Dieses Protokoll ermöglicht die Impfung viraler Vektoren direkt in Maispflanzen, die in den meisten Laborumgebungen problemlos angewendet werden können, ohne dass teure Spezialgeräte erforderlich sind. Die direkte Impfung eliminiert die Verwendung eines alternativen Wirts als Inokulumquelle und spart sowohl Zeit als auch Ressourcen. Diese Methode könnte auf zusätzliche virale Vektoren, Maislinien und möglicherweise andere Monokotyledonenarten angewendet werden.
Beginnen Sie mit dem Einpflanzen von 1 bis 2 Maissamen in das torfbasierte Wachstumsmedium in kleinen Einsätzen, die in Schalen platziert sind. Stellen Sie die Tabletts in eine Wachstumskammer unter 16-Stunden-Tagen bei 25 Grad Celsius und 8-Stunden-Nächten bei 22 bis 25 Grad Celsius oder in ein Gewächshaus bei 22 bis 25 Grad Celsius mit 16-Stunden-Tagen und 8-Stunden-Nächten. Regelmäßig Pflanzen gießen und einmal pro Woche mit 15-5-15 Flüssigdünger bei 330 Teilen pro Million Konzentration düngen.
Bereiten Sie das Agrobakterium für die Injektion vor, indem Sie den Agrobakterienstamm, der das gewünschte virale Konstrukt enthält, in LB-Medien mit Antibiotika impfen. Inkubieren Sie dann den Kolben oder die Röhrchen bei 28 Grad Celsius, während Sie 24 Stunden lang bei 225 U / min schütteln. Am nächsten Tag pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrierung bei 4.000 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur und verwerfen den Überstand.
Dann waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter entionisiertem Wasser. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 10 Millimol-Magnesiumsulfatlösung erneut und messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern. Stellen Sie es dann auf 1.0 ein.
Verwenden Sie 4 bis 7 Tage alte Maissämlinge zur Injektion von Agrobakterien. Setzen Sie die Spritze und die Nadel zusammen. Injizieren Sie die Bakteriensuspension vorsichtig 2-3 Millimeter über dem Coleoptilularknoten, bis sie das Coleoptil auffüllt oder im Wirbel sichtbar ist, abhängig von der Wachstumsphase der Pflanzen.
Injizieren Sie alle Sämlinge und wechseln Sie die Spritze und die Nadeln, um jedes Konstrukt zu injizieren. Bestätigen Sie eine phänotypische Infektion, indem Sie Läsionen beobachten, die die Kontrollgene zum Schweigen bringen, läsionsähmen 22 oder Phytoen-Desaturase auf den Blättern. Verwenden Sie ein Fluoreszenzbildgebungsgerät für das schnelle Screening von Pflanzen und die Fluoreszenzmikroskopie, um das Vorhandensein einer GFP-Expression nachzuweisen.
Führen Sie eine Genexpressionsanalyse zum molekularen Nachweis von Infektionen durch. Extrahieren Sie 14 bis 21 Tage nach der Infektion die Gesamt-RNA aus den Blättern infizierter Pflanzen und synthetisieren Sie die cDNA des ersten Strangs, wie im Textmanuskript beschrieben. Führen Sie eine Reverse-Transkriptase-PCR durch, um die Infektion zu bestätigen und die Integrität des Gens oder das Genfragment von Interesse mit spezifischen Primern zu bestimmen, die für verschiedene virale Konstrukte entwickelt wurden.
Visualisieren Sie das PCR-Produkt auf einem 1% Agarosegel, das eine Nukleinsäurefärbung enthält, um das Vorhandensein oder Fehlen von Virus und Gen oder Genfragment zu bestimmen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um rekombinante Viren, die für Gene entwickelt wurden, in Maissämlinge einzufügen. Etwa 12 Tage nach der Injektion wurden Aufblättern Phänotypen als Nekrose und Photobleichen zum Schweigen gebracht.
Das Vorhandensein von Konstrukten in Blättern nach der Infektion wurde durch Beobachtung der grün fluoreszierenden Proteinexpression unter einer Fluoreszenz mit einem anderen GFP-Filter nachgewiesen. Die grün fluoreszierende Proteinexpression in mit dem Fuchsschwanzmosaikvirus infizierten Blättern wurde als kleine punktförmige Bereiche der Fluoreszenz, die über die Blätter verteilt waren, und als große Flecken in mit dem Zuckerrohrmosaikvirus infizierten Blättern visualisiert. Unter Verwendung der Genexpressionsanalyse wurde eine systemische Infektion mit dem Fuchsschwanzmosaikvirus bestätigt und eine Gen-Silencing oder Unterdrückung der Phytoen-Desaturase und der Läsionsimitation 22 beobachtet.
Das verwendete Konstrukt beeinflusste auch die Infektionseffizienz. Im Falle einer Infektion mit dem Fuchsschwanzmosaikvirus hatten der leere Vektor des Fuchsschwanzmosaikvirus und die Läsion des Fuchsschwanzmosaikvirus 22 typischerweise die höchste Infektionseffizienz von 53% bzw. 54%. Foxtail Mosaic Virus Phytoene Desaturase mit einer etwas geringeren Effizienz bei 39% und Foxtail Mosaic Virus grün fluoreszierendes Protein, mit der niedrigsten Effizienz bei 16%Inzwischen betrug die Infektionseffizienz des grün fluoreszierenden Proteins des Zuckerrohrmosaikvirus 8% Timing und die Symptome basieren auf dem viralen Vektor und der verwendeten Maislinie.
Das Fehlen eines visuellen Phänotyps bedeutet möglicherweise keinen Mangel an Stummschaltung oder Expression. Diese Methode kann auch auf Gen-Editing-Technologien angewendet werden, indem die Liefermethoden für Leit-RNAs verbessert werden.
