עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '82270352), פרויקט המחקר הקליני של בניית מחלקת המחקר בבייג'ינג (2022-YJXBF-04-03), מימון מחקר קליני של בית חולים ברמה גבוהה לאומית (2022-NHLHCRF-YSPY-01), מייסדי קפיטל לשיפור בריאות ומחקר (מס '2022-1-4062), התוכנית הלאומית לבניית דיסציפלינה קלינית מתמחה קלינית (מענק מס '2020-QTL-009), וקרן האגודה הסינית לקרדיולוגיה (לא. CSCF2021B02).

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פקין. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57 זכרים בני 8-12 שבועות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת בעלי חיים
<ol><li>הסירו את השיער מאזור השיער באמצעות קרם להסרת שיער (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן, המשך בהשגת תמונות האולטרסאונד לאחר שלב 2.</li>
</ol>2. הדמיית אולטרסאונד לפני ניתוח IR
<ol><li>מרדימים את העכבר על ידי הכנסתו לתא אינדוקציה איזופלורן (ראו טבלת חומרים) ומתחילים בהעברת איזופלורן בריכוז של 1.5% עם זרימה של 1.5-2.0 ליטר/דקה O2 .</li>
	<li>מקם את העכבר המרדים במצב שכיבה על פלטפורמת הניטור הפיזיולוגי (פלטפורמת ההדמיה של מערכת האולטרסאונד, ראה טבלת חומרים). החל כמות קטנה של ג'ל מוליך על יריעת הנחושת של שולחן הניטור הפיזיולוגי ולאבטח את כפות העכבר עם סרט דבק נמוך על זה כדי לקבל מידע פיזיולוגי על ECG ונשימה. שמור על טמפרטורת הגוף ב 37-38 מעלות צלזיוס באמצעות פלטפורמת ההתחממות המובנית. הערה: העבר את מתג הבקרה של מכונת ההרדמה בגז מהתא למסכה, ושמור על מינון הרדמה קבוע של 1.5% במהלך תקופה זו. קצב הלב של העכברים בשלב זה צריך להיות בערך 350-450 פעימות לדקה.</li>
	<li>יש למרוח משחה וטרינרית אופתלמית על העיניים לפני ההדמיה כדי למנוע יובש.</li>
	<li>בצעו אקוקרדיוגרפיה טרנס-חזה באמצעות בדיקה ליניארית9 של 40MHz (לדוגמה, בדיקת MS550 לעכברים) (איור 1A). הערה: מכשיר האולטרסאונד מצויד בבדיקה MS550.</li>
	<li>יש למרוח בנדיבות ג'ל שידור אולטרסאונד (ראו טבלת חומרים) כדי להבטיח איכות תמונה אופטימלית.</li>
	<li>התאימו את מיקום הגשושית והפלטפורמהליצירת מבט 9 (PLAX) על ציר ארוך פאראסטרנלי שונה (איור 1A) כדי לבחון את העורק היורד הקדמי השמאלי (LAD) במצב B. בקצרה, דמיינו את הלב באמצעות מבט פרסטרנלי ארוך ציר כאשר הפלטפורמה מיושרת לרוחב וממוקמת בזווית קטנה בין הגשושית לפלטפורמה.</li>
	<li>אתרו את אזור הלב המתאים במצב B והפעילו את Color Doppler במסך המגע (איור 1B). ניתן לזהות את ה-LAD (חץ לבן) בתוך דופן החדר השמאלי (איור 1B). הצבע האדום בזמן אמת מציין את כיוון זרימת הדם (כלומר, זרימת הדם היא לכיוון הבדיקה). הערה: על-ידי התאמת ציר ה-x, Color Doppler מאפשר תצוגה חזותית של ה-LAD המלא (מהסינוס האאורטלי לאתר הענף הדיסטלי) בחלון תמונה זה.</li>
	<li>מעט להזיז את הבדיקה כדי למצוא את המיקום הנכון ולהפחית את ההשפעה של זרימת הדם ורידים ריאתי. הערה: כדי להפחית את השפעת זרימת הדם של ורידים ריאתיים, להתאים מעט את הבדיקה ולהבדיל את LAD מן הווריד הריאתי. ה- LAD פועל בדופן החדר השמאלי, בעוד הווריד הריאתי מתנקז לאטריום השמאלי. אתר את ה- LAD באמצעות Color Doppler, והשתמש במצב B כדי לבחור את החלק המתאים.</li>
	<li>לאחר הדמיה של LAD במצב דופלר צבע, לחץ על כפתור גל הדופק (PW) ועבור למצב PW. מקם את קו המחוון הצהוב על העורק הכלילי, וודא שהוא מקביל לכיוון הזרימה. לאחר מכן לחץ על שמור קליפ כפתור להקלטת הנתונים הבסיסיים.</li>
	<li>הגדילו את ריכוז האיזופלורן ל-3% והמתינו 30 שניות. ודא שמהירות הזרימה עולה בהדרגה עם הזמן. לחץ על שמור קליפ כפתור לעתים קרובות כדי ללכוד את מהירות זרימת הדם הגבוהה ביותר. הערה: גירוי איזופלורן גורם ללב לעבוד קשה יותר, מה שמוביל לתנועה אפשרית של הלב וה- LAD. לאחר שהתמונה במצב PW נלכדת או מאוחסנת, לחץ על מצב PW כדי לוודא שקו החיווי הצהוב נמצא על ה- LAD. אם מתרחשת עקירה, התאם מעט את קו החיווי הצהוב לנקודת זרימת הדם והמשך בהקלטה. תהליך זה דורש שליטה ומיתוג מהירים.</li>
	<li>לאחר איסוף תמונות זרימת הדם הכלילי, כבה את חומר ההרדמה והתאם את הבדיקה לתצוגת PLAX רגילה. המתן עד שקצב הלב של העכבר יעלה באיטיות לכ-500 פעימות לדקה, ולאחר מכן מדוד את תפקוד לב העכבר על-ידי העברת הגשושית לאזור הציר הקצר (PSAX).</li>
	<li>עם השלמת ההדמיה האקוקרדיוגרפית, הוציאו את בעל החיים מהפלטפורמה ואפשרו לו להתאושש בכלוב הביתי שלו. הסר את הג'ל ולאפשר לחיה להתייבש כדי למנוע היפותרמיה.</li>
	<li>השתמש בכלי הפונקציות Peak Vel ו- LV כדי לקבל את שיא המהירויות הדיאסטוליות ואת תפקוד הלב הסיסטולי מהתמונות, בהתאמה.</li>
	<li>חשב CFR כיחס בין מהירות הזרימה הכלילית השיא הדיאסטולי (CFV) בזרימה מרבית לשיא הדיאסטולי CFV בנקודת ההתחלה.</li>
</ol>3. הליך איסכמיה של שריר הלב
הערה: המדידה הראשונית הייתה בסיסית, ולאחר מכן בוצע ניתוח באותה חיה.

<ol><li>מרדימים את העכברים עם נתרן pentobarbital (60 מ"ג / ק"ג) ולנהל את משכך כאבים carprofen (5 מ"ג / ק"ג, הזרקה תת עורית). יש להשתמש בכרית חימום שחוממה מראש (37°C) במהלך ההליך הכירורגי. ודא עומק הרדמה מתאים על ידי היעדר רפלקס נסיגה לצביטה בבוהן ורפלקסים מצמוץ. הניחו את העכבר בשכיבה על כרית החימום ומרחו משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע מהן להתייבש. בצע אינטובציה אנדוטרכאלית לאוורור מכני: יש לחטא את האזור עם 3 קרצוף לסירוגין של בטדין או כלורהקסידין ו-70% אלכוהול לפני ואחרי הסרת שיער הצוואר. אתר את קנה הנשימה והכנס בעדינות את הצנתר. לאחר מכן, חברו את העכברים למכונת ההנשמה (נפח גאות ושפל השראתי של 250 מיקרוליטר ב-120 נשימות לדקה) (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>לחטא את העור של האזור precordial עם 3 לסירוגין scrubs של betadine או chlorhexidine ו 70% אלכוהול. לחשוף את הלב על ידי ביצוע בית החזה השמאלי10 בחלל intercostal הרביעי.</li>
	<li>קשרו את העורק היורד הקדמי השמאלי (LAD) באמצעות תפר משי 5-0 (ראו טבלת חומרים), תוך החדרת 1-2 מ"מ מתחת לשורש התוספתן הפרוזדורי השמאלי. ודא שכיוון התפירה מקביל לקצה התחתון של תוספתן הפרוזדורים השמאלי. לאשר חזותית איסכמיה בכל העכברים באמצעות התכהות צבע מקומית של שריר הלב האיסכמי.</li>
	<li>חסום את עורק LAD למשך 30 דקות11. לאחר 30 דקות, שחררו את הרצועה וודאו את הרפרפוזיה על ידי התבוננות באדמומיות של האזור הדהוי בעבר של שריר הלב למשך 1-2 דקות.</li>
	<li>לאחר החסימה/רפרפוזיה הכלילית, סוגרים את בית החזה בשכבות ומאפשרים לעכברים להתאושש במשך כחצי שעה11.</li>
</ol>4. הדמיית אולטרסאונד לאחר ניתוח IR
<ol><li>מדוד את CFR שוב ב- 1 שעות, 3 שעות, 5 שעות, 8 שעות, 24 שעות ו- 48 שעות לאחר הרפרפוזיה, בהתאמה, בהתאם לשלבים המתוארים בסעיף 2. השווה מדידות אלה לערכי CFR שהתקבלו לפני הליך איסכמיה-רפרפוזיה (IR).</li>
</ol>5. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי מתאימה (ראה טבלת חומרים). הערה: להשוואה של משתנים רציפים בין דגימות זוגיות, השתמש בבדיקות t מזווגות, אם הנתונים מופצים בדרך כלל. עבור נתונים שאינם מופצים בדרך כלל או כאשר הנחות של נורמליות אינן מתקיימות, השתמש ANOVA של פרידמן. ניקח בחשבון את p < 0.05 כמובהק סטטיסטית.</li>
</ol>

שינויים ב-CFR לאחר איסכמיה: השלכות על תפקוד לקוי של כלי הדם

<ol>
	<li>O'Farrell, F. M., Mastitskaya, S., Hammond-Haley, M., Freitas, F., Wah, W. R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+mediate+coronary+no-reflow+after+myocardial+ischaemia.">Capillary pericytes mediate coronary no-reflow after myocardial ischaemia.</a> Elife. 6, e29280 (2017).</li><li>Dimitrow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transthoracic+Doppler+echocardiography-noninvasive+diagnostic+window+for+coronary+flow+reserve+assessment.">Transthoracic Doppler echocardiography-noninvasive diagnostic window for coronary flow reserve assessment.</a> Cardiovascular ultrasound. 1, 4 (2003).</li><li>Picano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+echocardiography:+a+historical+perspective.">Stress echocardiography: a historical perspective.</a> The American Journal of Medicine. 114 (2), 126-130 (2003).</li><li>Lim, D. S., Kim, Y. H., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+flow+reserve+is+reflective+of+myocardial+perfusion+status+in+acute+anterior+myocardial+infarction.">Coronary flow reserve is reflective of myocardial perfusion status in acute anterior myocardial infarction.</a> Catheterization and Cardiovascular Interventions: Official Journal of The Society For Cardiac Angiography &amp; Interventions. 51 (3), 281-286 (2000).</li><li>Feldman, L. J., Himbert, D., Juliard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion+syndrome:+relationship+of+coronary+blood+flow+reserve+to+left+ventricular+function+and+infarct+size.">Reperfusion syndrome: relationship of coronary blood flow reserve to left ventricular function and infarct size.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (5), 1162-1169 (2000).</li><li>Cortigiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+flow+reserve+during+dipyridamole+stress+echocardiography+predicts+mortality.">Coronary flow reserve during dipyridamole stress echocardiography predicts mortality.</a> JACC Cardiovascular imaging. 5 (11), 1079-1085 (2012).</li><li>Han, B., Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximal+coronary+hemodynamic+changes+evaluated+by+intracardiac+echocardiography+during+myocardial+ischemia+and+reperfusion+in+a+canine+model.">Proximal coronary hemodynamic changes evaluated by intracardiac echocardiography during myocardial ischemia and reperfusion in a canine model.</a> Echocardiography (Mount Kisco, NY). 25 (3), 312-320 (2008).</li><li>Kelm, N. Q., Beare, J. E., LeBlanc, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+coronary+flow+reserve+after+myocardial+ischemia+reperfusion+in+rats.">Evaluation of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. 148, e59406 (2019).</li><li>Batra, A., Warren, C. M., Ke, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+P21-activated+kinase-1+induces+age-dependent+increased+visceral+adiposity+and+cardiac+dysfunction+in+female+mice.">Deletion of P21-activated kinase-1 induces age-dependent increased visceral adiposity and cardiac dysfunction in female mice.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1337-1349 (2021).</li><li>Lv, B., Zhou, J., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Induction of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 179, e63257 (2022).</li><li>Huang, G., Lu, X., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSK9+knockdown+can+improve+myocardial+ischemia/reperfusion+injury+by+inhibiting+autophagy.">PCSK9 knockdown can improve myocardial ischemia/reperfusion injury by inhibiting autophagy.</a> Cardiovascular Toxicology. 22 (12), 951-961 (2022).</li><li>Lenzarini, F., Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Faita, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+isoflurane-induced+vasodilation:+a+Doppler+ultrasound+study+of+the+left+coronary+artery+in+mice.">Time course of isoflurane-induced vasodilation: a Doppler ultrasound study of the left coronary artery in mice.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 42 (4), 999-1009 (2016).</li><li>Chowdhury, S. A. K., Rosas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echocardiographic+characterization+of+left+ventricular+structure,+function,+and+coronary+flow+in+neonate+mice.">Echocardiographic characterization of left ventricular structure, function, and coronary flow in neonate mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 182, e63539 (2022).</li><li>Sadauskiene, E., Zakarkaite, D., Ryliskyte, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+evaluation+of+myocardial+reperfusion+by+transthoracic+Doppler+echocardiography+and+single-photon+emission+computed+tomography+in+patients+with+anterior+acute+myocardial+infarction+.">Non-invasive evaluation of myocardial reperfusion by transthoracic Doppler echocardiography and single-photon emission computed tomography in patients with anterior acute myocardial infarction .</a> Cardiovascular Ultrasound. 9, 16 (2011).</li><li>Bax, M., de Winter, R. J., Schotborgh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+recovery+of+left+ventricular+function+predicted+at+the+time+of+primary+percutaneous+coronary+intervention+in+anterior+myocardial+infarction.">Short- and long-term recovery of left ventricular function predicted at the time of primary percutaneous coronary intervention in anterior myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 43 (4), 534-541 (2004).</li><li>Lee, S., Otsuji, Y., Minagoe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+evaluation+of+coronary+reperfusion+by+transthoracic+Doppler+echocardiography+in+patients+with+anterior+acute+myocardial+infarction+before+coronary+intervention.">Noninvasive evaluation of coronary reperfusion by transthoracic Doppler echocardiography in patients with anterior acute myocardial infarction before coronary intervention.</a> Circulation. 108 (22), 2763-2768 (2003).</li><li>Kelshiker, M. A., Seligman, H., Howard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+flow+reserve+and+cardiovascular+outcomes:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Coronary flow reserve and cardiovascular outcomes: a systematic review and meta-analysis.</a> European Heart Journal. 43 (16), 1582-1593 (2022).</li><li>Taqueti, V. R., Di Carli, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+microvascular+disease+pathogenic+mechanisms+and+therapeutic+options:+JACC+state-of-the-art+review.">Coronary microvascular disease pathogenic mechanisms and therapeutic options: JACC state-of-the-art review.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (21), 2625-2641 (2018).</li><li>Wikstr&#246;m, J., Gr&#246;nros, J., Gan, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+induces+dilation+of+epicardial+coronary+arteries+in+mice:+relationship+between+coronary+flow+velocity+reserve+and+coronary+flow+reserve+in+vivo+using+transthoracic+echocardiography.">Adenosine induces dilation of epicardial coronary arteries in mice: relationship between coronary flow velocity reserve and coronary flow reserve in vivo using transthoracic echocardiography.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 34 (7), 1053-1062 (2008).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם קשרים מסחריים או פיננסיים מתחרים ידועים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

מחקר זה מציג פרוטוקול המשתמש במבט שונה על הציר הארוך של עצם החזה כדי להעריך באופן דינמי CFR לאחר איסכמיה-רפרפוזיה. הממצאים העיקריים מצביעים על ירידה משמעותית ב-CFR בעכברי IR, כאשר הירידה הבולטת ביותר נצפתה בשעה אחת לאחר הרפרפוזיה. עם זאת, תפקוד הלב לא הושפע בתוך 48 שעות.
CFR משמש כאינדיקטור לאספקת דם שריר הלב, ומציע גישה לא פולשנית להערכת היצרות העורקים הכליליים ומחזור הדם הכלילי. מחקרים קליניים הראו כי ערכי CFR נמוכים יותר קשורים לפרוגנוזות גרועות יותר 14,15,16, וערך חתך CFR של 1.75 נקבע כאופטימלי לריבוד סיכון 14. מטא-אנליזה שנערכה לאחרונה הראתה עוד כי הסיכון למוות עולה ב-16% עבור כל ירידה של 0.1 יחידות ב-CFR, מה שמצביע על כך ש-CFR מייצג רצף של סיכון, כאשר רמות נמוכות יותר נוטות את החולים לתוצאות קליניות גרועות יותר17. במחקר זה, CFR הראה מגמה של עלייה עם הארכת זמן הרפרפוזיה אך נשאר נמוך יותר מאשר לפני ההליך, והדגיש את החשיבות של ניטור חולים לא רק מיד לאחר פתיחת כלי הדם האשם דרך PCI אלא גם ב 48 שעות. יתר על כן, CFR משמש כמדד לתפקוד לקוי של כלי הדם הכליליים, ומשלב את ההשפעות ההמודינמיות של מחלות מוקדיות, מפושטות וכלי דם קטנים על זילוח רקמת שריר הלב18. לכן, CFR היא טכניקה לא פולשנית חיונית לאבחון מחלות כלי דם כליליים. מכיוון ש- CFR על LAD הוא אינדיקטור חזק ועצמאי לתמותה 6,7, מחקר זה נועד לספק ערכי ייחוס להחלטות קליניות. יתר על כן, השימוש במכשירי אולטרסאונד יכול להפחית את הצורך באנגיוגרפיה כלילית בסביבה של בלימת עלויות בריאות. על ידי הכשרה ושדרוג מתאימים של הטכנולוגיה, ניתן להתאים את ריבוד הסיכונים לצרכים האישיים של המטופל.
תצוגת PLAX ששונתה מציעה נוחות רבה יותר וחיסכון בזמן עבור חוקרים מדעיים. שיפור מתמשך של טכנולוגיה זו יאפשר את יישומה הרחב יותר במחלות כלי דם כליליים אחרים. השלבים העיקריים בפרוטוקול זה כוללים הדמיה של העורק הכלילי וקבלת תמונות מהירות PW באיכות גבוהה. מהירות זרימת הדם עולה בהדרגה עם ריכוז הרדמה עולה, ולכן מומלץ לכידה רציפה כדי למנוע פספוס של מהירות זרימת הדם המרבית. מכיוון שריכוז ההרדמה עלול לשנות את קצב הלב, מומלץ לחזור לזמן קצר למצב Color Doppler במהלך המדידה כדי להבטיח מיקום עקבי לפני ואחרי המדידה.
חיוני להכיר במגבלות, כולל מגבלות הטבועות במדידת אולטרסאונד של CFR. בשל העקמומיות של העורק הכלילי, לא ניתן להציג את העורק כולו במלואו, מה שמוביל למדידה במקטע אחד בלבד. על המפעילים לשאוף למדוד את תחילת העורק הכלילי כדי לזהות את נקודת מהירות זרימת הדם הכלילית המרבית בצורה מדויקת ככל האפשר. בנוסף, CFR צריך להיקבע באופן אידיאלי על סמך שינויים בנפח זרימת הדם הכלילי, אך מחקר זה משתמש במהירות זרימת הדם במקום בנפח זרימת הדם, תוך התעלמות מההשפעה של קוטר כלי הדם. עם זאת, מחקרים קודמים הדגימו מתאם חזק בין CFR לבין CFVR (שמורת מהירות זרימה כלילית)19. מחקר נוסף על תפקוד כלי הדם הכליליים עשוי לסייע בהבנת השינויים המורכבים באיסכמיה ולשפר את הבנתנו של תפקוד לקוי של כלי הדם הכליליים.

מחלת לב כלילית עומדת כאחד הגורמים המובילים לתמותה ברחבי העולם1. גם כאשר העורק הכלילי האשם נפתח מחדש באמצעות התערבות כלילית מלעורית ראשונית (PCI) לאחר איסכמיה לבבית, זילוח כלי הדם הכליליים נשאר לעתים קרובות מופחת. בנוסף, אין ערובה לרפרפוזיה בנימים במורד הזרם המספקים את שריר הלב1. תופעה זו, המכונה "תופעת אי-ההזרמה מחדש", קשורה להתקדמות קלינית ולפרוגנוזה גרועה. כתוצאה מכך, השגת זרימה מספקת של כלי הדם לאחר טיפול מוצלח ברפרפוזיה הופכת קריטית להצלת שריר הלב. לפיכך, הערכה מוקדמת של תפקוד כלי הדם לאחר רה-וסקולריזציה היא חיונית עבור פרקטיקות קליניות.
ניתן להשתמש בטכניקות שונות, כגון חוט מדריך טמפרטורה / לחץ תוך כלילי פולשני לאינדקס של התנגדות מיקרו-סירקולטורית (IMR) והתנגדות מיקרו-וסקולרית היפרמית (HMR), תהודה מגנטית קרדיווסקולרית לא פולשנית (CMR), טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT) וטומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), כדי להעריך תפקוד מיקרו-כלי דם2. עם זאת, שיטות אלה הן פולשניות או פולשניות למחצה, יקרות, ולעתים קרובות אינן זמינות, ומגבילות את התועלת הקלינית שלהן. מצד שני, הערכת רזרבת זרימה כלילית (CFR) על ידי אקוקרדיוגרפיה דופלר טרנס-חזה מציעה גישה לא פולשנית, פשוטה יחסית וחסכונית מבלי לחשוף את החולים לקרינה מייננת, כפי שניתן לראות בשיטות אחרות3.
למרות שמחקרים קודמים השתמשו באקוקרדיוגרפיה של דופלר טרנס-חזה כדי למדוד CFR בעכברים ובחולדות, נותרו אתגרים למפעילים לאתר את הזוויות המורכבות בין הפלטפורמה, העכברים והגשושית. פרוטוקול זה מתגבר על בעיה זו על ידי מתן שיטה קלה יותר לאיתור העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי (LAD) ומדידת CFR במהירות באמצעות תצוגת הציר הארוך של פאראסטרנל (PLAX) שונה.
יתר על כן, CFR שהתקבל בעורק הקשור לאינפרקט (IRA) דיסטלי לנגע האשם הראה מתאם חזק עם מצב זילוח המוערך על ידי אקוקרדיוגרפיה של ניגודיות שריר הלב (MCE)4. הוא זוהה גם כסמן מנבא לכדאיות ולהתאוששות תפקוד החדר השמאלי (LV) לאחר אוטם חריף של שריר הלב (AMI)5. בנוסף, CFR נקבע כסמן אמין לתמותה מכל הסיבות ולתוצאי לב וכלי דם שליליים 6,7. דוחות קודמים תיארו את השימוש באקוקרדיוגרפיה להערכת CFR במודלים של חולדות של אוטם שריר הלב8. עם זאת, CFR בשלב המוקדם של איסכמיה-רפרפוזיה לא נחקר ביסודיות. לכן, מחקר זה מספק ערך ייחוס לאבחון תפקוד לקוי של כלי הדם ולהערכת ההשפעה הטיפולית של איסכמיה-רפרפוזיה באמצעות בדיקות דינמיות בעכברי IR בשלב המוקדם של רפרפוזיה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.</td>
			<td>210322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 mice</td>
			<td>Peking University Health Science Center Department of Laboratory Animal Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating agent</td>
			<td>Nair</td>
			<td>NAR-255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode gel</td>
			<td>Cofoe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Frequency Ultrasound</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td>
			<td>Vevo3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>REWARD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear array high frequency transducer</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td>
			<td>MS550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Shanghai Alcott Biotech</td>
			<td>ALC-V9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Anesthesia Machine</td>
			<td>REWARD</td>
			<td>R530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS</td>
			<td>IBM Corp, Armonk, NY, USA</td>
			<td>version 23.0&#160;</td>
			<td>statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound Gel</td>
			<td>Cofoe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Verison 5.7.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic assessments of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in mice

לאחר איסכמיה לבבית, לעתים קרובות אין מספיק זילוח שריר הלב, גם אם הזרימה שוחזרה בהצלחה ולחלוטין בעורק במעלה הזרם. תופעה זו, הידועה בשם "תופעת אי-הזרמה חוזרת", מיוחסת לתפקוד לקוי של כלי הדם הכליליים ונקשרה לתוצאות קליניות גרועות. בפרקטיקה הקלינית, ירידה בשמורת הזרימה הכלילית (CFR) משמשת לעתים קרובות כאינדיקטור למחלת עורקים כליליים. CFR מוגדר כיחס בין מהירות זרימת השיא הנגרמת על ידי גורמים פרמקולוגיים או מטבוליים למהירות זרימת המנוחה.
פרוטוקול זה התמקד בהערכת השינויים הדינמיים ב- CFR לפני ואחרי איסכמיה-רפרפוזיה (IR) באמצעות מדידות דופלר של גלי דופק. במחקר זה, עכברים רגילים הפגינו יכולת להגביר את מהירות השיא של זרימת הדם הכלילי עד פי שניים מערכי המנוחה תחת גירוי איזופלורן. עם זאת, לאחר איסכמיה-רפרפוזיה, CFR לאחר שעה אחת ירד באופן משמעותי בהשוואה לקו הבסיס לפני הניתוח. עם הזמן, CFR הראה התאוששות הדרגתית, אבל זה נשאר מתחת לרמה נורמלית. למרות שימור התפקוד הסיסטולי, גילוי מוקדם של תפקוד לקוי של כלי הדם הוא חיוני, וקביעת מדריך מעשי יכולה לסייע לרופאים במשימה זו, תוך הקלה על המחקר של התקדמות מחלות לב וכלי דם לאורך זמן.

Coronary heart disease stands as one of the leading causes of mortality worldwide1. Even when the culprit coronary artery is re-opened through primary percutaneous coronary intervention (PCI) after cardiac ischemia, coronary microvascular perfusion often remains diminished. Additionally, there is no guarantee of reperfusion in the downstream capillaries supplying the myocardium1. This phenomenon, known as the "no-reflow phenomenon," is linked to clinical progression and a poor prognosis. Consequently, achieving adequate microvascular reflow after successful reperfusion therapy becomes critical for myocardial salvage. Hence, early assessment of microvascular function following revascularization is crucial for clinical practices.
Various techniques, such as invasive intracoronary temperature/pressure guide wire to index of microcirculatory resistance (IMR) and hyperemic microvascular resistance (HMR), non-invasive cardiovascular magnetic resonance (CMR), single-photon emission computed tomography (SPECT), and Positron emission tomography (PET), can be employed to assess microvascular function2. However, these methods are either invasive or semi-invasive, expensive, and often not readily available, limiting their clinical utility. On the other hand, assessing coronary flow reserve (CFR) by transthoracic Doppler echocardiography offers a noninvasive, relatively simple, and cost-effective approach without exposing patients to ionizing radiation, as seen in other methods3.
Though previous studies have employed transthoracic Doppler echocardiography to measure CFR in mice and rats, challenges remain for operators to locate the complex angles between the platform, mice, and probe. This protocol overcomes this issue by providing an easier method to locate the left anterior descending artery (LAD) coronary artery and measure CFR quickly using the modified parasternal long-axis (PLAX) view.
Furthermore, CFR obtained in the infarct-related artery (IRA) distal to the culprit lesion has shown a strong correlation with perfusion status assessed by myocardial contrast echocardiography (MCE)4. It has also been identified as a predictive marker for viability and left ventricular (LV) function recovery after an acute myocardial infarction (AMI)5. Additionally, CFR has been established as a reliable marker for all-cause mortality and adverse cardiovascular outcomes6,7. Previous reports have described the use of echocardiography to assess CFR in rat models of myocardial infarction8. Nevertheless, the CFR in the early stage of ischemia-reperfusion has not been thoroughly studied. Therefore, this study provides a reference value for diagnosing microvascular dysfunction and assessing the therapeutic effect of ischemia-reperfusion through dynamic tests in IR mice in the early stage of reperfusion.

זרקור המחבר: לוקליזציה משופרת וניטור של שמורת זרימה כלילית באמצעות תצוגת PLAX שונה בעכברים

הערכות דינמיות של שמורת הזרימה הכלילית לאחר רפרפוזיה של איסכמיה שריר הלב בעכברים

Our protocol describes a modified parasternal long axis view for swift and precise localization of the left anterior descending artery. Using this approach, we studied dynamic changes in coronary flow reserve following myocardial ischemia-reperfusion in mice. This study presents a modified PLAX view that saves time and offers convenience for scientific researchers.Additionally, the study found that CFR increased the base reperfusion time extension, but remained lower than pre-procedure, highlighting the importance of early monitoring after PCI. Our protocol simplifies locating complex angles between the platform, mice, probe, and murine CFR.

מחקר זה השתמש בעכברי C57 זכרים (BW ~ 18-20 גרם) כדי לאפיין את השינוי הדינמי של CFR. תמונת PLAX ששונתה שימשה להערכת מאפייני זרימת העורקים הכליליים של LAD (איור 1A,B). CFR חושב כיחס בין מהירות הזרימה המקסימלית במהלך התרחבות כלי דם מקסימלית המושרה על ידי 3% איזופלורן למהירות הזרימה המקסימלית בקו בסיס של 1.5% ריכוז איזופלורן12,13. כל המדידות והחישובים חזרו על עצמם במשך שלושה מחזורי לב רצופים והיו ממוצעים, כאשר התוצאות המייצגות הוצגו באיור 2.
לפני ניתוח האינפרא-אדום נמדד CFR בסיסי, ולעכברים היה ערך CFR תקין קרוב ל-2.14 ±-0.43. עם זאת, לאחר ניתוח IR, CFR ירד באופן משמעותי ברפרפוזיה של שעה אחת בהשוואה ללפני ניתוח IR (1.18 ± 0.14 לעומת 2.14 ± 0.43) (איור 3A). הפחתה זו הצביעה על כך שהמיקרוסירקולציה לא שוחזרה מיד גם לאחר פתיחת כלי האשם. ככל שזמן הרפרפוזיה התארך, ערכי CFR נותרו ברמה נמוכה באופן עקבי, עם ערכים של 1.21 ±-0.20 ב-3 שעות, 1.39 ±-0.33 ב-5 שעות, 1.44 ±-0.38 ב-8 שעות, 1.34 ±-0.36 ב-24 שעות, ו-1.48 ±-0.47 ב-48 שעות לאחר הרפרפוזיה, מה שמרמז על כך שהיפופרפוזיה יכולה להימשך לפחות יומיים (איור 3A). יתר על כן, לא נמצאה מובהקות סטטיסטית בין ערכי CFR ב- 1 h, 3 h, 5 h, 8 h, 24 h ו- 48 h.
העכברים היו גם במעקב אחר תפקוד הלב, ונצפה כי לא היו שינויים משמעותיים בתפקוד הלב של החדר השמאלי כאשר CFR ירד באופן משמעותי בעכברים (איור 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65391/65391fig01.jpg"> איור 1: תצוגה שונה של ציר ארוך של עצם החזה. (A) ממחיש את מיקום הגשושית והפלטפורמה תוך קבלת מהירות העורק הכלילי של LAD. (B) מראה את המיקום של חיישן מהירות גל הדופק על העורק הכלילי LAD. הצבע הכחול מציין תנועה הרחק מבדיקת האולטרסאונד, ואילו הצבע הכתום מציין תנועה לכיוון בדיקת האולטרסאונד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65391/65391fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65391/65391fig02.jpg"> איור 2: הדמיה והקלטה של הדמיית מהירות גל הדופק של LAD. (A) תמונת גל דופק במהלך מצב המנוחה של העורק הכלילי LAD. (B) תמונת גל דופק כלילי היפרמי מרבי של העורק הכלילי LAD. הצבע הכחול ממחיש תנועה הרחק מבדיקת האולטרסאונד, ואילו הצבע הכתום ממחיש תנועה לכיוון בדיקת האולטרסאונד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65391/65391fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65391/65391fig03.jpg"> איור 3: מדידת רזרבת זרימה כלילית ומקטע פליטה. (A) ניתוח סטטיסטי של CFR בבעלי חיים לפני איסכמיה וב-1 שעות, 3 שעות, 5 שעות, 8 שעות, 24 שעות ו-48 שעות לאחר רפרפוזיה, בהתאמה (n = 9). (B) הערכה של מקטע פליטה מכל קבוצה בכל נקודת זמן (n = 9). *P < 0.05; הנתונים שהוצגו כממוצע ± SD, נותחו עם מבחני t זוגיים ו-ANOVA של פרידמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65391/65391fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Assessments of Coronary Flow Reserve after Myocardial Ischemia Reperfusion in Mice at JoVE.com

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מבט פרסטרנלי ארוך שונה ללוקליזציה מהירה ומדויקת של העורק היורד הקדמי השמאלי. גישה זו נועדה להיות פשוטה וידידותית יותר למשתמש תוך הקלה על בחינת שינויים דינמיים במאגר הזרימה הכלילי בעקבות איסכמיה של שריר הלב בעכברים.

After cardiac ischemia, there is often insufficient myocardial perfusion, even if flow has been successfully and completely restored in an upstream ...

הפרוטוקול שלנו מתאר תצוגת ציר ארוך פאראסטרנלי שונה ללוקליזציה מהירה ומדויקת של העורק היורד הקדמי השמאלי. באמצעות גישה זו חקרנו שינויים דינמיים במאגר הזרימה הכלילית בעקבות איסכמיה-רפרפוזיה של שריר הלב בעכברים. מחקר זה מציג תצוגת PLAX שונה החוסכת זמן ומציעה נוחות לחוקרים מדעיים.בנוסף, המחקר מצא כי CFR הגדיל את הארכת זמן הזלוף הבסיסי, אך נשאר נמוך יותר מאשר לפני ההליך, מה שמדגיש את החשיבות של ניטור מוקדם לאחר PCI. הפרוטוקול שלנו מפשט את איתור הזוויות המורכבות בין הפלטפורמה, העכברים, הגשושית וה-CFR של מורין.

dynamic-assessments-coronary-flow-reserve-after-myocardial-ischemia

Research

JoVE Journal

Biology

Dynamic Assessments of Coronary Flow Reserve after Myocardial Ischemia Reperfusion in Mice

597 Views.  Peking University China-Japan Friendship School of Clinical Medicine. הפרוטוקול שלנו מתאר תצוגת ציר ארוך פאראסטרנלי שונה ללוקליזציה מהירה ומדויקת של העורק היורד הקדמי השמאלי. באמצעות גישה זו חקרנו שינויים דינמיים במאגר הזרימה הכלילית בעקבות איסכמיה-רפרפוזיה של שריר הלב בעכברים. מחקר זה מציג תצוגת PLAX שונה החוסכת זמן ומציעה נוחות לחוקרים מדע...

Video: זרקור המחבר: לוקליזציה משופרת וניטור של שמורת זרימה כלילית באמצעות תצוגת PLAX שונה בעכברים

After cardiac ischemia, there is often insufficient myocardial perfusion, even if flow has been successfully and completely restored in an upstream artery. This phenomenon, known as the "no-reflow phenomenon," is attributed to coronary microvascular dysfunction and has been associated with poor clinical outcomes. In clinical practice, a reduction in coronary flow reserve (CFR) is frequently used as an indicator of coronary artery disease. CFR is defined as the ratio of the peak flow velocity induced by pharmacologic or metabolic factors to the resting flow velocity.
This protocol focused on assessing the dynamic changes in CFR before and after ischemia-reperfusion (IR) using pulse wave Doppler measurements. In this study, normal mice exhibited the ability to increase the peak velocity of coronary blood flow up to two times higher than the resting values under isoflurane stimulation. However, after ischemia-reperfusion, the CFR at 1 h significantly decreased compared to the pre-operation baseline. Over time, the CFR showed gradual recovery, but it remained below the normal level. Despite the preservation of systolic function, early detection of microvascular dysfunction is crucial, and establishing a practical guide could aid doctors in this task, while also facilitating the study of cardiovascular disease progression over time.

The present protocol describes a modified parasternal long-axis view for swift and precise localization of the left anterior descending artery. This approach is designed to be simpler and more user-friendly while facilitating the examination of dynamic changes in coronary flow reserve following myocardial ischemia-reperfusion in mice.

Assessing the Dynamic Changes in Coronary Flow Reserve (CFR) Before and After Ischemia-Reperfusion

To begin, remove the hair from the precordial area of the anesthetized mouse using hair removal cream and position the mouse with its back down on the physiologic monitoring platform. Apply a small amount of conductive gel to the copper sheet on the physiological monitoring table. Secure the mouse pause onto this gel to facilitate the capture of electrocardiogram and respiration data.Apply a small amount of ultrasound transmission gel to ensure optimal image quality. Align the platform laterally at a small angle between the probe and platform, and obtain a parasternal long axis view of the heart. Then, locate the suitable heart section in B mode.Activate Color Doppler on the touch screen and slightly move the probe to find the right position. Now, switch to the Pulse Wave mode by pressing the corresponding button. Position the yellow indicator line on the coronary artery parallel to the direction of the flow, and press the Save Clip button to document the baseline data.Increase the isoflurane concentration to 3%and wait for 30 seconds. Ensure that the flow velocity gradually increases with time. Frequently press the Save Clip button again to capture the blood flow at its highest velocity.After completing the echocardiographic imaging, carefully remove the animal from the platform. Use the peak velocity function tools to measure the peak diastolic velocities and assess the heart's systolic function using the acquired images. Calculate the CFR by dividing the diastolic peak coronary flow velocity at maximal flow by the diastolic peak coronary flow velocity at baseline.Perform a thoracotomy on the fourth intercostal space to expose the heart. Then, ligate the LAD artery using a 5-0 silk suture. Verify ischemia in mice through visual confirmation of visualizing downstream discoloration in the ischemic myocardium.Perform an LAD artery occlusion for 30 minutes. Then, release the ligature and confirm reperfusion by monitoring the reddening of the discolored heart muscle area for one to two minutes. After coronary occlusion and reperfusion, close the chest in layers and let the mice recover for approximately half an hour.Measure the CFR again at 1, 3, 5, 8, 24 and 48 hours after reperfusion as previously demonstrated. Before the ischemia reperfusion surgery, the CFR baseline was measured and the mice had a normal CFR value. However, after the surgery, there was a notable decrease in CFR after one hour of reperfusion.As the reperfusion time was prolonged, the CFR values remained consistently low, suggesting hypoperfusion could persist for at least two days. No significant changes were observed in left ventricular cardiac function when the CFR was significantly reduced in the mice.