Blutflussgeschwindigkeit nicht zu verpassen. Da eine Erhöhung der Anästhesiekonzentration die Herzfrequenz verändern kann, wird empfohlen, während der Messung kurzzeitig in den Farbdopplermodus zurückzukehren, um eine gleichmäßige Positionierung vor und nach der Messung zu gewährleisten.
Es ist wichtig, Einschränkungen zu berücksichtigen, einschließlich der Einschränkungen, die der Ultraschallmessung von CFR inhärent sind. Aufgrund der Krümmung der Koronararterie ist es nicht möglich, die gesamte Arterie vollständig darzustellen, was zu einer Messung in nur einem Segment führt. Der Bediener muss darauf abzielen, den Beginn der Koronararterie zu messen, um den Punkt der maximalen koronaren Blutflussgeschwindigkeit so genau wie möglich zu identifizieren. Darüber hinaus sollte die CFR idealerweise auf der Grundlage von Änderungen des koronaren Blutflussvolumens bestimmt werden, aber in dieser Studie wird die Blutflussgeschwindigkeit anstelle des Blutflussvolumens verwendet, wobei der Einfluss des Gefäßdurchmessers übersehen wird. Frühere Studien haben jedoch eine starke Korrelation zwischen CFR und CFVR (koronare Strömungsgeschwindigkeitsreserve)19 gezeigt. Weitere Forschungen zur koronaren mikrovaskulären Funktion können dazu beitragen, die komplexen Veränderungen der Ischämie zu verstehen und unser Verständnis der koronaren mikrovaskulären Dysfunktion zu verbessern.

Die koronare Herzkrankheit ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit1. Selbst wenn die verursacherliche Koronararterie durch eine primäre perkutane Koronarintervention (PCI) nach kardialer Ischämie wieder geöffnet wird, bleibt die koronare mikrovaskuläre Perfusion oft vermindert. Darüber hinaus gibt es keine Garantie für eine Reperfusion in den stromabwärts gelegenen Kapillaren, die das Myokardversorgen 1. Dieses Phänomen, das als "No-Reflow-Phänomen" bekannt ist, ist mit dem klinischen Verlauf und einer schlechten Prognose verbunden. Folglich ist das Erreichen eines adäquaten mikrovaskulären Reflows nach erfolgreicher Reperfusionstherapie entscheidend für die Rettung des Myokards. Daher ist die frühzeitige Beurteilung der mikrovaskulären Funktion nach Revaskularisation für die klinische Praxis von entscheidender Bedeutung.
Verschiedene Techniken, wie z. B. der invasive intrakoronare Temperatur-/Druckleitdraht zum Index des Mikrozirkulationswiderstands (IMR) und des hyperämischen mikrovaskulären Widerstands (HMR), die nicht-invasive kardiovaskuläre Magnetresonanz (CMR), die Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) können zur Beurteilung der mikrovaskulären Funktion eingesetzt werden2. Diese Methoden sind jedoch entweder invasiv oder semi-invasiv, teuer und oft nicht ohne weiteres verfügbar, was ihren klinischen Nutzen einschränkt. Auf der anderen Seite bietet die Beurteilung der koronaren Flussreserve (CFR) durch transthorakale Doppler-Echokardiographie einen nichtinvasiven, relativ einfachen und kostengünstigen Ansatz, ohne die Patienten ionisierender Strahlung auszusetzen, wie es bei anderen Methoden der Fall ist3.
Obwohl in früheren Studien die transthorakale Doppler-Echokardiographie zur Messung von CFR bei Mäusen und Ratten eingesetzt wurde, bleiben Herausforderungen für die Bediener bestehen, um die komplexen Winkel zwischen der Plattform, den Mäusen und der Sonde zu lokalisieren. Dieses Protokoll überwindet dieses Problem, indem es eine einfachere Methode zur Lokalisierung der Koronararterie der linken anterioren absteigenden Arterie (LAD) und zur schnellen Messung der CFR mit der modifizierten parasternalen Langachse (PLAX) bietet.
Darüber hinaus zeigte die CFR, die in der infarktverwandten Arterie (IRA) distal der verursacherlichen Läsion entnommen wurde, eine starke Korrelation mit dem Perfusionsstatus, der durch die myokardiale Kontrastechokardiographie (MCE) beurteilt wurde4. Es wurde auch als prädiktiver Marker für die Lebensfähigkeit und die Wiederherstellung der linksventrikulären (LV) Funktion nach einem akuten Myokardinfarkt (AMI) identifiziert5. Darüber hinaus hat sich CFR als zuverlässiger Marker für die Gesamtmortalität und ungünstige kardiovaskuläre Ergebnisse etabliert 6,7. In früheren Berichten wurde die Verwendung der Echokardiographie zur Beurteilung von CFR in Rattenmodellen des Myokardinfarkts beschrieben8. Dennoch ist die CFR im Frühstadium der Ischämie-Reperfusion nicht gründlich untersucht. Daher liefert diese Studie einen Referenzwert für die Diagnose einer mikrovaskulären Dysfunktion und die Beurteilung des therapeutischen Effekts der Ischämie-Reperfusion durch dynamische Tests an IR-Mäusen im Frühstadium der Reperfusion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.</td>
			<td>210322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 mice</td>
			<td>Peking University Health Science Center Department of Laboratory Animal Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating agent</td>
			<td>Nair</td>
			<td>NAR-255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode gel</td>
			<td>Cofoe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Frequency Ultrasound</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td>
			<td>Vevo3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>REWARD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear array high frequency transducer</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td>
			<td>MS550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Shanghai Alcott Biotech</td>
			<td>ALC-V9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Anesthesia Machine</td>
			<td>REWARD</td>
			<td>R530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS</td>
			<td>IBM Corp, Armonk, NY, USA</td>
			<td>version 23.0&#160;</td>
			<td>statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound Gel</td>
			<td>Cofoe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Verison 5.7.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic assessments of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in mice

Nach einer kardialen Ischämie kommt es häufig zu einer unzureichenden Myokardperfusion, selbst wenn der Fluss in einer vorgelagerten Arterie erfolgreich und vollständig wiederhergestellt wurde. Dieses Phänomen, das als "No-Reflow-Phänomen" bekannt ist, wird auf eine koronare mikrovaskuläre Dysfunktion zurückgeführt und wurde mit schlechten klinischen Ergebnissen in Verbindung gebracht. In der klinischen Praxis wird eine Verringerung der koronaren Flussreserve (CFR) häufig als Indikator für eine koronare Herzkrankheit verwendet. CFR ist definiert als das Verhältnis der durch pharmakologische oder metabolische Faktoren induzierten Spitzenströmungsgeschwindigkeit zur Ruheströmungsgeschwindigkeit.
Dieses Protokoll konzentrierte sich auf die Beurteilung der dynamischen Veränderungen der CFR vor und nach der Ischämie-Reperfusion (IR) mittels Pulswellen-Doppler-Messungen. In dieser Studie zeigten normale Mäuse die Fähigkeit, die Spitzengeschwindigkeit des koronaren Blutflusses bis zu zweimal höher zu erhöhen als die Ruhewerte unter Isofluran-Stimulation. Nach Ischämie-Reperfusion nahm die CFR nach 1 h jedoch im Vergleich zum Ausgangswert vor der Operation signifikant ab. Im Laufe der Zeit erholte sich der CFR allmählich, blieb aber unter dem normalen Niveau. Trotz des Erhalts der systolischen Funktion ist die Früherkennung mikrovaskulärer Dysfunktionen von entscheidender Bedeutung, und die Erstellung eines praktischen Leitfadens könnte Ärzten bei dieser Aufgabe helfen und gleichzeitig die Untersuchung des Fortschreitens von Herz-Kreislauf-Erkrankungen im Laufe der Zeit erleichtern.

In dieser Studie wurden männliche C57-Mäuse (BW ~18-20 g) verwendet, um die dynamische Veränderung von CFR zu charakterisieren. Das modifizierte PLAX-Bild wurde verwendet, um die Flusseigenschaften der Koronararterien von LAD zu beurteilen (Abbildung 1A,B). Die CFR wurde berechnet als das Verhältnis der maximalen Strömungsgeschwindigkeit während der maximalen Vasodilatation, induziert durch 3 % Isofluran, zur maximalen Strömungsgeschwindigkeit bei einem Ausgangswert von 1,5 % Isoflurankonzentration12,13. Alle Messungen und Berechnungen wurden über drei aufeinanderfolgende Herzzyklen wiederholt und gemittelt, wobei die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 2 dargestellt sind.
Vor der IR-Operation wurde die CFR zu Studienbeginn gemessen, und die Mäuse hatten einen normalen CFR-Wert in der Nähe von 2,14 ± 0,43. Nach der IR-Operation nahm die CFR jedoch bei einer Reperfusion von 1 h im Vergleich zu vor der IR-Operation signifikant ab (1,18 ± 0,14 vs. 2,14 ± 0,43) (Abbildung 3A). Diese Reduktion deutete darauf hin, dass die Mikrozirkulation auch nach dem Öffnen des Übelgefäßes nicht sofort wiederhergestellt wurde. Mit zunehmender Verlängerung der Reperfusionszeit blieben die CFR-Werte auf einem konstant niedrigen Niveau, mit Werten von 1,21 ± 0,20 nach 3 Stunden, 1,39 ± 0,33 nach 5 Stunden, 1,44 ± 0,38 nach 8 Stunden, 1,34 ± 0,36 nach 24 Stunden und 1,48 ± 0,47 nach 48 Stunden nach der Reperfusion, was darauf hindeutet, dass die Hypoperfusion mindestens zwei Tage lang anhalten könnte (Abbildung 3A). Darüber hinaus gab es keine statistische Signifikanz zwischen den CFR-Werten bei 1 h, 3 h, 5 h, 8 h, 24 h und 48 h.
Die Mäuse wurden auch auf ihre Herzfunktion überwacht, und es wurde beobachtet, dass es keine signifikanten Veränderungen der linksventrikulären Herzfunktion gab, wenn die CFR bei den Mäusen signifikant reduziert war (Abbildung 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65391/65391fig01.jpg"> Abbildung 1: Modifizierte parasternale Längsachsenansicht. (A) veranschaulicht die Positionierung der Sonde und der Plattform bei der Ermittlung der Koronararteriengeschwindigkeit von LAD. (B) zeigt die Platzierung des Pulswellen-Geschwindigkeitssensors an der LAD-Koronararterie. Die blaue Farbe zeigt eine Bewegung weg von der Ultraschallsonde an, während die orange Farbe eine Bewegung in Richtung der Ultraschallsonde anzeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65391/65391fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65391/65391fig02.jpg"> Abbildung 2: Visualisierung und Aufzeichnung der Pulswellengeschwindigkeitsbildgebung von LAD. (A) Pulswellenbild während des Ruhezustands der LAD-Koronararterie. (B) Maximales hyperämisches koronares Pulswellenbild der LAD-Koronararterie. Die blaue Farbe zeigt die Bewegung weg von der Ultraschallsonde, während die orangefarbene Farbe die Bewegung in Richtung der Ultraschallsonde darstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65391/65391fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65391/65391fig03.jpg"> Abbildung 3: Messung der koronaren Flussreserve und der Ejektionsfraktion. (A) Statistische Analyse der CFR bei Tieren vor der Ischämie bzw. 1 h, 3 h, 5 h, 8 h, 24 h bzw. 48 h nach der Reperfusion (n = 9). (B) Bewertung der Ejektionsfraktion aus jeder Gruppe zu jedem Zeitpunkt (n = 9). *p < 0,05; Daten, die als mittlere ± SD dargestellt und mit gepaarten t-Tests und Friedmans ANOVA analysiert wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65391/65391fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Assessments of Coronary Flow Reserve after Myocardial Ischemia Reperfusion in Mice at JoVE.com

Autor im Rampenlicht: Verbesserte Lokalisierung und Überwachung der koronaren Flussreserve mit modifizierter PLAX-Ansicht bei Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine modifizierte parasternale Längsachsenansicht zur schnellen und präzisen Lokalisierung der linken anterioren absteigenden Arterie. Dieser Ansatz soll einfacher und benutzerfreundlicher sein und gleichzeitig die Untersuchung dynamischer Veränderungen der koronaren Flussreserve nach myokardialer Ischämie-Reperfusion bei Mäusen erleichtern.

Dynamische Bewertungen der koronaren Flussreserve nach myokardialer Ischämie-Reperfusion bei Mäusen

After cardiac ischemia, there is often insufficient myocardial perfusion, even if flow has been successfully and completely restored in an upstream ...

Unser Protokoll beschreibt eine modifizierte parasternale Längsachsenansicht für eine schnelle und präzise Lokalisierung der linken anterioren absteigenden Arterie. Mit diesem Ansatz untersuchten wir dynamische Veränderungen der koronaren Flussreserve nach myokardialer Ischämie-Reperfusion bei Mäusen. Diese Studie stellt eine modifizierte PLAX-Ansicht vor, die Zeit spart und wissenschaftlichen Forschern Komfort bietet.Darüber hinaus ergab die Studie, dass CFR die Verlängerung der Basisreperfusionszeit erhöhte, aber niedriger blieb als vor dem Eingriff, was die Bedeutung einer frühzeitigen Überwachung nach der PCI unterstreicht. Unser Protokoll vereinfacht die Lokalisierung komplexer Winkel zwischen Plattform, Mäusen, Sonde und Maus-CFR.

dynamic-assessments-coronary-flow-reserve-after-myocardial-ischemia

Research

JoVE Journal

Biology

Dynamic Assessments of Coronary Flow Reserve after Myocardial Ischemia Reperfusion in Mice

864 Aufrufe.  Peking University China-Japan Friendship School of Clinical Medicine. Unser Protokoll beschreibt eine modifizierte parasternale Längsachsenansicht für eine schnelle und präzise Lokalisierung der linken anterioren absteigenden Arterie. Mit diesem Ansatz untersuchten wir dynamische Veränderungen der koronaren Flussreserve nach myokardialer Ischämie-Reperfusion bei Mäusen. Diese Studie stellt eine modifizierte PLAX-Ansicht vor, die Zeit spart und wissenschaftlichen Forschern Komfort bietet.Darüber hinaus ergab die Studie, dass CFR die Verlängerung d...

Serie: Autor im Rampenlicht: Verbesserte Lokalisierung und Überwachung der koronaren Flussreserve mit modifizierter PLAX-Ansicht bei Mäusen

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Anwendung von Licht-gehärteten Dental Adhesive Resin für Montage-Elektroden oder Mikrodialysesonden in Chronic Experimente

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Forschung

Biologie

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Umweltfreundliche Induced vererbbare Veränderungen in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip Transformation von Flachs (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;), Um Transgene Progenies mit hoher Umwandlungsrate generieren

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...