Die Autoren bedanken sich bei Nicole M. Nemeth (University of Georgia) und Jeanne M. Fair (LANL) für ihre Hilfe bei der Ernte Hühnerfleisch danken und Steven A. Springer für seine Hilfe während der Dreharbeiten. Die Betreuung aller Vögel in dieser Studie war in Übereinstimmung mit National Institutes of Health Leitlinien für die humane Nutzung von Labortieren und alle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Formate Ausschüsse am Los Alamos National Security, LLC, Betreiber des Los Alamos zugelassen National Laboratory unter Vertrag Nr. DE-AC52-06NA25396 mit dem US Department of Energy. Die Pflege der Mäuse in dieser Studie ist in Übereinstimmung mit UCSD Tier zugelassenen Protokolls. Menschliche Gewebe wurden als Teil der UCSD zugelassenen IRB-Protokoll erhalten. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse 118.645 von der University of California Lab Fee President Program (PG) und Grant NS047101 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Neuroscience Microscopy Gemeinsame Facility, UC San Diego) unterstützt.

Ein. Tissue Einbettung in Oktober <ol><li> Vorbereiten einer Gefrierbad durch Zugabe von Trockeneis zu 2-Methyl-butan in einem flachen Styrobox. </li><li> Ernten das Gewebe, und sanft auf einem Papiertuch feucht, um überschüssige Flüssigkeit zu trocknen. Bei der Verwendung von Snap-gefrorenem Gewebe (Gewebe, das in flüssigem Stickstoff eingefroren wurde), lassen Sie das Gewebe zu erwärmen bis -20 ° C, indem Sie es in einem Kryo-Mikrotom Kammer. </li><li> Fügen Sie eine kleine Menge von Oktober an die Peel-A-Way Gefrierformbeutel, gerade genug, um den Boden der Form bedecken. </li><li> Platzieren des Gewebes in der Form sicherstellen, das Gewebe auf der Unterseite der Form wird bei der gewünschten Orientierung ruhte. Sobald eingefroren wird der Gewebeblock entweder von unten oder von der Seite geschnitten. </li><li> Bedecken Sie das Gewebe mit Oktober und die Form in der eisigen Bad. Die OCT-Verbindung wird weiß, wenn das Gewebe gefriert. </li><li> Einmal eingefroren, ziehen Sie die Form aus dem gefrorenen Block und in einer deutlichen Gefrierbeutel. </li><li> Die gefrorenen Blöcken gehalten werden kannbei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Tissue Schnitte <ol><li> Ort Gewebeblöcke in der Kryo-Mikrotom Kammer, und es ihnen zu -20 ° C (ca. 30 min) zu erreichen. </li><li> Schneiden Sie ein 3-5 um dicken Abschnitt und legen Sie eine positiv geladene Objektträger aus Glas auf der Oberseite des Profils. Das Gewebe wird auf der Folie haften. </li><li> An der Luft trocknen Gewebe für 30-60 min. </li><li> Die Folien können in dieser Phase verwendet werden, oder sie können bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung aufbewahrt werden. </li></ol> 3. Immunhistochemie <ol><li> Folien, die bei -80 ° C wurden: Die Objektträger zu tauen und an der Luft trocknen bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Befestigen Sie die Folien mit 10% gepuffertem Formalin für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Dreimal in PBS oder TBST-Puffer, für jede Wäsche tauchen die Folien 10 Mal in 250 ml Puffer. PBS Puffer kann Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden, aber für chromogenen Nachweis mit alkalischer Phosphatase-conjugated Antikörper, TBST sollte, da das Phosphat in PBS verwendet werden hemmt Aktivität der alkalischen Phosphatase. </li><li> Gewebeschnitte Dias können nun gefärbt werden. </li></ol> 4. Mit histochemische Färbungen wie Alcianblau und Periodic Acid Schiff um Schleim Detect <ol><li> Alcianblau Fleck: <ol><li> Spülen Sie die Dias in Wasser, 3% Essigsäure inkubieren 3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Verfärbung mit Alcianblau pH 2,5 für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Slides in fließendem Leitungswasser für 10 min, in DI Wasser spülen. </li><li> Gegenfärbung in Nuclear Fast Red für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Wash gleitet dreimal in DI-Wasser. </li></ol></li><li> Periodic Acid Schiff Fleck: <ol><li> Spülen der Folien in Wasser, frisch zubereiteten 1% Perjodsäure für 5 min inkubiert. </li><li> Dreimal in DI Wasser, einmal in MilliQ Wasser tauchen. </li><li> Fleck mit Schiff-Reagenz für 15 min bei Raumtemperatur temperaturE. </li><li> Waschen Sie die Slides in fließendem Leitungswasser für 10 min, in DI Wasser spülen. </li><li> Gegenfärbung Hämatoxylin im Surgipath für 30 sec bei Raumtemperatur. </li><li> Wash gleitet dreimal in DI-Wasser. </li><li> Inkubieren 30 sec in Scotts Leitungswasser bei Raumtemperatur. </li><li> Dreimal in DI-Wasser. </li></ol></li><li> Entwässern und deaktivieren Dias durch Inkubation 1 min in 95% Ethanol, durch drei schnelle Änderungen in 100% Ethanol und drei Änderungen in Citrisolv, 2 min jeweils gefolgt. Alle bei Raumtemperatur. </li><li> Montieren Sie gleitet auf Deckgläsern mit harzigen Medium (Cytoseal 60). </li></ol> 5. Mit Lektine und Antikörper (Tabelle 1) Glycan Epitope durch histochemische Methoden erkennen <ol><li> Zur Fluoreszenzdetektion von drei Epitope Glykan mit Lektinen, blockieren die Folien mit 1% BSA in PBS für 10-30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Da ein biotinyliertes Lectin verwendet wird, zu blockieren endogenes Biotin durch Inkubation 15 min mit 0,1%Avidin, gefolgt von 15 min Inkubation mit 0,01% Biotin bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Slides in PBS nach jedem Schritt des Blockierens. </li><li> Frisch zubereiten eine Mischung aus 1 ug / ml Rhodamin-konjugierten succinylierte Weizenkeimagglutinin (sWGA), 1,3 pg / ml biotinylierten Sambucus nigra Agglutinin (SNA) und 5 ug / ml Fluorescein-konjugierten Jacalin in HEPES / NaCl-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7,5). </li><li> Objektträger auf eine ebene Fläche oder in einer Färbung Feld und das Lektin Schicht Mischung auf die Oberseite. Die Mischung Volumen durch sanftes Auflegen Parafilm auf die Flüssigkeit verringert werden kann, flacht die Parafilm die Flüssigkeit und verhindert die Verdunstung. </li><li> Inkubieren 1 Std bei Raumtemperatur in Dunkelheit. </li><li> Wasch gleitet dreimal mit PBS. </li><li> Schicht Objektträger mit 0,7 ug / ml Streptavidin-konjugierten CY5 (um die biotinylierten-SNA erkennen), und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Wasch gleitet dreimal mit PBS. </li><li> Gegenfärbung Kerne mit 0,1 &amp; mu; g / ml DAPI. </li><li> Montieren gleitet auf Deckgläschen mit wässrigen Medium wie VectaMount Eindeckmitteln (oder irgendwelche wäßrigen Medien). </li></ol> 6. Controlling für Lectin Färbung Spezifität <ol><li> Lectin Färbung Spezifität wird entweder durch spezifische enzymatische Spaltung von Ziel-Glycan Epitop vor der Färbung oder durch die Konkurrenz mit kleinen Molekülen gesteuert. </li><li> Enzymatische Spaltung zur Sambucus nigra-Agglutinin (SNA) Bindungsspezifität <ol><li> Verdünnte Arthrobacter ureafaciens Sialidase (AUS) auf 250 mU / ml in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5. </li><li> Fügen Sie Wasser auf den Boden eines leeren Tip-Box, wird dies eine feuchte Kammer während der Inkubation bilden. </li><li> Die Objektträger offen auf den obersten Boden der Tip-Box, Schicht 150-200 ul AUS Lösung auf dem Objektträger geben und mit einem Deckglas. Vermeiden Luft Blasenbildung. </li><li> Schließen Sie die Box-Deckel und bei 37 ° C für 2,5 Stunden. </li><li> Wash gleitet dreimal in PBS bei Raumtemperaturtur, um alle freien Sialinsäuren zu entfernen. Diese Folien sollten für SNA-Färbung negativ. </li></ol></li><li> Kompetitive Inhibitoren für Jacalin und succinylierte Weizenkeimagglutinin (sWGA) Spezifität <ol><li> Aliquot 200 ul der Lektin Gemisch in Schritt 5,4 bis zwei Eppendorf Phiolen hergestellt. </li><li> Hinzufügen 200 mM Melibiose (Jacalin Inhibitor) zu einem der Fläschchen und Chitin-Hydrolysat bei 1:10 Verdünnung (sWGA Inhibitor) zur anderen Ampulle. </li><li> Overlay Negativkontrolle Objektträger mit dem Hemmer-enthaltenden Mischung, Inkubation 1 h bei Raumtemperatur an der gleichen Zeit wie der Rest der Folien. Diese Folien sollten für Jacalin oder sWGA Färbung negativ sind. </li></ol></li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Ein Vergleich zwischen Gewebeproben in Paraffin gefrorenen Gewebe in Cryo-Schutzmittel Medien (OCT) Embedded Embedded zeigte auffälliger Unterschied in der Erhaltung und Qualität der Färbung für Mucin Glykoproteine. Gewebefärbung mit histochemischen Farbstoffe, wie Alcianblau und Periodic Acid Schiff, sehr unterschiedliche Ergebnisse in vergleichbaren Gewebeschnitten von gefrorenen oder in Paraffin eingebettete Proben (Abbildung 1). Es scheint, dass das organische Lösungsmittel (Xylol oder Citrisolv), die während der Paraffineinbettung Verfahren verwendet wird, beeinflusst die Verteilung des sekretierten Schleimstoffe auf Epithelien sowie Entfernen viel der Glycolipide von den Proben (Abb. 2). Als Ergebnis erscheint die Schleimschicht stürzte auf die Schleimhaut-Zellen und wird vor allem in Becherzellen gefunden. Flash Einfrieren von Gewebe in Cryo-Schutzmittel Medien (Oktober) gehalten Probe Feuchtigkeit und bewahrt die sezernierte Muzine Schicht Dimensionen. Die Paraffineinbettung Prozess betroffen anderen Schleim-assoziierten Glykane und Glykolipide in ähnlicher Weise. Glycan Verteilung wurde mittels Lektinen, die routinemäßig für Glycan Detektion verwendet werden (Abbildung 3) und Antikörper gegen Epitope gefunden aufMucinen und Glykolipide (Abbildung 6). Weil Lektinbindung ist nicht gut definiert und wird durch die räumliche Verteilung der Glycane sowie die Glycanstruktur 14,15 führt, ist es wichtig, die entsprechenden Steuerungen für Lectin Färbung anzuwenden. Hier zeigen wir zwei Methoden zur Steuerung Lektin Färbung auf den getesteten Geweben: enzymatische Spaltung und kompetitive Hemmung. Spaltung der Glycan Epitope wurde durch Verdauen des Gewebeschnitts mit Glycan-spezifischen Enzymen geschieht beispielsweise bakterielle Sialidase als Kontrolle für Sialinsäure-Bindung durch SNA (Abbildung 4). In Fällen, in denen spezifische Enzym (zB Glycosidase) nicht zur Entfernung des Glycan Epitop untersucht verfügbar, können Lectin Spezifität durch Zugabe eines kompetitiven Inhibitors wie Melibiose für Jacalin Färbung oder Chitin-Hydrolysat zur sWGA Färbung (Abbildung 5) bestätigt werden. Wir zeigen hier, dass Snap-gefrorenen Gewebeproben, die rou sindtinely in der Klinik und in Forschungslabors erhalten, können weitere in OCT eingebettet werden und verwendet werden, um Mucin-Glycoproteinen und die vielen Glykane derzeit auf sie zu studieren. <table border="1"><tbody><tr><td> Lectin / Ab </td><td> Quelle </td><td> Wichtige Spezifität </td></tr><tr><td> LFA </td><td> Limax flavus (Gelbe slug) </td><td> Terminal Sia </td></tr><tr><td> MAA * </td><td> Maackia amurensis (Amur Maackia) </td><td> Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-sulfat zu Gal &amp;bgr; 1-R </td></tr><tr><td> SNA </td><td> Sambucus nigra (Holunder) </td><td> Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc </td></tr><tr><td> WGA </td><td> Triticum vulgaris (Weizenkeime) </td><td> GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / Sia </td></tr><tr><td> sWGA </td><td> Succinylierte Triticum vulgaris (Weizenkeime) </td><td> GlcNAc &amp; beta, 1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> PNA </td><td> Arachis hypogaea (Erdnuss) </td><td> Gal &amp;bgr; 1-3GalNAc (unmodifiziert T-Antigen) </td></tr><tr><td> Jacalin </td><td> Artocarpus integrifolia (Jacalin) </td><td> Gal &amp;bgr; 1-3GalNAc am O-Glycane gefunden </td></tr><tr><td> ECA </td><td> Erythrina cristagalli (Coral tree) </td><td> Gal &amp;bgr; 1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> TKH2 </td><td> Antikörper </td><td> Siaa2-6GalNAc (STN) auf O-Glycane </td></tr><tr><td> CA19-9 </td><td> Antikörper </td><td> Siaa2-3Galβ1-4 (FUCA1-3) GlcNAc (SLe a) </td></tr><tr><td> SNH3 </td><td> Antikörper </td><td> Siaa2-3Galβ1-3 (FUCA1-4) GlcNAc (SLe x) </td></tr></tbody></table> Abkürzungen: Ab, Antikörper; Sia, Sialinsäure, Gal, Galactose, GalNAc, <em&gt; N-Acetylgalactosamin; GlcNAc N-Acetylglucosamin; Fuc, Fucose; STn, Sialyl Tn; SLe a, Sialyl Lewisa; SLe x, Sialyl Lewis x ist. * Kommerzielle Quellen für MAA gehören MALI, Malii &amp; MAH. Tabelle 1. Eine unvollständige Liste von Lektinen und Antikörpern für Glykan Epitope. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig1.jpg" /> Abbildung 1. Alcianblau und Periodic Acid Schiff-Färbung von gefrorenen und in Paraffin eingebetteten Doppelpunkt Gewebe. Gewebeschnitte von Mensch, Maus oder Huhn Doppelpunkt Proben in OCT (oberes Feld) eingefroren oder in Paraffin eingebettet (unten) wurden mit Periodic Acid Schiff (PAS) gefärbt oder Alcianblau (AB). Diese Reagenzien Flecken Schleim rosa oder blau sind. Oben: Im gefrorene Gewebe, zusätzlich zu Mucinen bei Becherzellen war sezernierten Schleim auch visIVK (Pfeile). Unten: In Paraffin eingebettete Gewebe wurde Schleim Färbung zu Becherzellen beschränkt. Zellkerne wurden mit Surgipath (PAS) oder Mayers (AB) Hämatoxylin gegengefärbt. Maßstab zeigt 100 um. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3928/3928fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig2.jpg" /> Abbildung 2. Citrisolv Inkubationszeit führt zu erheblichen Verlust der Schleimstoffe. Serielle Schnitte von gefrorenem Hühnerfleisch Ileum Proben wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert und gehalten hydratisiert (links), in Ethanol dehydriert durch sequentielle Inkubation in 70%, 90% und 100% Ethanol für 20 min each (Mitte), oder in Ethanol dehydriert und gelöscht mit Citrisolv für 1 h (rechts). Dehydratisierten Proben wurden zurück in PBS vor Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) oder Alcianblaufärbung rehydratisiert. Ethanol Austrocknung und Citrisolv Clearing verbesserten Gewebe morMorphologie (zB, obere Reihe, Mitte und rechts Bildern gegenüber linkes Bild). Ethanol Dehydration hatte keinen signifikanten Einfluss auf Alcianblaufärbung (mittlere Reihe, zu vergleichen, linke und mittlere Bilder). Im Gegensatz dazu verringert Citrisolv Inkubation Alcian-Blau-Färbung und beschränkt es Becherzellen (mittlere Reihe, rechtes Bild) in einem Muster, ähnlich dem in Paraffin eingebetteten Gewebe (Abbildung 1) ersichtlich ist. Diese Daten implizieren, dass die starke Färbung von Schleim Granulat in Paraffin eingebettete Proben aufgrund schrumpfender und Kondensieren von Schleim in den Becherzellen bei der Räumung Schritt ist. Die schwächer und weniger dichte Färbung von Schleim in eingefrorenen Oktober eingebetteten Geweben spiegelt eine natürliche Verteilung der Schleim in das Gewebe. Höhere Vergrößerungen boxed Bereiche sind mit Pfeilen markiert. Maßstab Balken zeigen 50 um (oberen und mittleren Zeile) und 10 um (untere Reihe). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bindung vonLektine Glykan Epitope auf gefrorenem und Paraffin eingebetteten Geweben. Chicken Dünndarm (Ileum) Proben in OCT (oben) eingefroren oder in Paraffin eingebettet (unten) wurden mit Jacalin (blau), sWGA (grün) und SNA sondiert (rot ). Höhere Vergrößerungen boxed Bereiche sind mit Pfeilen markiert. In gefrorenen Geweben Jacalin Bindung an O-Glycane offenbart Strukturen, die von Becherzellen werden Nässen in das Lumen (Jacalin, oberes Feld, Pfeile) erschienen. Im Gegensatz dazu wurde Jacalin Bindung an Paraffin-eingebetteten Geweben zu Becherzellen (Jacalin, unteres Feld, Pfeile) und die Zotten Bürstensaum (untere linke Bild, Pfeil) beschränkt. sWGA Färbung von β1-4GlcNAc teilweise mit der Bindung von Jacalin Lectin in beiden gefrorene Gewebe (oberes Feld, Pfeile) co-lokalisiert, und in Paraffin eingebettete Gewebe (unteres Feld, Pfeile). Im Gegensatz dazu ist die Bindung an Lectin SNA α2-6 verknüpft Sialinsäuren intrazelluläre (SNA, Pfeilspitzen) und nicht kolokalisieren mit Jacalin (FarbeBild SNA rot markiert mit einer Pfeilspitze, Jacalin in blau mit gestrichelten Pfeil markiert). Maßstab Balken zeigen 100 um (linke Bilder) und 20 um (vergrößert boxed Bereiche). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig4.jpg" /> Abbildung 4. Enzymatische Spaltung Steuerung für Sialinsäure Färbung mit SNA. Huhn Dünndarm Proben wurden mit 250 mU / ml Arthrobacter ureafaciens Sialidase (AUS) oder mit 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,5 und 2,5 h bei 37 ° C inkubiert AUS Behandlung schafft Färbung mit biotinylierten SNA, bestätigt SNA Bindungsspezifität an Sialinsäuren. Maßstab zeigt 100 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig5.jpg" /> Abbildung 5. Steuerung für kompetitive Hemmung Glycan Färbung mit Jacalin und sWGA. Huhn Dünndarms (Ileum) Proben wurden mit einem Jacalin und sWGA Mischung in Gegenwart von spezifischen lec inkubierttin-Hemmer: Melibiose (mittlere Spalte), Chitin-Hydrolysat (rechte Spalte) oder ohne Inhibitor (A und D). Oben: (links) Jacalin Färbung ohne Inhibitoren. (Mitte) Jacalin Färbung wurde durch Melibiose gehemmt. (Rechts) Chitin-Hydrolysat nicht hemmen Jacalin Färbung. Unten: (links) sWGA Färbung ohne Inhibitor. (Mitte) Melibiose nicht hemmen sWGA Färbung. (Rechts) sWGA Färbung wurde von Chitin-Hydrolysat gehemmt. Diese Hemmung bestätigt die spezifische Interaktion von Lektinen mit den Geweben. Sternchen markieren Bild Färbung Hemmung. Maßstab zeigt 100 um. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig6.jpg" /> Abbildung 6. Nachweis von sekretorischen Mucinen, Glykolipide und Glycan Epitope in gefrorenen menschlichen Dickdarmkrebs Geweben. Darmkrebs Biopsien von villöse Karzinom und Schleimhäute Karzinom wurden schockgefroren in flüssigem Stickstoff und eingebettet in Oktober Gewebeschnitte wurden für 1 h inkubiertmit Antikörpern gegen die sekretierten Mucin MUC5AC, Sialyl-Lewis a - Glycan Epitop auf Ganglioside (Darmkrebs Marker CA 19-9) gefunden, und Sialyl-Tn - vollflächiger Glycan Epitop auf Mucinen (detektiert mit TKH2 Antikörper), um 30 min Inkubation mit gefolgt biotinylierte Esel-Anti-Maus-IgG-sekundärem Antikörper, und 30 min Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Streptavidin. Zusätzliche Gewebe wurden für 1 Stunde mit dem biotinylierten Lektine SNA und sWGA inkubiert, gefolgt von 30 min Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Streptavidin. Peroxidasefärbung wurde entwickelt, mit AEC-Kit. Schwarz Maßstab zeigt 200 um.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Konservierung von Schleim und Glycan Epitope in gefrorenen Geweben ist besser als die der Gewebe, die in Paraffin eingebettet waren. Wir haben gezeigt, die Erhaltung von sekretiertem Schleimschicht (1 und 3) und der Verteilung von drei Glycane Strukturen (Abbildung 3) in gefrorenen Geweben verglichen mit Paraffin eingebetteten Geweben. Spezialisierte Fixiermittel, wie Carnoys Lösung (60% Ethanol, 30% Chloroform, 10% Essigsäure) 17 sind für eine optimale Konservierung der Schleimschicht in Gewebeproben entwickelt. Optimalerweise sollte diese Lösung verwendet, um Gewebeproben für Schleim Studien gewidmet sind einzuziehen und wurde gezeigt, dass die glatte Aussehen Schleimschicht 16-17 erhalten. Die Schleimschicht in unfixierten eingefrorenen Proben in den Oktober eingebettetes robust und in einigen Bereichen kann aus dem Gewebe lösen, aber die gesamte Schichtdicke ist in Übereinstimmung mit dem im Gewebe, die mit Carnoy-Lösung und einbetten behoben wurden beobachteted in Paraffin 16-17. Zum Beispiel ist die Schleimschicht in gefrorener Gewebeschnitt menschlichen Dickdarm ~ 100 um (Abbildung 1), die innerhalb des Bereichs für Carnoy&#39;s-fixierten humanen Kolons Probe 55,4 ± 2,5 um (Bereich 7,7 bis 204,8 um) beträgt 16 gemeldet. Es ist seit Jahrzehnten bekannt, dass Ethanol Dehydratisierung Ergebnisse in ~ 30% Schrumpf von biologischen Proben 18 und dass organische Lösungsmittel, wie Xylol, Proteine ​​Citrisolv und Chloroformextrakt Lipide, Glykolipide und, in gewissem Maße von den Geweben 13. Tissue-Verarbeitung für Paraffineinbettung umfasst die folgenden Schritte: Fixierung (10% gepuffertem Formalin), Dehydration (steigende Ethanol-Konzentration) und Clearing (Citrisolv oder Xylol). Durch Nachahmung diese Schritte auf unfixierten gefrorenen Gewebeschnitten, zeigten wir, dass Citrisolv Schleim von Gefrierschnitten wodurch Gewebemorphologie die ähnlich derjenigen von in Paraffin eingebetteten Geweben ist extrahiert (Figure 2, rechts). Im Gegensatz dazu wurde die Schleimschicht nicht durch Inkubation mit Formalin oder Ethanol (Abb. 2, links und Mitte-Panels) verändert. Dies deutet darauf hin, dass das Clearing Schritt von Standard Paraffineinbettung Verfahren, das verlängerte Inkubationszeit erfordert in Citrisolv / Xylol, führt zum Kollabieren der Schleimschicht. Formalinfixierung nicht beschädigt Schleimschicht und gefrorenen Gewebe Abschnitte, die mit Formalin fixiert wurden, können leicht mit Lektine und Antikörper gegen Glykane, Glykolipide und Proteine ​​(Abbildungen 2, 3 und 6) gefärbt werden. Diese Effekte vernachlässigbar sein für das Studium der membrangebundenen Proteine ​​und Gewebepathologie, aber sie sind für hochhydratisierten Strukturen wie der sezernierte Schleimschicht verheerend. Jedoch histologische Untersuchungen von Mucinen noch meist mit Paraffin eingebettete Proben, bei der die Schleimschicht Konservierung nicht optimal durchgeführt. In eingehenden Analysen der Schleimschicht Zusammensetzung wie die genaue Identität secreted oder membrangebundene MUC Glykoprotein Kombinationen erfordern spezifische Antikörper und Massenspektrometrie zur Identifizierung der Protein-Backbones. Erhaltung der Schleimschicht ist aber die anfängliche Anforderung für solche Studien. Vielen Laboratorien haben Gewebeproben in OCT eingefroren, die in der Vergangenheit für verschiedene Projekte wurden gesammelt, können diese Gewebe ohne weiteres eingesetzt werden zu Mucinen, Glykolipide und Glycan Verteilung entfällt die Notwendigkeit, Geweben in spezielle Fixiermittel, der einzigartig für Schleim Konservierung entworfen sammeln studieren. Gefrorenem Gewebe unterziehen minimale Verarbeitung und somit die natürliche Verbreitung der Glykane, die hydratisiert in der Natur sind, wird beibehalten. Dies ist besonders wichtig in dem Bereich der mikrobielle Wirt-Wechselwirkungen. Kenntnisse der naturalistischen Verteilung und Häufigkeit von sezernierten Muzine und die vielen Glykanstrukturen schmücken diese &quot;Barriere&quot; Moleküle werden der Schlüssel für das Verständnis Immunabwehr, mikrobielle Ausbeutung und Erregerist.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen von Reagenz und Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 2-Methylbutan </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03551-4 </td></tr><tr><td> AEC Peroxidasesubstrat Kit </td><td> Vector Labs </td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td> Alcianblau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3157 </td></tr><tr><td> Anti-CA 19-9 monoklonalen Antikörpers </td><td> Calbiochem </td><td> CA1003 </td></tr><tr><td> Anti-MUC5AC monoklonaler Antikörper </td><td> Millipore </td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td> Avidin-Biotin Blocking Kit </td><td> Vector Labs </td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td> Biotinylierte Esel-Anti-Maus-Antikörper </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 90863 </td></tr><tr><td> Biotinylated SNA </td><td> Vector Labs </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> Rinderserumalbuminmin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Chitin-Hydrolysat </td><td> Vector Labs </td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td> Kryostatmikrotom </td><td> Leica Microsystems </td><td> Leica CM 1800 </td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> Surgipath Medical Ind. </td><td> 3801570 </td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid 30% </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325-100 </td></tr><tr><td> Jacalin-FITC </td><td> Vector Labs </td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td> Mayers Hämatoxylin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MHS32 </td></tr><tr><td> Melibiose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5500 </td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Vector Labs </td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> OCT-Verbindung </td><td> VWR International </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Peroxidase konjugiertem Streptavidin </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 94638 </td></tr><tr><td> Schiff-Reagenz </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 26052 </td></tr><tr><td> sWGA-Rhodamin </td><td> Vector Labs </td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> TKH2 monoklonalen Antikörpers </td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount wässrigen Eindeckmittel </td><td> Vector Labs </td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 8310-4 </td></tr><tr><td> Peel-A Way Formen </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

using unfixed, frozen tissues to study natural mucin distribution

Mucine sind komplex und stark glykosyliert O-verknüpften Glykoproteine, die mehr als 70% Kohlenhydrate enthalten Gew. 1-3. Sezernierten Muzine, produziert von Becherzellen und der Magenschleimhaut, bieten das Gerüst für eine Mikrometer dicke Schleimschicht, die Linien der Epithelien des Darms und der Atemwege 3,4. Neben Mucinen, Schleim Schichten enthalten auch antimikrobielle Peptide, Cytokine und Immunglobuline 5-9. Die Schleimschicht ist ein wichtiger Teil der Host angeborenen Immunität und bildet die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen 8,10-12. Als solche, die Schleim unterliegen zahlreichen Interaktionen mit Mikroben ist, bilden beide Pathogene und Symbionten, und sezernierten Muzine eine wichtige Schnittstelle für diese Wechselwirkungen. Die Untersuchung solcher biologischen Wechselwirkungen Regel beinhaltet histologischen Methoden zur Gewebesammelbeutel und Färbung. Die beiden am häufigsten verwendeten histologischen Methoden für die Gewebe-Sammlung und preservation in der Klinik und in Forschungslabors sind: Formalinfixierung durch Paraffineinbettung folgte, und Gewebe Gefrieren, gefolgt von der Einbettung in Cryo-Schutzmittel Medien. Paraffin eingebetteten Gewebeproben erzeugen Schnitte mit optimalen Eigenschaften für die histologische Visualisierung mit Klarheit und gut definierten Morphologie. Jedoch während des Einbettungsprozesses Paraffin mehrere Epitope verändert werden, und um diese Epitope zu studieren, Gewebeschnitte weiter mit einer von vielen Methoden Epitopdemaskierung 13 verarbeitet werden müssen. Sekretiert Mucinen und Lipiden aus dem Gewebe während der Einbettung in Paraffin Lichtung Schritt, der zu verlängern Inkubation mit organischen Lösungsmitteln (Xylol oder Citrisolv) erfordert extrahiert. Daher ist dieser Ansatz nicht optimal für Studien, die die Art und Verteilung der Mucinen und Schleim in vivo. Im Gegensatz dazu die Einbettung Gefrierpunkt Gewebe Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium einHohlräume Austrocknung und Aufhellung der Probe und unterhält die Probe Feuchtigkeit. Dies ermöglicht eine bessere Konservierung des hydratisierten Schleimschicht, und ermöglicht somit die Untersuchung der zahlreichen Rollen der Mucine in epithelialen Biologie. Da diese Methode erfordert minimale Verarbeitung des Gewebes wird das Gewebe in einem natürlichen Zustand belassen. Deshalb eingefroren Geweben Abschnitte erfordern keine zusätzliche Verarbeitung vor der Färbung und können leicht analysiert werden mittels Immunhistochemie Methoden. Wir zeigen die Erhaltung Mikrometer dicken ausgeschieden Schleimschicht in gefrorenem Doppelpunkt Proben. Diese Schicht wird drastisch reduziert, wenn die gleichen Gewebe in Paraffin eingebettet sind. Wir zeigen auch Immunfluoreszenzfärbung von Glykan Epitope auf Schleimstoffe mit Pflanzenlektinen vorgestellt. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es erfordert nicht die Verwendung von speziellen Fixiermittel und ermöglicht die Verwendung gefrorenen Gewebe, die bereits im Labor aufbewahrt werden kann.

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Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Unfixierter gefrorenen Gewebeproben in Optimal Cutting Temperatur Medium (OCT) eingebettet werden verwendet, um natürliche Verteilung und Glykosylierung von sezernierten Schleim zu studieren. Bei diesem Ansatz Gewebe-Verarbeitung ist minimal und die natürliche Darstellung der Glycolipide, Schleimstoffe und Glykan-Epitope erhalten. Gewebeschnitte können immunhistochemisch mittels Fluoreszenz oder chromogener Detektion analysiert werden.

Mit Unfixierter, Frozen Tissues Natural Mucin Verteilung Studie

Mucins are complex and heavily glycosylated O-linked glycoproteins, which contain more than 70% carbohydrate by weight1-3. Secreted mucins, produced by ...

using-unfixed-frozen-tissues-to-study-natural-mucin-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

47.5K Aufrufe.  University of California, San Diego. Unfixierter gefrorenen Gewebeproben in Optimal Cutting Temperatur Medium (OCT) eingebettet werden verwendet, um natürliche Verteilung und Glykosylierung von sezernierten Schleim zu studieren. Bei diesem Ansatz Gewebe-Verarbeitung ist minimal und die natürliche Darstellung der Glycolipide, Schleimstoffe und Glykan-Epitope erhalten. Gewebeschnitte können immunhistochemisch mittels Fluoreszenz oder chromogener Detektion analysiert werden.

Serie: Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Computer-Generated-Tiermodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to employ reverse genetics have not yet been adequately developed to assess gene function in regeneration or tissue homeostasis during larval stages after zebrafish embryogenesis, and several tissues within the zebrafish larva are difficult to target. Intraventricular injections of gene-specific morpholinos offer an alternative method for the current inability to genomically target zebrafish genes in a temporally controlled manner at these stages. This method allows for complete dispersion and subsequent incorporation of the morpholino into various tissues throughout the body, including structures that were formerly impossible to reach such as those in the larval caudal fin, a structure often used to noninvasively research tissue regeneration. Several genes activated during larval finfold regeneration are also present in regenerating adult vertebrate tissues, so the larva is a useful model to understand regeneration in adults. This morpholino dispersion method allows for the quick and easy identification of genes required for the regeneration of larval tissues as well as other physiological phenomena regulating tissue homeostasis after embryogenesis. Therefore, this delivery method provides a currently needed strategy for temporal control to the evaluation of gene function after embryogenesis.&#160;

An adaptable reverse genetic method for zebrafish to assess gene function during later stages of development and physiological homeostasis such as tissue regeneration using intraventricular injections of gene-specific morpholinos.

Rückwärts Genetische Morpholino Ansatz mit Herz ventrikuläre Injektion auf mehrere Schwer zu Zielgeweben in der Zebrafisch-Larve Transfektion

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

Hochdurchsatz-Analyse von Bild Tumorsphäroide: Eine benutzerfreundliche Software-Anwendung, um die Größe der Sphäroide automatisch und präzise messen

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Verwenden von Maus-Brusttumorzellen Kern Biology Concepts Lehren: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Verwenden von Caco-2-Zellen, die Lipidtransport Studie der Darm

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucin Agarose-Gel-Elektrophorese: Western Blotting für Hochmolekulare Glykoproteine


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address existing knowledge gaps. This protocol represents a demonstrated method for nondestructively sampling rare butterflies for population genetic structure or DNA barcoding analyses. It uses the chorion of hatched butterfly ovae to yield sufficiently high quantity and quality DNA for successful gene sequencing to confirm species identity and quantify genetic variation. It may be particularly useful when other tissue sampling techniques are impractical or unavailable. While developed for a lepidopteran, it nonetheless could easily be adapted for use with other insect species. It was specifically designed with ease of use as a goal to help maximize broad implementation by individuals of varying experience and skill levels, such as community scientists, conservation practitioners, and students, and for use over large geographic areas to facilitate broad population sampling. The data generated can help inform taxonomic and listing decisions, conservation and management actions, and enhance basic ecological research.

Here, we present a straightforward protocol for noninvasive genetic sampling of butterfly populations based on the field collection of residual egg debris. It can be used to confirm species identity and quantify genetic variation. This protocol can be easily adapted to broader groups for community science involvement.

Einsatz von Community-Wissenschaftlern zur Durchführung zerstörungsfreier genetischer Probenahmen seltener Schmetterlingspopulationen

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Isolierung und Profilierung einzelner Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

Author Spotlight: Enhancing Drug Discovery - Entwicklung automatisierter, standardisierter Protokolle für die Zellkernextraktion aus gefrorenem Gewebe 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.

Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung