Nuestro laboratorio investiga la regulación espacial y temporal del AMP cíclico para comprender qué condiciones desencadenan eventos específicos aguas abajo. Para imitar eficazmente la activación subcelular y la inhibición de la señalización cíclica del AMP, caracterizamos la distribución de una herramienta optogenética llamada bPAC-nanoluciferasa. Para probar la validez de los modelos actuales de señalización cíclica de AMP, hemos desarrollado herramientas para evaluar, imitar y bloquear la señalización cíclica de AMP desde compartimentos subcelulares en células vivas.
Este protocolo se puede utilizar para estimular y evaluar la distribución y función de las herramientas optogenéticas de manera sistemática. Bueno, nuestro objetivo era probar si el proceso de luz de enfoque puede activar con precisión las proteínas optogenéticas en zonas celulares específicas, evitando así el impacto en las proteínas circundantes. Este método será vital para el estudio de proteínas con distribuciones difusas o si el efecto previsto es generar aumentos localizados en el AMP cíclico u otras moléculas de señalización.
En los experimentos optogenéticos, el enfoque típico implica estimular un campo completo de células o, a veces, áreas designadas más pequeñas. Sin embargo, la selección de esta zona e intensidad suele ser arbitraria. Nuestro enfoque sistemático permite a los investigadores realizar experimentos más precisos, lo que ayuda a imitar los patrones de las vías de señalización.
Para este estudio, se utilizaron células co-transfectadas con un sensor AMP cíclico dirigido a nuclear y una proteína optogenética dirigida a núcleo, NLS-bPAC-nanoluciferasa. Cultiva y manipula las células que expresan el bPAC nuclear en un entorno oscuro. Use una lámpara roja de luz de seguridad para evitar la exposición a longitudes de onda inferiores a 500 nanómetros.
Realice los experimentos de imágenes en un microscopio motorizado de dos pisos equipado con un motor de luz multi-LED, una rueda de filtro de emisión, una etapa XY motorizada, una cámara CMOS digital ORCA-Fusion y un objetivo de aceite de aumento de 100x con apertura numérica de 1,4. Para capturar imágenes, utilice un software de microscopía digital. Esta configuración es capaz de estimular células y realizar mediciones FRET simultáneamente mediante el uso de una trayectoria de luz independiente equipada con un filtro dicroico ZT458rdc.
Después de encender el geosistema UGA-42 y los láseres LDI-7, encienda el microscopio para configurarlo adecuadamente para la adquisición de datos con el sensor H208 FRET. A continuación, abra secuencialmente el software de adquisición de imágenes y el software SysCon que controla el microscopio. Para calibrar el sistema antes de cada uso, vaya a la ventana de la cámara y seleccione la pestaña Calibración.
Establezca la longitud de onda del láser compatible con la proteína optogenética. Elija 445 nanómetros para estimular la bPAC-nanoluciferasa. Seleccione la pestaña Cámara y haga clic en Iniciar adquisición para comenzar la adquisición desde el software de imágenes.
Vuelva a seleccionar la pestaña Calibración. Haga clic en el botón Iniciar calibración. En la lista desplegable que aparece, seleccione el modo de calibración adecuado.
Siga los pasos de calibración indicados por el fabricante. Si es necesario, cambie la configuración del software de imágenes para realizar una calibración adecuada. Asegúrese de realizar la calibración en un área libre de celdas de la muestra.
A continuación, utilizando el software de imágenes, adquiera una imagen de fluorescencia. Las células fluorescentes aparecerán en la ventana del Visor de imágenes. Coloque la célula que se estimulará con los controles del microscopio XY dentro del área de influencia, preferiblemente en su centro.
Antes de comenzar el experimento real, use el modo de clic y disparo para evaluar rápidamente la capacidad de respuesta de una celda individual. En la ventana Línea de tiempo, ajuste los parámetros de estimulación celular, incluida la fuente de luz, la duración y la intensidad del estímulo. En la ventana Visor de imágenes, haga clic aproximadamente en el centro de la celda y evalúe la respuesta.
En la ventana del Visor de imágenes, seleccione el icono redondo en la barra de herramientas de la izquierda y, en el menú desplegable, haga clic en Relleno para dibujar objetos de estimulación circular rellenos. Repita este paso para crear múltiples círculos idénticos y distribuirlos uniformemente, asegurando una cobertura homogénea de todo el citoplasma de la célula a estimular. En la ventana Visor de imágenes, haga clic en el icono del puntero del ratón a la izquierda y, a continuación, haga clic con el botón derecho en uno de los objetos de estimulación para comprobar y editar sus propiedades.
Como alternativa, seleccione todos los objetos de estimulación dibujados y, a continuación, haga clic con el botón derecho para editar las propiedades de todos los objetos de estimulación seleccionados juntos. En la subventana Ver, haga clic en el botón Ajustar a cuadrícula. Esta cuadrícula puede ayudar a mantener un espaciado y una alineación uniformes de los círculos para formar una matriz o matriz adecuada.
Además, personalice las propiedades de la cuadrícula con el botón Establecer cuadrícula. Distribuya los objetos de estimulación de manera uniforme con la ayuda de la rejilla. Agregue más objetos de estimulación si es necesario para cubrir toda la célula.
Asegúrese de que todos tengan las mismas propiedades. Cada objeto de estimulación creado previamente en la ventana del Visor de imágenes estará presente en la ventana de la línea de tiempo, donde se puede editar un conjunto diferente de propiedades, incluida la hora de inicio, la duración, el retraso, la intensidad y más. Para visualizar correctamente los objetos de estimulación, primero expanda la ventana de la línea de tiempo.
Ahora, se pueden ver las propiedades temporales de los objetos de estimulación en la ventana de la línea de tiempo. Seleccione todos los objetos de estimulación y edite su retardo y duración en la subventana Tiempo de objetos. En la subventana Fuente de luz, configure las longitudes de onda y las intensidades del objeto.
Asegure una longitud de onda e intensidad idénticas para todos. Para evitar la superposición del efecto de dos o más estimulaciones, establezca diferentes horas de inicio para cada objeto o varíe el retraso entre ellos en función del resultado esperado. A continuación, en la ventana Línea de tiempo, cambie la secuencia en la que se activará cada objeto de estimulación si es necesario.
Configure la secuencia de estimulaciones en un patrón regular o aleatorio según el experimento. Después de cargar la secuencia en el sistema, configure el número de ciclos de secuencia o ejecuciones que realizará el sistema en la subventana Secuencia. Para medir los cambios de fluorescencia de la célula estimulada, coloque las regiones de interés en el software de imágenes en las posiciones deseadas.
Comience a adquirir imágenes de fluorescencia. Finalmente, presione Reproducir en la ventana UGA-42 para comenzar a estimular las células. Observe los haces de estimulación reales que también pueden ser capturados por la cámara y su correlación con los objetos de estimulación.
Observe solo el cambio en la intensidad de la traza verde, que muestra el aumento en la concentración cíclica de AMP medida por el sensor. Esto ocurre específicamente cuando el haz llega a una parte de la célula con la cantidad mínima de bPAC-nanoluciferasa. La fluorescencia YFP de H208 se utilizó para determinar la posición del núcleo.
Se utilizó una región de interés que cubre todo el núcleo para medir los cambios en la relación FRET del sensor H208 debido a la estimulación en los puntos azules indicados. Esto reveló que los aumentos transitorios en el AMP cíclico ocurrieron solo cuando la luz azul se dirigió a las áreas que contenían la bPAC-nanoluciferasa. Esto confirmó que la bPAC-nanoluciferasa dirigida a la energía nuclear se expresaba exclusivamente en el compartimento nuclear de las células HC-1.
