Unser Labor untersucht die räumliche und zeitliche Regulation von zyklischem AMP, um zu verstehen, welche Bedingungen bestimmte nachgelagerte Ereignisse auslösen. Um die subzelluläre Aktivierung und Hemmung des zyklischen AMP-Signalwegs effektiv nachzuahmen, charakterisieren wir die Verteilung eines optogenetischen Werkzeugs namens bPAC-Nanoluziferase. Um die Gültigkeit aktueller zyklischer AMP-Signalgebungsmodelle zu testen, haben wir Werkzeuge entwickelt, um zyklische AMP-Signale aus subzellulären Kompartimenten in lebenden Zellen zu bewerten, nachzuahmen und zu blockieren.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Verbreitung und Funktion optogenetischer Werkzeuge systematisch zu stimulieren und zu bewerten. Nun, unser Ziel war es, zu testen, ob der Fokuslichtprozess optogenetische Proteine in bestimmten Zellzonen präzise aktivieren kann, um so die Auswirkungen auf die umgebenden Proteine zu vermeiden. Diese Methode ist von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung von Proteinen mit diffusen Verteilungen oder wenn der beabsichtigte Effekt darin besteht, lokalisierte Erhöhungen von zyklischem AMP oder anderen Signalmolekülen zu erzeugen.
Bei optogenetischen Experimenten besteht der typische Ansatz darin, entweder ein ganzes Zellfeld oder manchmal kleinere bestimmte Bereiche zu stimulieren. Die Auswahl dieses Bereichs und dieser Intensität ist jedoch oft willkürlich. Unser systematischer Ansatz ermöglicht es den Forschern, genauere Experimente durchzuführen und dabei zu helfen, Muster von Signalwegen nachzuahmen.
Für diese Studie wurden Zellen verwendet, die mit einem nuklear-zielgerichteten zyklischen AMP-Sensor und einem optogenetischen nuklear-zielgerichteten Protein, NLS-bPAC-Nanoluziferase, co-transfiziert wurden. Kultivieren und manipulieren Sie die Zellen, die das nukleäre bPAC exprimieren, in einer dunklen Umgebung. Verwenden Sie eine rote Safelight-Lampe, um Wellenlängen von weniger als 500 Nanometern zu vermeiden.
Führen Sie die Bildgebungsexperimente in einem motorisierten Zweideckmikroskop durch, das mit einer Multi-LED-Light-Engine, einem Emissionsfilterrad, einem motorisierten XY-Tisch, einer ORCA-Fusion Digital CMOS-Kamera und einem Ölobjektiv mit 100-facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur von 1,4 ausgestattet ist. Um Bilder aufzunehmen, verwenden Sie eine digitale Mikroskopiesoftware. Dieser Aufbau ist in der Lage, Zellen zu stimulieren und gleichzeitig FRET-Messungen durchzuführen, indem ein unabhängiger Strahlengang verwendet wird, der mit einem dichroitischen Filter ZT458rdc ausgestattet ist.
Schalten Sie nach dem Einschalten des UGA-42 Geosystems und der LDI-7-Laser das Mikroskop ein, um es für die Datenerfassung mit dem H208 FRET-Sensor entsprechend einzurichten. Öffnen Sie dann nacheinander die Bildgebungssoftware und die SysCon-Software, die das Mikroskop steuert. Um das System vor jeder Verwendung zu kalibrieren, navigieren Sie zum Kamerafenster und wählen Sie die Registerkarte Kalibrierung.
Stellen Sie die Laserwellenlänge ein, die mit dem optogenetischen Protein kompatibel ist. Wählen Sie 445 Nanometer, um die bPAC-Nanoluziferase zu stimulieren. Wählen Sie die Registerkarte Kamera und klicken Sie auf Aufnahme starten, um die Erfassung über die Bildgebungssoftware zu starten.
Wählen Sie erneut die Registerkarte Kalibrierung aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrierung starten. Wählen Sie in der angezeigten Dropdown-Liste den richtigen Kalibrierungsmodus aus.
Befolgen Sie die vom Hersteller angegebenen Kalibrierungsschritte. Ändern Sie bei Bedarf die Einstellungen der Imaging-Software, um eine ordnungsgemäße Kalibrierung durchzuführen. Stellen Sie sicher, dass die Kalibrierung in einem zellfreien Bereich der Probe durchgeführt wird.
Nehmen Sie anschließend mit der Bildgebungssoftware ein Fluoreszenzbild auf. Fluoreszierende Zellen werden im Bildbetrachter-Fenster angezeigt. Positionieren Sie die Zelle, die mit der Mikroskopsteuerung XY stimuliert werden soll, innerhalb des Einflussbereichs, vorzugsweise in dessen Mitte.
Bevor Sie mit dem eigentlichen Experiment beginnen, verwenden Sie den Click-and-Fire-Modus, um die Reaktionsfähigkeit einer einzelnen Zelle schnell zu bewerten. Passen Sie im Zeitleistenfenster die Parameter für die Zellstimulation an, einschließlich der Lichtquelle, der Dauer und der Intensität des Stimulus. Klicken Sie im Fenster "Bildbetrachter" ungefähr auf die Mitte der Zelle und werten Sie die Antwort aus.
Wählen Sie im Image Viewer-Fenster das runde Symbol in der Symbolleiste auf der linken Seite aus und klicken Sie im Dropdown-Menü auf Gefüllt, um gefüllte kreisförmige Stimulationsobjekte zu zeichnen. Wiederholen Sie diesen Schritt, um mehrere identische Kreise zu erstellen und gleichmäßig zu verteilen, um eine homogene Abdeckung des gesamten Zytoplasmas der zu stimulierenden Zelle zu gewährleisten. Klicken Sie im Image Viewer-Fenster auf das Mauszeigersymbol auf der linken Seite und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf eines der Stimulationsobjekte, um dessen Eigenschaften zu überprüfen und zu bearbeiten.
Alternativ können Sie alle gezeichneten Stimulationsobjekte auswählen und dann mit der rechten Maustaste klicken, um die Eigenschaften aller ausgewählten Stimulationsobjekte zusammen zu bearbeiten. Klicken Sie im Unterfenster Ansicht auf die Schaltfläche Am Raster ausrichten. Dieses Raster kann dazu beitragen, einen gleichmäßigen Abstand und eine gleichmäßige Ausrichtung der Kreise beizubehalten, um eine geeignete Matrix oder ein Array zu bilden.
Darüber hinaus können Sie die Eigenschaften des Rasters mit der Schaltfläche Raster festlegen anpassen. Verteilen Sie die Stimulationsobjekte mit Hilfe des Gitters gleichmäßig. Fügen Sie bei Bedarf weitere Stimulationsobjekte hinzu, um die gesamte Zelle abzudecken.
Stellen Sie sicher, dass alle über die gleichen Eigenschaften verfügen. Jedes Stimulationsobjekt, das zuvor im Image Viewer-Fenster erstellt wurde, wird im Timeline-Fenster angezeigt, wo Sie einen anderen Satz von Eigenschaften bearbeiten können, einschließlich Startzeit, Dauer, Verzögerung, Intensität und mehr. Um die Stimulationsobjekte richtig zu visualisieren, erweitern Sie zunächst das Zeitleistenfenster.
Jetzt kann man die zeitlichen Eigenschaften von Stimulationsobjekten im Zeitleistenfenster sehen. Wählen Sie alle Stimulationsobjekte aus und bearbeiten Sie deren Verzögerung und Dauer im Unterfenster Objekt-Timing. Konfigurieren Sie im Unterfenster "Lichtquelle" die Wellenlängen und Intensitäten des Objekts.
Stellen Sie sicher, dass die Wellenlänge und Intensität für alle identisch ist. Um zu verhindern, dass sich die Wirkung von zwei oder mehr Stimulationen überlagert, stellen Sie für jedes Objekt unterschiedliche Startzeiten ein oder variieren Sie die Verzögerung zwischen ihnen, je nach erwartetem Ergebnis. Ändern Sie als Nächstes im Zeitleisten-Fenster die Reihenfolge, in der jedes Stimulationsobjekt bei Bedarf aktiviert wird.
Konfigurieren Sie die Reihenfolge der Stimulationen je nach Experiment in einem regelmäßigen oder zufälligen Muster. Nachdem Sie die Sequenz auf das System hochgeladen haben, konfigurieren Sie die Anzahl der Sequenzzyklen oder Ausführungen, die das System im Unterfenster Sequenz ausführen soll. Um die Fluoreszenzänderungen der stimulierten Zelle zu messen, platzieren Sie die interessierenden Regionen in der Bildgebungssoftware an den gewünschten Positionen.
Beginnen Sie mit der Aufnahme von Fluoreszenzbildern. Drücken Sie abschließend am UGA-42-Fenster auf Play, um mit der Stimulation der Zellen zu beginnen. Beobachten Sie die eigentlichen Stimulationsstrahlen, die auch von der Kamera erfasst werden können, und deren Korrelation mit den Stimulationsobjekten.
Beachten Sie nur die Intensitätsänderung der grünen Kurve, die den Anstieg der vom Sensor gemessenen zyklischen AMP-Konzentration anzeigt. Dies geschieht insbesondere dann, wenn der Strahl einen Teil der Zelle mit der minimalen Menge an bPAC-Nanoluziferase erreicht. Die YFP-Fluoreszenz von H208 wurde verwendet, um die Position des Zellkerns zu bestimmen.
Ein über den gesamten Zellkern umfassender Bereich von Interesse wurde verwendet, um Änderungen des FRET-Verhältnisses des H208-Sensors aufgrund der Stimulation an den angezeigten blauen Flecken zu messen. Dabei zeigte sich, dass vorübergehende Erhöhungen der zyklischen AMP nur dann auftraten, wenn blaues Licht auf Bereiche gerichtet wurde, die die bPAC-Nanoluziferase enthielten. Dies bestätigte, dass die nuklear-zielgerichtete bPAC-Nanoluziferase ausschließlich im Kernkompartiment von HC-1-Zellen exprimiert wurde.
