Die Autoren danken USDA-NIFA für die finanzielle Unterstützung (Fördernummern 2018-67013-28489 und 2020-70410-32901). Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Manuskript zum Ausdruck gebracht werden, sind ausschließlich die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten des US-Landwirtschaftsministeriums wider. Wir danken der brasilianischen Gaststudentin von Science Without Borders, Mayara de Silva, für die Bilder, die in Abbildung 6A und in Abbildung 7D zu sehen sind. Wir danken auch der Abteilung für Pflanzenpathologie an der University of Kentucky für den Zugang zu den konfokalen Mikroskopen von Olympus.

HINWEIS: Der Workflow für die Methode ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig01.jpg"> Abbildung 1: Schritte des optimierten Impfprotokolls mit abgelösten Maisblatthüllen. Die Herstellung der Sporensuspension, die Inokulation der Blattscheide und die Probenvorbereitung für die Lebendzellmikroskopie sind in grünen (A), violetten (B) bzw. orangefarbenen (C) Kästchen hervorgehoben. Erstellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
1. Pflanzen- und Pilzmaterial
<ol><li>Pflanzenwachstum<ol><li>Maissetzlinge (siehe Materialtabelle) im Gewächshaus (14 h hell/27 °C und 10 h dunkel/22 °C) in SC10-Behältern (siehe Materialtabelle) ziehen. Verwenden Sie ein Nährmedium, das aus drei Teilen handelsüblicher Blumenerde (siehe Materialtabelle) und zwei Teilen dampfsterilisierter Muttererde besteht.</li>
		<li>Gießen Sie die Setzlinge einmal täglich morgens 2 Minuten lang mit einem Überkopf-Bewässerungssystem.</li>
		<li>Ernten Sie Sämlinge im V2-Stadium, indem Sie sie auf Bodenebene schneiden. Das V2-Wachstumsstadium wird erreicht, wenn die Sämlinge 5 bis 10 cm hoch sind und zwei sichtbare Kragenblätter haben21.</li>
		<li>Wickeln Sie die Pflanzen mit einem feuchten Papiertuch ein und legen Sie sie in eine Plastiktüte, um sie zur weiteren Verarbeitung ins Labor zu transportieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Pilzkulturen<ol><li>Reaktivieren Sie gelagerte Pilz-Kieselsäure-Stammkulturen unter aseptischen Bedingungen22, indem Sie etwa 50 Körnchen der befallenen Kieselsäure auf ein geeignetes Agar-Medium streuen. Um morphologische Veränderungen und den Verlust der Pathogenität zu vermeiden, werden Subkulturstämme nicht mehr als 3x nach der Reaktivierung gezüchtet. Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA; siehe Materialtabelle) wird routinemäßig für die Kultivierung von C. graminicola verwendet, während Haferflocken-Agar (OA; siehe Materialtabelle) für S. maydis verwendet wird.</li>
		<li>Um PDA für die Kultivierung von Pilzbeständen vorzubereiten, suspendieren Sie 19,5 g kommerziell hergestelltes dehydriertes PDA in 500 ml deionisiertem (DI) Wasser. Um OA herzustellen, kochen Sie 36 g kommerziell hergestelltes dehydriertes OA 15-30 Minuten lang in DI-Wasser, filtern Sie durch drei Schichten Mulltuch und bringen Sie das Filtrat mit DI-Wasser auf 500 ml. Zu sterilisierende Medien autoklavieren.</li>
		<li>Ergänzen Sie das geschmolzene, gekühlte Medium mit einem geeigneten Antibiotikum (z. B. Hygromycin B, Geneticin), wenn Sie mit transformativen Stämmen arbeiten. Die Endkonzentrationen von Hygromycin oder Geneticin in 500 ml Medien betragen 250 μg/ml bzw. 100 μg/ml.</li>
		<li>Kulturen unter optimalen Bedingungen inkubieren, bis sich ein sporulierendes Myzel entwickelt hat. Colletotrichum graminicola und S. maydis gedeihen gut bei 23 °C bei kontinuierlichem Fluoreszenzlicht und Luftfeuchtigkeit. Die Sporulation erfolgt 7 Tage nach der Inokulation (dai) bei S. maydis bzw. 14 dai bei C. graminicola.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Impfungen der Blattscheide
<ol><li>Glaswolle-Filtereinheit<ol><li>Verwenden Sie eine schwere Schere oder Schere, um die Kappe und etwa 0,5 mm vom konischen Boden eines 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens abzuschneiden (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Legen Sie ein Stück Glaswolle (ca. 0,5 cm x 0,5 cm; siehe Materialtabelle) in das geschnittene Rohr, um das mittlere Loch abzudecken, wie in Abbildung 2 dargestellt.</li>
		<li>Tragen Sie beim Schneiden von Glaswolle Handschuhe, da Borosilikatglas Reizungen verursachen kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Blattscheiden-Stützgestellen<ol><li>Schneiden Sie eine 96-Well-PCR-Platte ohne Rand (siehe Materialtabelle) in sechs zweispaltige (8 x 2 Wells) Stützracks, wie in Abbildung 3A dargestellt.</li>
		<li>Drehen Sie die Zweisäulen-Racks um, so dass die konischen Böden der Wells nach oben und die flachen Böden nach unten zeigen (Abbildung 3B).</li>
		<li>Legen Sie jede Stütze in eine Petriplatte aus Glas, die angefeuchtetes Filterpapier enthält, und decken Sie sie mit dem Deckel ab (siehe Materialtabelle). Diese Einheit fungiert als kleine Feuchtigkeitskammer für die Hüllen.</li>
	</ol></li>
	<li>Inokulum-Präparat<ol><li>Legen Sie für jeden Pilzstamm eine zusammengebaute Glaswolle-Filtereinheit in ein intaktes, steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Letzteres fungiert als Sammelröhrchen.</li>
		<li>Beschriften Sie die Röhrchen.</li>
		<li>Entnehmen Sie Konidien aus sporulierenden Kulturen, indem Sie zuerst jede Platte mit 3-4 ml sterilem DI-Wasser fluten. In einigen Fällen kann mehr Wasser erforderlich sein, um eine Flüssigkeitsschicht auf der Kolonieoberfläche zu erzeugen. Netzmittel sind bei diesem System nicht notwendig.</li>
		<li>Lösen Sie die Sporen aus dem Agar, indem Sie einen sterilen Stößel mit konischer Spitze (siehe Materialtabelle) verwenden, um gleichmäßig über die gesamte Platte zu kratzen.</li>
		<li>1 ml der Sporensuspension aseptisch auf eine Glaswollefiltereinheit geben und die Sporen durch Schwerkraft in das Sammelröhrchen fließen lassen.</li>
		<li>Die Sammelröhrchen mit den filtrierten Sporensuspensionen werden bei 3.500 x g 5 min zentrifugiert. Die Sporen sollten am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens pelletiert werden. HINWEIS: Das Zentrifugieren von C. graminicola-Sporen mit höheren Geschwindigkeiten als hier empfohlen führt zu einem erheblichen Verlust der Lebensfähigkeit.</li>
		<li>Gießen Sie die Flüssigkeit in einen autoklavierbaren Behälter, fügen Sie 1 ml steriles DI-Wasser hinzu und rühren Sie vorsichtig, um die pelletierten Sporen zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie wie in Schritt 2.3.6.</li>
		<li>Waschen Sie die Sporen 3x, um alle Konidialmatrix zu entfernen, die Autoinhibitoren enthalten kann, die die Keimung oder Penetration verringern könnten.</li>
		<li>Nach dem dritten Waschen fügen Sie 300-500 μl steriles DI-Wasser hinzu, um die Sporen für die Quantifizierung zu resuspendieren.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Hämozytometer unter einem zusammengesetzten Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung, um die Sporenkonzentration zu bestimmen. Eine Sporenfärbung ist vor der Zählung nicht notwendig.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 5 x 105 Sporen/ml Suspension mit sterilem DI-Wasser vor. HINWEIS: Die Sporensuspension von C. graminicola kann nicht länger als 4 h bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, bevor sie schnell an Lebensfähigkeit verliert. Das Kühlen von Konidien erhöht nicht die Lebensfähigkeit.</li>
	</ol></li>
	<li>Scheiden-Impfungen<ol><li>Überprüfen Sie die relevanten Biosicherheitspraktiken und -verfahren, bevor Sie Pflanzen mit Pilzstämmen impfen.</li>
		<li>Entferne die Hülle vom ersten echten Blatt der V2-Sämlinge, indem du mit einem Daumennagel am überlappenden Rand der Scheide entlangfährst, und löse sie vorsichtig vom Trieb. Löse die Hülle von beiden Seiten des Sprosses, bevor du versuchst, sie zu entfernen.</li>
		<li>Schneiden Sie die geborgenen Blattscheiden in 3-5 cm große Segmente. Es ist nicht notwendig, die Hüllen vor der Impfung zu desinfizieren.</li>
		<li>Rollen Sie jedes Segment sehr vorsichtig ab, um die innere (adaxiale) Epidermisschicht freizulegen.</li>
		<li>Bereiten Sie die Hüllen für die Impfung vor und wickeln Sie die verbleibenden herausgeschnittenen Hüllen in ein feuchtes Papiertuch, um ein Austrocknen zu vermeiden.</li>
		<li>Geben Sie 20 μl der Pilzsporensuspension auf die Innenfläche in der Mitte des Mantelstücks, direkt über der Mittelrippe, wie in Abbildung 4 dargestellt.</li>
		<li>Legen Sie die inokulierten Blattscheiden waagerecht, mit der Mittelrippe nach unten, in die Halterung innerhalb einer Petriplatte aus Glas, die ein angefeuchtetes Filterpapier enthält, wie in Abbildung 5 dargestellt.</li>
		<li>Jedes Gestell fasst bis zu sieben Hüllen. Impfen Sie mindestens fünf Hüllen pro Stamm, um den Verlust von Replikaten zu kompensieren, der während der Probenvorbereitung oder Inkubation auftreten kann.</li>
		<li>Stellen Sie die kleinen Feuchtigkeitskammern in eine durchsichtige Aufbewahrungsbox, die mit angefeuchtetem Keimpapier ausgelegt ist (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Decken Sie die Schachtel mit dem Deckel ab. Die Box wird bei 23 °C mit kontinuierlicher Beleuchtung für den vorgesehenen Zeitverlauf bebrütet, der vom Pilz und den beobachteten Stadien der Pilzentwicklung abhängt. Eine Zusammenfassung des Zeitverlaufs für Maisschalen, die mit C. graminicola geimpft wurden, ist in Tabelle 1 enthalten.</li>
		<li>Kontrollieren Sie jeden Tag die Hüllen auf Anzeichen/Symptome von Krankheiten und halten Sie sowohl die Keim- als auch die Filterpapiere feucht. Die Blattscheiden können bis zu 6 Tage lang aufbewahrt werden, ohne dass es zu einem offensichtlichen Absterben oder Abbau der Pflanzenzellen kommt, wenn keine Inokulation durchgeführt wird.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig02.jpg"> Abbildung 2: Vorbereitung der Glaswolle-Filtereinheit. (A) Eine Glaswollekugel von 0,5 cm x 0,5 cm wird in das Mikrozentrifugenröhrchen 1 gelegt, dessen konischer Boden entfernt wurde. (B-C) Das Filterrohr wird dann in das Mikrozentrifugenröhrchen 2 gelegt, um eine zusammengebaute Filtereinheit für die Herstellung der Sporensuspension zu erzeugen. Erstellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig03.jpg"> Abbildung 3: Methode zum Schneiden einer 96-Well-PCR-Platte ohne Rand. (A) PCR-Platte, geschnitten in sechs Stützracks, 8 x 2 Wells. Ein Beispiel für eine einzelne Mantelstütze ist in (B) dargestellt. Blattscheiden werden waagerecht auf die Auflage gelegt. Erstellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig04.jpg"> Abbildung 4: Methode der Scheideninokulation. Einzelner Tropfen des Inokulums, der direkt auf die adaxiale Oberfläche des Mantelabschnitts aufgetragen wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig05.jpg"> Abbildung 5: Inkubationsmethode der Scheide. Inokulierte Blatthüllen, die horizontal in einem Stützgestell in einer Petriplatte aus Glas platziert werden, die angefeuchtetes Filterpapier enthält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
3. Lebendzell-Mikroskopie
<ol><li>Probenvorbereitung für die Mikroskopie<ol><li>Spülen Sie die Scheidenteile vorsichtig mit sterilem DI-Wasser ab, um nicht anhaftende Sporen oder oberflächliches Pilzwachstum zu entfernen.</li>
		<li>Legen Sie die Hülle auf einen sauberen Objektträger aus Glas (siehe Materialtabelle), wobei die adaxiale (innere) Oberfläche des Hülsenstücks nach unten und die abaxiale (äußere) Oberfläche nach oben zeigt.</li>
		<li>Verwende eine neue einschneidige Rasierklinge (siehe Materialtabelle), um etwa 1 cm von den Scheidenenden abzuschneiden und den größten Teil des Laminagewebes auf beiden Seiten der Mittelrippe zu entfernen.</li>
		<li>Halten Sie die Rasierklinge in einem Winkel von 90° zur Scheide, um Gewebe von der abaxialen Mittelrippe zu rasieren und die Epidermisschicht auf der adaxialen Oberfläche über der inokulierten Stelle freizulegen. Versuchen Sie, eine gleichmäßige Dicke beizubehalten. Sobald die Blattscheiden rasiert sind, wird ein weiteres Trimmen nicht empfohlen, da dies die Probe beschädigen kann.</li>
		<li>Achten Sie darauf, dass die rasierten Partien nicht größer als 1 cm x 1 cm sind. Vermeiden Sie es, während dieses Vorgangs auf die Mitte der Hülle zu drücken. Wenn Sie mit Hüllen arbeiten, die mit verschiedenen Sporensuspensionen beimpft wurden, desinfizieren Sie die Handschuhe und wechseln Sie die Rasierklinge zwischen den Proben.</li>
		<li>Halten Sie einen sauberen Objektträger aus Glas bereit. Heben Sie das Mantelteil von einer Kante ab und übertragen Sie es vorsichtig auf einen neuen Objektträger. Die inokulierte (adaxiale) Oberfläche der Hülle sollte sich oben befinden, der Objektivlinse am nächsten. Montieren Sie die Abschnitte vorsichtig, um Schäden an Pilzstrukturen zu vermeiden.</li>
		<li>Tragen Sie 60 μl steriles DI-Wasser auf die Sektion auf und fügen Sie ein 24 mm x 60 mm großes Deckglas hinzu (siehe Materialtabelle). Tun Sie dies langsam, um Luftblasen zu vermeiden.</li>
		<li>Wenn Sie für die Mikroskopie bereit sind, versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack (siehe Materialtabelle), indem Sie einen kleinen Tropfen auf jede Kante geben und die Tropfen dann mit einem Nagellackpinsel verbinden, um eine nahtlose Versiegelung zu erzielen. HINWEIS: Dieses Mantelprotokoll kann mit zytologischen Färbungen verwendet werden, z. B. 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), neutrales Rot oder Trypanblau, oder zur Beobachtung der Zellplasmolyse, um die Lebensfähigkeit von Pflanzenzellen zu bewerten. Bei Mantelfärbungen oder Zellplasmolyse-Assays darf das Deckglas nicht versiegelt werden.</li>
		<li>Für Plasmolyse-Assays wird eine hypertone Lösung (0,75 M Saccharose oder 1 M Natriumchlorid) auf einen Rand des Deckglases gegeben und die Lösung mit einem gefalteten fusselfreien Seidenpapier über die Probe zum anderen Rand des Deckglases gezogen. Verwenden Sie für die Färbung eine ähnliche Methode, um die Färbelösung aufzutragen.</li>
	</ol></li>
	<li>Weitfeld-Mikroskopie<ol><li>Sobald die Blattscheiden auf Objektträgern montiert sind, untersuchen Sie sie mit einem Weitfeld-Lichtmikroskop mit 400-facher Vergrößerung auf Pilzbesiedelung.</li>
		<li>Um Pilzstrukturen im Detail zu beobachten, verwenden Sie ein Wasserimmersionsobjektiv anstelle von Öl, um eine bessere Bildqualität der Proben zu erzielen. Eine sphärische Aberration aufgrund einer Fehlanpassung des Brechungsindex kann zu einer Verschlechterung des Bildes führen. Wasserobjektive sind sowohl für Weitfeld-Lichtmikroskope als auch für konfokale Mikroskope erhältlich.</li>
		<li>Um die relative Menge der Besiedlung pro Hülle zu bestimmen, wird die Anzahl der Maiszellen, die von jeder Pilzeindringstelle eingedrungen sind, mit einem Weitfeld-Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung gezählt. Diese Quantifizierung ist ein geeigneter Screening-Schritt vor statistischen Analysen, bei denen Stämme, Behandlungen und/oder Entwicklungsstadien verglichen werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie<ol><li>Um fluoreszierende Proteine in Maisgewebe während der Entwicklung transgener Pilzstämme zu beobachten, müssen die grundlegenden Bildaufnahmeparameter angepasst werden. Ermitteln Sie die besten Anregungs-/Emissionseinstellungen basierend auf dem ausgewählten Fluoreszenzmarker. HINWEIS: Ein 60-faches Wasserobjektiv ist vorzuziehen, wenn fluoreszierende Fusionen mit sezernierten Proteinen analysiert werden. Moderne konfokale Mikroskope verfügen über hochkorrigierte Wasserimmersionsobjektive, um Artefakte und Formfehler zu vermeiden.</li>
		<li>Wenn die Bildgebung fluoreszierender Proteine in lebenden Zellen beabsichtigt ist, verwenden Sie untransformierte Pilzstämme als Kontrollen für die Autofluoreszenz. Verwenden Sie die folgenden Bildaufnahmeparameter, um die Dynamik von Pilzen und Wirten auf einem inversen konfokalen Mikroskop und für das fluoreszierende mCherry-Protein zu erfassen. Stellen Sie die Laserleistung auf bis zu 5 %, 450-600 Hochspannung (HV) je nach Expressionsniveau, 1,375-fache Verstärkung, 3 % Offset, einen optischen Zoomfaktor von 1 für die Analyse von bis zu fünf Maiszellen pro Abschnitt und einen optischen Zoomfaktor von 2-5 für einzelne Hyphen ein. HINWEIS: Hochauflösende konfokale Z-Stack-Bilder liefern dreidimensionale Daten und eine bessere Sicht auf Echtzeit-Interaktionen zwischen Wirt und Erreger.</li>
		<li>Für die Quantifizierung von Fluoreszenzintensitäten, die den sezernierten Fusionsproteinen entsprechen, verwenden Sie eine Bildanalysesoftware des konfokalen Herstellers oder ein Bildverarbeitungsprogramm wie ImageJ, das kostenlos online heruntergeladen werden kann. In einem Handbuch finden Sie weitere Informationen zur entsprechenden Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Visualisierung zellulärer Wechselwirkungen zwischen den Maisscheiden und Pilzen

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+Colletotrichum+graminicola+on+sweet+corn+in+Indiana.">Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana.</a> Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).</li><li>Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+a+corn+plant+develops.">How a corn plant develops.</a> Special Report, Iowa State University. 48, (1986).</li><li>Tuite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).</li><li>Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. 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M., Roichman, Y., Fridman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+tracking+of+the+endoplasmic+reticulum+in+live+pathogenic+fungal+cells.">Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).</li><li>Lorang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+is+lighting+up+fungal+biology.">fluorescent protein is lighting up fungal biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li><li>Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+yeast+organelles+with+fluorescent+protein+markers.">Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).</li><li>Westermann, B., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-targeted+green+fluorescent+proteins:+convenient+tools+for+the+study+of+organelle+biogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).</li><li>Lee, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER+chaperone+and+signaling+regulator+GRP78/BiP+as+a+monitor+of+endoplasmic+reticulum+stress.">The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress.</a> Methods. 35 (4), 373-381 (2005).</li><li>Krishnakumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+maize+database+resource+that+captures+tissue-specific+and+subcellular-localized+gene+expression,+via+fluorescent+tags+and+confocal+imaging+(Maize+Cell+Genomics+Database).">A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database).</a> Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).</li><li>Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+marker+lines+in+maize:+generation+and+applications.">Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications.</a> International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).</li><li>O'Connell, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifestyle+transitions+in+plant+pathogenic+Colletotrichum+fungi+deciphered+by+genome+and+transcriptome+analyses.">Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses.</a> Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).</li><li>Torres, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Colletotrichum+graminicola+mutant+deficient+in+the+establishment+of+biotrophy+reveals+early+transcriptional+events+in+the+maize+anthracnose+disease+interaction.">A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction.</a> BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).</li><li>Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ToxA+and+ToxB+promoter-driven+fluorescent+protein+expression+vectors+for+use+in+filamentous+ascomycetes.">Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes.</a> Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).</li><li>Gordon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucoamylase::+green+fluorescent+protein+fusions+to+monitor+protein+secretion+in+Aspergillus+niger.">Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger.</a> Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).</li><li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants.">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li><li>Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggressiveness+of+Colletotrichum+sublineola+strains+from+Sorghum+bicolor+and+S.+halepense+to+sweet+sorghum+variety+Sugar+Drip,+and+their+impact+on+yield.">Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield.</a> Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben und nichts offenzulegen haben.

Die hier beschriebene optimierte Blattscheideninokulationsmethode ist modifiziert von einem Originalprotokoll, das für Reisblattscheiden entwickelt wurde und auf Reisblattscheiden angewendet wurde 6,8,36. Es ermöglicht direkte, detaillierte Beobachtungen des Pilzwachstums und der Pilzentwicklung in lebenden Pflanzenzellen entweder mit Weitfeld- oder konfokaler Mikroskopie. Das Protokoll eignet sich für die Charakterisierung, ...

Räumliche und zeitliche Analysen auf zellulärer Ebene sind entscheidend für das Verständnis der Physiologie und Zytologie von Pilz-Pflanzen-Interaktionen. Blattgewebe, das chemischfixiert wurde 1,2,3 oder gereinigt und gefärbt 4, sowie künstliche Membranen5 wurden in der Vergangenheit verwendet, um die Zytologie der Blattpathogenentwicklung und der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Pilzen zu untersuchen. Die Untersuchung von Infektionsereignissen in lebenden Wirtsgeweben in Echtzeit ohne Fixierung oder Klärung ist jedoch aufgrund technischer Probleme im Zusammenhang mit der Vorbereitung optisch transparenter Proben für die Bildgebung eine Herausforderung.
In den späten 1940er Jahren wurde ein Inokulationsprotokoll für die Inokulation mit abgelöster Blattscheide entwickelt, um die Resistenz lebender Reisepidermiszellen gegen den Reisblastenpilz Magnaporthe oryza6 hellfeldmikroskopisch zu untersuchen. In jüngerer Zeit wurden detaillierte molekulare, physiologische und zytologische Beobachtungen der Wirtsbesiedlung durch Colletotrichum- und Magnaporthe-Arten durch die Kombination modifizierter Versionen dieser Blattscheidenmethode mit Pilztransformanten, die fluoreszierende Proteine exprimieren, und leistungsstarken Live-Cell-Imaging-Protokollen, einschließlich Epifluoreszenz und konfokaler Mikroskopie, erheblich erleichtert 7,8,9,10.11,12,13.
In dieser Arbeit wird ein optimiertes Inokulationsprotokoll unter Verwendung von abgelösten Maisblattscheiden zur Beobachtung von Infektionsprozessen durch hemibiotrophe und nekrotrophe Blattpilzerreger beschrieben. Wir haben es speziell verwendet, um Colletotrichum graminicola (C. graminicola), den Erreger der Anthraknose-Blattfäule und Stängelfäule, und Stenocarpella maydis, die Diplodia-Blattfäule und Stängelfäule verursacht, zu untersuchen. Die Methode sollte jedoch auch auf andere hemibiotrophe und nekrotrophe Blattpilzpathogene anwendbar sein. Die zytologischen und physiologischen Reaktionen während der Infektions- und Kolonisationsereignisse in diesen herausgeschnittenen Blattscheiden ähneln denen in ganzen Blattspreiten12,14,15. Darüber hinaus ähnelt die hemibiotrophe Besiedlung von Scheidenepidermiszellen durch C. graminicola der Besiedlung von Stängelmarkzellen16,17. Abgelöste Hüllen zeigen eine größere Synchronizität und experimentelle Reproduzierbarkeit der Pilzpenetration und -besiedlung als Blattspreiten oder Stängelmarkgewebe 14,16,17,18. Die meisten Maissorten können für dieses Protokoll verwendet werden. Inzuchten oder Hybriden mit übermäßigen violetten Pigmenten in den Scheiden sind jedoch weniger geeignet, da die Pigmente die Bildgebung stören. Golden Jubilee Zuckermais war für unsere Studien besonders nützlich, da unbehandeltes Saatgut im Handel erhältlich ist, die Pflanzen sehr anfällig für viele Blattkrankheiten sind und im Gewächshaus gut wachsen. Die ersten Epidemien der Anthraknose-Stängelfäule in den Vereinigten Staaten führten in den 1970er Jahren zum Totalverlust der Zuckermaisernte in Indiana19,20. Diese Methode der Blattscheideninokulation kann angewendet werden, um das Pilzwachstum und die Pilzentwicklung in lebenden vs. lokal abgetöteten Pflanzenzellen direkt zu beobachten und zu quantifizieren, um Resistenzreaktionen in kompatiblen/inkompatiblen Reaktionen auf eine Pilzinfektion nachzuweisen und um Interaktionen zwischen Pilzstämmen auf derselben Scheide in Echtzeit zu testen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axiocam monochrome microscope camera</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>426560-9010-000</td>
			<td>Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 epifluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows live viewing and image/video capture&#160;of biological samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002431</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon bacteriological Petri dish with lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-105</td>
			<td>Polystyrene material; hydrophobic surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-920-115</td>
			<td>Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV 3000 laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For visualization of fungal transformants&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germination paper</td>
			<td>Anchor Paper Co.</td>
			<td>SD7615L</td>
			<td>76# heavy weight for plastic box moist chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>75845-542</td>
			<td>Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; 
			complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool&#160;</td>
			<td>Ohio Valley Specialty Chemical&#160;</td>
			<td>3350</td>
			<td>For glass-wool filter units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>15170-172</td>
			<td>0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-457&#160;</td>
			<td>Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize cultivar Golden Jubilee seeds</td>
			<td>West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada</td>
			<td>CN361</td>
			<td>Matures&#160;in 95-105 days; seed type: F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>USA Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td>1.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-123&#160;</td>
			<td>Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal Agar (OA)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>255210</td>
			<td>Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>43671</td>
			<td>Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-skirted 96-well PCR plate</td>
			<td>USA Sientific</td>
			<td>1402-9500</td>
			<td>100 uL plate volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle for microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific&#160;</td>
			<td>1415-5390</td>
			<td>Conical tip; polypropylene material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB933</td>
			<td>Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>90000-758</td>
			<td>Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Mix BX</td>
			<td>Premium Horticulture Supply Co.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Premium general-purpose growing medium formulated to provide 
			a&#160;balance of water retention and proper drainage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC10 cone-tainers&#160;</td>
			<td>Greenhouse Megastore&#160;</td>
			<td>CN-SS-SC-10B</td>
			<td>1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC10 cone-tainers tray</td>
			<td>Greenhouse Megastore&#160;</td>
			<td>CN-SS-SCTR98</td>
			<td>24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-989-145</td>
			<td>AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage containers/boxes with latch closure</td>
			<td>Target</td>
			<td>002-02-0405</td>
			<td>Clear view storage boxes for rmoist chamber; 
			outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detached maize sheaths for live-cell imaging of infection by fungal foliar maize pathogens

Wir haben ein Protokoll optimiert, um Maisblattscheiden mit hemibiotrophen und nekrotrophen blattpathogenen Pilzen zu impfen. Die Methode ist eine Abwandlung von einer Methode, die ursprünglich auf Reisblattscheiden angewendet wurde, und ermöglicht die direkte mikroskopische Beobachtung des Pilzwachstums und der Pilzentwicklung in lebenden Pflanzenzellen. Blattscheiden, die von Maiskeimlingen mit zwei vollständig geschlüpften Blatthalsen entnommen wurden, werden mit 20 μl-Tropfen von 5 x 105 Sporen/ml Pilzsporensuspensionen beimpft und in Feuchtekammern bei 23 °C unter kontinuierlichem Fluoreszenzlicht inkubiert. Nach 24-72 h wird überschüssiges Gewebe mit einer Rasierklinge entfernt, um eine einzelne Schicht Epidermiszellen zu hinterlassen, eine optisch klare Probe, die direkt abgebildet werden kann, ohne dass eine chemische Fixierung oder Reinigung erforderlich ist. Pflanzen- und Pilzzellen bleiben für die Dauer des Experiments am Leben und Interaktionen können in Echtzeit visualisiert werden. Hüllen können gefärbt oder einer Plasmolyse unterzogen werden, um die Entwicklungszytologie und Lebensfähigkeit von Wirts- und Pathogenzellen während der Infektion und Kolonisierung zu untersuchen. Pilzstämme, die so transformiert wurden, dass sie fluoreszierende Proteine exprimieren, können auf den Hüllen inokuliert oder co-inokuliert werden, um die Auflösung zu erhöhen und die Bewertung kompetitiver oder synergistischer Interaktionen zu erleichtern. Pilzstämme, die fluoreszierende Fusionsproteine exprimieren, können verwendet werden, um die Produktion und das Targeting dieser einzelnen Proteine in planta zu verfolgen und zu quantifizieren. Inokulierte Scheidengewebe können extrahiert werden, um Nukleinsäuren, Proteine oder Metaboliten zu charakterisieren. Der Einsatz dieser Scheidenassays hat die detaillierten Untersuchungen der Mechanismen der pilzlichen Pathogenität in Mais sowie der Effektoren von Pilzproteinen und Sekundärmetaboliten, die zur Pathogenität beitragen, erheblich vorangebracht.

Spatial and temporal analyses at the cellular level are critical for understanding the physiology and cytology of fungal-plant interactions. Foliar tissues that have been chemically fixed1,2,3or cleared and stained4, as well as artificial membranes5, have been used in the past to investigate the cytology of foliar pathogen development and plant-fungal interactions. However, investigation of infection events in living host tissues in real-time without fixation or clearing is challenging due to technical issues related to the preparation of optically transparent samples for imaging.
A detached leaf sheath inoculation protocol was developed in the late 1940s for bright field microscopic investigation of resistance of living rice epidermal cells to the rice blast fungus Magnaporthe oryza6. More recently, detailed molecular, physiological, and cytological observations of host colonization by Colletotrichum and Magnaporthe species have been greatly facilitated by combining modified versions of this leaf sheath method with fungal transformants expressing fluorescent proteins, and high-performance live-cell imaging protocols, including epifluorescence and confocal microscopy7,8,9,10,11,12,13.
This paper details an optimized inoculation protocol using detached maize leaf sheaths for observation of infection processes by hemibiotrophic and necrotrophic foliar fungal pathogens. We have specifically used it to study Colletotrichum graminicola (C. graminicola), the causal agent of anthracnose leaf blight and stalk rot, and Stenocarpella maydis, which causes Diplodia leaf blight and stalk rot. However, the method should be applicable to other hemibiotrophic and necrotrophic foliar fungal pathogens. Cytological and physiological responses during infection and colonization events in these excised leaf sheaths are similar to those in entire leaf blades12,14,15. Furthermore, hemibiotrophic colonization of sheath epidermal cells by C. graminicola is similar to colonization of stalk pith cells16,17. Detached sheaths show greater synchronicity and experimental reproducibility of fungal penetration and colonization than leaf blades or stalk pith tissues14,16,17,18. Most maize varieties can be used for this protocol. However, inbreds or hybrids with excessive purple pigments in the sheaths are less suitable since the pigments interfere with imaging. Golden Jubilee sweet corn has been particularly useful for our studies because untreated seeds are commercially available, the plants are highly susceptible to many foliar diseases, and they grow well in the greenhouse. The first epidemics of anthracnose stalk rot in the United States resulted in the total loss of sweet corn crops in Indiana in the 1970s19,20. This leaf sheath inoculation method can be applied to directly observe and quantify fungal growth and development in living vs. locally killed plant cells, to demonstrate resistance reactions in compatible/incompatible responses to fungal infection, and to test interactions between fungal strains on the same sheath in real-time.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Pathogenitätsmechanismen von Pilzen in Mais 

Abgetrennte Maisscheiden für die Lebendzell-Bildgebung der Infektion durch pilzliche Blattmais-Erreger

So our team aims to understand fungal pathogenicity mechanisms in plants to improve disease management. We are currently exploring how the maize autochthonous fungus regulates protein secretion beyond its housekeeping function. Our protocol shows high synchronicity across replications and reproducibility of fungal colonization.Also, with our assays, there is no need for clearing or fixating samples before imaging them in real-time. The method offers a variety of applications in plant-pathogen interactions and contributed to detailed studies on the mechanisms of fungal pathogenicity in maize and comparative genomic analysis.

Die folgenden Beispiele beschreiben repräsentative Ergebnisse nach der Anwendung der Inokulationsmethode mit Maisblattscheiden. Diese Beispiele zeigen, wie einfach, schnell und präzise die Beobachtung und der Vergleich von Mais-Pilz-Interaktionen mit diesem optimierten Assay in Echtzeit durchgeführt werden können. Die Bildgebung lebender Zellen ermöglicht auch die Extraktion quantitativer Informationen und ist ein nützliches Werkzeug für vergleichende molekulare, zytologische und physiologische Studien. Weitere De...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize at JoVE.com

Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Inokulationsprotokoll, das abgelöste Maisblatthüllen für reproduzierbare zytologische, physiologische und molekulare Studien von Maisinteraktionen mit pilzlichen Pflanzenpathogenen verwendet. Die Blattscheiden erleichtern die Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen zwischen der lebenden Pflanze und dem Pilz in nicht fixiertem Gewebe.

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...

Unser Team zielt daher darauf ab, die Pathogenitätsmechanismen von Pilzen in Pflanzen zu verstehen, um das Krankheitsmanagement zu verbessern. Wir untersuchen derzeit, wie der autochthone Maispilz die Proteinsekretion über seine Haushaltsfunktion hinaus reguliert. Unser Protokoll zeigt eine hohe Synchronizität zwischen den Replikationen und die Reproduzierbarkeit der Pilzbesiedlung.Außerdem ist es mit unseren Assays nicht erforderlich, Proben zu klären oder zu fixieren, bevor sie in Echtzeit abgebildet werden. Die Methode bietet eine Vielzahl von Anwendungen in Pflanzen-Pathogen-Interaktionen und trug zu detaillierten Studien zu den Mechanismen der pilzlichen Pathogenität in Mais und zur vergleichenden Genomanalyse bei.

detached-maize-sheaths-for-live-cell-imaging-infection-fungal-foliar

Research

JoVE Journal

Biology

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

1.0K Aufrufe.  University of Kentucky. Unser Team zielt daher darauf ab, die Pathogenitätsmechanismen von Pilzen in Pflanzen zu verstehen, um das Krankheitsmanagement zu verbessern. Wir untersuchen derzeit, wie der autochthone Maispilz die Proteinsekretion über seine Haushaltsfunktion hinaus reguliert. Unser Protokoll zeigt eine hohe Synchronizität zwischen den Replikationen und die Reproduzierbarkeit der Pilzbesiedlung.Außerdem ist es mit unseren Assays nicht erforderlich, Proben zu klären oder zu fixieren, bevor sie ...

Serie: Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Pathogenitätsmechanismen von Pilzen in Mais 

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one originally applied to rice leaf sheaths and allows direct microscopic observation of fungal growth and development in living plant cells. Leaf sheaths collected from maize seedlings with two fully emerged leaf collars are inoculated with 20 &#181;L drops of 5 x 105 spores/mL fungal spore suspensions and incubated in humidity chambers at 23 &#176;C under continuous fluorescent light. After 24-72 h, excess tissue is removed with a razor blade to leave a single layer of epidermal cells, an optically clear sample that can be imaged directly without the necessity for chemical fixation or clearing. Plant and fungal cells remain alive for the duration of the experiment and interactions can be visualized in real-time. Sheaths can be stained or subjected to plasmolysis to study the developmental cytology and viability of host and pathogen cells during infection and colonization. Fungal strains transformed to express fluorescent proteins can be inoculated or co-inoculated on the sheaths for increased resolution and to facilitate the evaluation of competitive or synergistic interactions. Fungal strains expressing fluorescent fusion proteins can be used to track and quantify the production and targeting of these individual proteins in planta. Inoculated sheath tissues can be extracted to characterize nucleic acids, proteins, or metabolites. The use of these sheath assays has greatly advanced the detailed studies of the mechanisms of fungal pathogenicity in maize and also of fungal protein effectors and secondary metabolites contributing to pathogenicity.

This manuscript details an optimized inoculation protocol that uses detached maize leaf sheaths for reproducible cytological, physiological, and molecular studies of maize interactions with fungal plant pathogens. The leaf sheaths facilitate real-time observation of cellular interactions between the living plant and fungus in unfixed tissues.

Forschung

Biologie

Inoculation of Maize Leaf Sheaths with Pathogenic Fungi for Assessing Fungal Pathogenicity

To begin, use heavy duty scissors or shears to cut off the cap end 0.5 millimeters from the conical bottom of a 1.5-milliliter micro-centrifuge tube. Place a piece of glass wool in the cut tube to cover the center hole. Place one assembled glass wool filter unit into a sterile 1.5-milliliter micro-centrifuge tube and label the tube.Next, cut a non-skirted 96-well PCR plate into six two-column support racks. Flip the two-column racks so the conical bottoms of the wells face upwards. Place the rack in a glass Petri dish containing moist filter paper and cover it with the lid to create a humidity chamber for the leaf sheaths.To harvest conidia from the sporulating Colletotrichum graminicola, add three to four milliliters of sterile deionized water into the plate. Using a sterile conical tip pestle, scrape evenly across the entire plate to loosen the spores from the agar. Aseptically add one milliliter of spore suspension onto a glass wool filter unit and allow the spores to flow into the collection tube by gravity.Centrifuge the filtered spore suspension at 3, 500 G for five minutes and pour off the liquid into an autoclavable container. Add one milliliter of sterile deionized water into the collection tube and gently agitate to resuspend the pelleted spores. Again, centrifuge the suspension and resuspend the spores for quantification in 300 to 500 microliters of deionized water.Use a hemocytometer under a compound microscope at 100 times magnification to determine the spore concentration. Then prepare 500, 000 spores per milliliter suspension with deionized water. To remove the sheath from the first true leaf of week two stage seedlings.Run a thumbnail along the overlapping margin of the sheath and gently loosen it from the chute. Cut the recovered leaf sheath into three to five-centimeter segments. Carefully unroll each segment to expose the inner epidermal layer.Apply 20 microliters of fungal spore suspension on the inner surface at the center of the sheath above the mid-rib. Place the inoculated leaf sheaths horizontally, with a mid-rib positioned at the bottom, in a glass Petri plate containing moistened filter paper. Next place the small humidity chambers into a clear storage box lined with moistened germination paper, cover the storage box with a lid, and incubate at 23 degrees Celsius under continuous illumination for the intended time course.Regularly check the boxes for signs of disease on the sheaths.

Inokulation von Maisblattscheiden mit pathogenen Pilzen zur Beurteilung der pilzlichen Pathogenität

Preparation of Fungal Infected Detached Maize Leaf Sheaths for Live-Cell Imaging

To begin, gently rinse the maize leaf sheaths inoculated with fungal spores in deionized water. Place the sheath on a clean glass microscope slide with the adaxial surface facing down and the abaxial surface uppermost. Using a single-edge razor blade, trim approximately one centimeter off the sheath ends and remove most lamina tissue on either side of the midrib.Hold the razor blade at a 90-degree angle to shave tissue from the abaxial midrib, exposing the epidermal layer on the adaxial surface above the inoculated spot. Carefully lift the sheath section from one edge and transfer it onto a new slide with the adaxial surface facing the uppermost closest to the objective lens. Apply 60 microliters of deionized water to the section and place a glass cover slip without introducing air bubbles.Stenocarpella maydis rapidly invaded epidermal cells directly via undifferentiated hyphal swellings. While Colletotrichum graminicola produced melanized appressoria. Trypan blue staining revealed the nature and extent of fungal hyphae colonization, with C.graminicola initially invading via thick primary hyphae and later switching to a necrotrophic stage.C.graminicola invades living maize cells using thick primary hyphae separated from the host cytoplasm by a membrane. In contrast, S.maydis produces a phytotoxin that kills the epidermal cells before invading them. In C.graminicola, the production of dark brown precipitate in the maize leaf sheaths indicated an oxidative burst related to a host-resistance response.