Die Autoren danken der Agricultural Experiment Station an der University of Georgia für ihre technische und finanzielle Unterstützung. Darüber hinaus danken die Autoren Samuel Ogundipe, Dr. Ronald Pegg und Dr. Joon Hyuk Suh für ihre Hilfe bei der Analyse von Prozessproben.

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Aufbau und Integration des Bioreaktors und des Flüssig-Flüssig-Extraktionssystems
<ol><li>Bereiten Sie die Extraktionslösung und das Reservoir für die organische Phase vor.<ol><li>Bereiten Sie 2 l Extraktionslösung in organischer Phase vor, indem 60 g Trioctylphosphinoxid (TOPO) mit einer magnetischen Rührplatte und einem Rührwerk in Mineralöl gelöst werden.</li>
		<li>Geben Sie die Extraktionslösung in ein 2-Liter-Glasreservoir (z. B. eine Schott-Flasche).</li>
		<li>Stellen Sie das Reservoir auf eine magnetische Rührplatte (Abbildung 1A). Die empfohlene Mischgeschwindigkeit während des kontinuierlichen LLE-Betriebs beträgt 150-250 U/min.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie eine Kappe mit drei Anschlüssen für das Reservoir der Extraktionslösung vor.<ol><li>Befestigen Sie ein Tauchrohr an der ersten Öffnung, die als Auslauföffnung dient und die Extraktionslösung für die vordere Extraktionsmembran (FEM) zuführt (Abbildung 1B).</li>
		<li>Bringen Sie einen zweiten Anschluss an, der als Rückführöffnung für die Extraktionslösung von der Rückwärtsextraktionsmembran (BEM) dient (Abbildung 1C).</li>
		<li>Fügen Sie einen dritten, zur Atmosphäre hin offenen Anschluss hinzu, um die durch die Membranpumpe verursachten Druckschwankungen zu dämpfen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verbinden Sie die Membranpumpe mit den Absaugmembranen.<ol><li>Platzieren Sie einen Pumpenantrieb mit variabler Drehzahl von 100 U/min, der mit einem Membranpumpenkopf aus Polytetrafluorethylen (PTFE) ausgestattet ist, neben dem Behälter (Abbildung 1D).</li>
		<li>Verbinden Sie den Auslassanschluss des Extraktionslösungsbehälters (Abbildung 1A) mit dem Einlass der Membranpumpe und dann den Auslass der Membranpumpe mit dem mantelseitigen Einlass an der Basis der FEM (Abbildung 1B) mit dem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 16, 18).</li>
		<li>Verbinden Sie den schalenseitigen Auslass an der Oberseite des FEM mit dem schalenseitigen Einlass an der Basis des BEM (Abbildung 1C) mit einem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 18).</li>
		<li>Verbinden Sie den mantelseitigen Auslass an der Oberseite des BEM mit einem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 16, 18) mit dem Rücklaufanschluss des Extraktionslösungsbehälters (Abbildung 1A). HINWEIS: Diese Systemkomponente überträgt MCFAs, die aus der Fermentationsbrühe im FEM extrahiert wurden, in die Stripplösung im BEM.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie die wässrige Phasen-Stripping-Lösung und das Reservoir vor.<ol><li>Bereiten Sie 3,25 l wässrige Phasen-Stripping-Lösung vor, indem Sie eine 0,5 M Borsäurelösung nehmen und sie mit NaOH auf pH 9 einstellen.</li>
		<li>Gießen Sie die Lösung in einen 3,5-Liter-Glasbehälter mit einem magnetischen Rührstab.</li>
		<li>Stellen Sie das Reservoir auf eine magnetische Rührplatte (Abbildung 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie eine Kappe mit vier Anschlüssen für das Reservoir der Stripplösung vor.<ol><li>Befestigen Sie ein Tauchrohr an der ersten Öffnung, die als Auslauföffnung dient und die Abisolierlösung für das BEM liefert.</li>
		<li>Ein zweiter Anschluss mit einer Y-Verschraubung wird so angebracht, dass (1) er als Rückflussanschluss der Stripplösung aus dem BEM dient und (2) als Mitnahmestrom für NaOH-Zugaben aus dem pH-Kontrollsystem dient.</li>
		<li>Fügen Sie einen dritten Port hinzu, der zur Atmosphäre hin offen ist, um die durch NaOH-Zusätze und MCFA-Akkumulation verursachte Volumenzunahme zu berücksichtigen.</li>
		<li>Stellen Sie einen vierten Anschluss zur Aufnahme der pH-Sonde des pH-Controllers bereit.</li>
	</ol></li>
	<li>Installieren Sie ein pH-Kontrollsystem am Reservoir der Stripplösung.<ol><li>Integrieren Sie ein pH-Kontrollsystem mit einem Sollwert von pH 9 in das Reservoir der Stripping-Lösung (Abbildung 1F). Verwenden Sie 5 M NaOH als Basislösung mit dem pH-Controller, um den gesammelten MCFAs entgegenzuwirken.</li>
		<li>Führen Sie die pH-Sonde durch den Anschluss des Reservoirs der Strippinglösung ein und suspendieren Sie sie in der Strippinglösung. HINWEIS: Dieses pH-Kontrollsystem benötigt keine saure Lösung.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie die Anschlüsse für den Bioreaktor vor.<ol><li>Am Bioreaktor sind zwei Anschlüsse, eine Ausströmöffnung und eine Rücklauföffnung, für den Anschluss an das Flüssig-Flüssig-Extraktionssystem (LLE) anzugeben (Abbildung 1G,H).</li>
		<li>Schließen Sie ein Tauchrohr an die Ausströmöffnung an. Die MCFA-reiche Bouillon wird aus dem Bioreaktor an der Ausströmöffnung in das LLE-System gepumpt. HINWEIS: Die Brühe gelangt zuerst vor den Extraktionsmembranen in den Hohlfasermembranfilter, um die Zellen und andere Feststoffe zu entfernen und eine Verschmutzung zu verhindern.</li>
		<li>Setzen Sie ein T-Stück an der Rücklauföffnung ein, um Folgendes aufzunehmen: (1) MCFA-abgereicherte Bouillon, die aus dem FEM recycelt wurde, und (2) zellhaltiges Retentat aus dem Hohlfasermembranfilter.</li>
	</ol></li>
	<li>Installieren Sie den Hohlfaser-Membranfilter.<ol><li>Platzieren Sie einen Pumpenantrieb mit variabler Drehzahl von 300 U/min neben dem Bioreaktor (Abbildung 1I).</li>
		<li>Befestigen Sie die hydrophile Hohlfasermembran (Abbildung 1J) an einem Ringständer über der Peristaltikpumpe.</li>
		<li>Stapeln Sie zwei peristaltische Pumpenköpfe auf dem Pumpenantrieb, groß (z. B. Größe 17) und klein (z. B. Größe 16). HINWEIS: Der größere Pumpenkopf ist mit dem Hohlfasermembranfilter verbunden, um sicherzustellen, dass die Permeatdurchflussrate größer ist als die Durchflussrate, die in die FEM eingespeist wird. Wäre dies nicht der Fall, würde das Permeat schneller verbraucht werden, als es produziert wird, wodurch sich ein Vakuum bildet.</li>
		<li>Verbinden Sie die Ausströmöffnung am Bioreaktor mit einem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 17) mit dem großen Pumpenkopfeinlass.</li>
		<li>Verbinden Sie den großen Pumpenkopfauslass mit dem hydrophilen Hohlfasermembranfilter am rohrseitigen Einlass am Boden des Filters mit einem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 17).</li>
		<li>Deckeln Sie den oberen schalenseitigen Anschluss des Filters, um das Eindringen von Luft zu verhindern. HINWEIS:Die MCFA-reiche Brühe (die Zellen enthält) fließt durch die Hohlfaserrohre nach oben und kehrt in den Bioreaktor zurück. Klare Brühe (zellfrei) passiert die 0,2 μm hydrophile Polyethersulfon (PES)-Membran und sammelt sich auf der Schalenseite des Filters.</li>
	</ol></li>
	<li>Schließen Sie die FEM an.<ol><li>Befestigen Sie das erste hydrophobe Hohlfaser-Membranmodul (FEM) an einem Ringständer über der Pumpe (Abbildung 1B).</li>
		<li>Verbinden Sie den hydrophilen Hohlfaser-Membranfilter (Abbildung 1J) am mantelseitigen Auslass mit einem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 16, 18) mit dem kleinen Einlass des Pumpenkopfes.</li>
		<li>Verbinden Sie den kleinen Pumpenkopfauslass mit dem FEM am schlauchseitigen Einlass an der Basis des Moduls mit einem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 16, 18).</li>
		<li>Das Manometer (Bild 1K) und das Durchflussbegrenzungsventil (Bild 1L) mit einer Kupplung und einem T-Stück an den rohrseitigen Ausgang des FEM anschließen.</li>
		<li>Verbinden Sie den schlauchseitigen Ausgang des FEM mit einem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 18) mit dem Rücklaufanschluss am Bioreaktor. HINWEIS:Diese Systemkomponente überträgt die MCFAs aus der klaren Fermentationsbrühe in die Extraktionslösung und führt die klare Brühe dann wieder in den Bioreaktor zurück.</li>
	</ol></li>
	<li>Verbinden Sie das BEM.<ol><li>Platzieren Sie einen Pumpenantrieb mit variabler Drehzahl und 300 U/min, der mit einem peristaltischen Pumpenkopf (z. B. Größe 16) ausgestattet ist, neben dem Bioreaktor (Abbildung 1M).</li>
		<li>Befestigen Sie das zweite hydrophobe Hohlfasermembranmodul an einem Ringständer über der Peristaltikpumpe (Abbildung 1C).</li>
		<li>Verbinden Sie den Auslaufanschluss des Stripperlösungsbehälters mit dem Einlass der Schlauchpumpe und den Pumpenauslass mit dem schlauchseitigen Einlass an der Basis des BEM mit einem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 16, 18).</li>
		<li>Verbinden Sie das Manometer und das Durchflussbegrenzungsventil mit einer Kupplungsverschraubung und einer T-Armatur mit dem rohrseitigen Ausgang des BEM.</li>
		<li>Verbinden Sie den schlauchseitigen Auslass an der Oberseite des BEM mit einem flexiblen Pumpenschlauch (z. B. Größe 16, 18) mit dem Rückflussanschluss des Stripplösungsbehälters. HINWEIS: Diese Systemkomponente überträgt die MCFAs aus der Extraktionslösung in die Stripping-Lösung im BEM und führt die Stripping-Lösung dann in ihr Reservoir zurück.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inbetriebnahme des Flüssig-Flüssig-Extraktionssystems
<ol><li>Die wässrigen Phasenlinien ansaugen und zirkulieren lassen.<ol><li>Schalten Sie die Schlauchpumpe/BEM für die Stripplösung ein (Abbildung 1M) und stellen Sie die Pumpendrehzahl so ein, dass eine konstante Durchflussrate zwischen 25 und 250 mL·min-1 erreicht wird. Das BEM kann einen relativ großen Bereich von Durchflussmengen aufnehmen. Beginnen Sie zunächst mit einer konservativ hohen Durchflussrate, um eine ausreichende MCFA-Extraktion zu gewährleisten. Die Durchflussmenge kann später während des Betriebs schrittweise reduziert werden, um die Lebensdauer der Pumpenausrüstung und der Schläuche zu verlängern. HINWEIS: Die Strömungsgeschwindigkeit sollte nicht so niedrig sein, dass eine Anreicherung von MCFAs in der Bioreaktorbrühe möglich ist (siehe Repräsentative Ergebnisse).</li>
		<li>Schließen Sie langsam das Nadelventil am schalenseitigen Auslass des BEM (Abbildung 1C), um einen Gegendruck von ~5 psig aufzubauen.</li>
		<li>Schalten Sie den Bioreaktor/die FEM-Schlauchpumpe ein (Abbildung 1I) und stellen Sie die Pumpendrehzahl so ein, dass eine konstante Durchflussrate zwischen 25 und 250 mL·min-1 erreicht wird. Die FEM kann einen relativ großen Bereich von Durchflussmengen aufnehmen. Beginnen Sie zunächst mit einer konservativ hohen Durchflussrate, um eine ausreichende MCFA-Extraktion zu gewährleisten. Die Durchflussmenge kann später während des Betriebs schrittweise reduziert werden, um die Lebensdauer der Pumpenausrüstung und der Schläuche zu verlängern. HINWEIS: Die Strömungsgeschwindigkeit sollte nicht so niedrig sein, dass eine Anreicherung von MCFAs in der Bioreaktorbrühe möglich ist (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse).</li>
		<li>Schließen Sie langsam das Nadelventil am mantelseitigen Auslass des FEM (Abbildung 1B), um einen Gegendruck von ~5 psig aufzubauen.</li>
		<li>Überprüfen Sie visuell die Rücklaufleitungen, um einen konstanten Durchfluss zu gewährleisten und sicherzustellen, dass die Leitungen vorbereitet wurden.</li>
		<li>Vergewissern Sie sich, dass sich die klare Brühe in der Schalenseite des Hohlfasermembranfilters sammelt (Abbildung 1J). HINWEIS: Es dauert mehrere Stunden, bis die FEM gefüllt ist und ein gleichmäßiger Fluss zwischen dem Hohlfasermembranfilter und der FEM hergestellt ist. Die Strömungsgeschwindigkeit sollte nicht so niedrig sein, dass eine Anreicherung von MCFAs in der Bioreaktorbrühe möglich ist (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse).</li>
	</ol></li>
	<li>Die organischen Phasenlinien grundieren und zirkulieren lassen.<ol><li>Schalten Sie die Membranpumpe für die Extraktionslösung in der organischen Phase ein (Abbildung 1D) und stellen Sie die Pumpendrehzahl so ein, dass eine konstante Durchflussrate zwischen 5,0 und 50 mL·min-1 erreicht wird. Beginnen Sie zunächst mit einer konservativ niedrigen Durchflussrate, um den Druck in der Extraktion in der organischen Phase zu minimieren und das Risiko eines Cross-Overs zu minimieren. Bei Bedarf kann die Durchflussmenge später während des Betriebs schrittweise erhöht werden, um die Extraktionseffizienz zu verbessern</li>
		<li>Warten Sie, bis FEM und BEM gefüllt sind.</li>
		<li>Überprüfen Sie visuell die Rücklauföffnung am Behälter der Extraktionslösung, um einen konstanten Durchfluss zu gewährleisten.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass keine organische Phasenlösung in die Stripplösung oder die Fermentationsbrühe übergeht. Findet ein Crossover statt, sind kleine Tröpfchen der organischen Phase zu sehen. Verringern Sie in diesem Fall die Drehzahl der Membranpumpe und erhöhen Sie den Gegendruck leicht am FEM oder BEM. Überschreiten Sie nicht 10 psig. HINWEIS: Um ein Überkreuzen der Membran zu verhindern, ist es wichtig, die Strömung und den Gegendruck in den wässrigen Phasenleitungen herzustellen, bevor die organischen Phasenleitungen grundiert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Extrahieren Sie kontinuierlich MCFAs aus dem Bioreaktor.<ol><li>Das LLE-System sollte voll funktionsfähig sein. Lassen Sie das System während des Bioreaktorbetriebs kontinuierlich laufen.</li>
		<li>Messen Sie täglich die MCFA-Konzentrationen im Bioreaktor, um eine ausreichende Extraktion von MCFAs sicherzustellen. Treten erhöhte MCFA-Konzentrationen im Bioreaktor auf, deutet dies in der Regel auf unzureichende Durchflussraten der Fermentationsbouillon durch die FEM hin. Es kann auch auf einen verminderten Membranfluss aufgrund von Verschmutzung und Wartungsbedarf hinweisen (siehe Schritt 2.6). HINWEIS: Die SCFA- und MCFA-Konzentrationen können mittels Gaschromatographie nach der von Ge et al.11 beschriebenen Methode gemessen werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Überwachen Sie die MCFA-Akkumulation im Reservoir der Stripping-Lösung.<ol><li>Messen Sie die MCFA-Konzentration in der Stripping-Lösung täglich während des Chargenzyklus. Das LLE-System überträgt MFCAs kontinuierlich vom Bioreaktor in die Stripping-Lösung, wodurch die MCFA-Konzentration im Laufe der Zeit erhöht wird. Der Prozess kann über längere Zeiträume laufen, um hohe MCFA-Titer zu erzeugen. Die volumetrische Produktionsrate von MCFAs (mM C·L-1·d-1) kann mit Hilfe von Gleichung 111 geschätzt werden. HINWEIS: Volumetrische Produktionsrate = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66956/66956eq01.jpg" style="margin: auto;"> (Gl. 1) wo: Cb,n= MCFA-Konzentration in der Fermentationsbrühe am Tag n, mM C Cs,n= MCFA-Konzentration in der Stripping-Lösung am Tag n, mM C Cs,n-1= MCFA-Konzentration in der Stripping-Lösung am Tag n-1, mM C Vs,n= Volumen der Abstreiflösung am Tag n, L Vb,n= Volumen der Fermentationsbrühe (Bioreaktorvolumen) am Tag n, L HRTn= Hydraulische Retentionszeit des Bioreaktors am Tag n, d Tn= Tag n, d Tn-1= Tag n-1, d</li>
		<li>Um einen stabilen Betrieb zu gewährleisten, ist die Extraktionsrate (mM C·d-1) des LLE-Systems regelmäßig zu berechnen, indem die Änderung der MCFA-Konzentration zwischen den Messzeitpunkten gemessen und Gleichung 2bis 11 angewendet wird. ANMERKUNG: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66956/66956eq02.jpg" style="margin: auto;"> (Gl. 2) wo: Cs,n= MCFA-Konzentration in der Stripping-Lösung am Tag n, mM C Cs,n-1= MCFA-Konzentration in der Stripping-Lösung am Tag n-1, mM C Vs,n= Volumen der Abstreiflösung am Tag n, L Tn= Tag n, d Tn-1= Tag n-1, d</li>
		<li>Um eine angemessene Übertragungsrate aus der Extraktionslösung aufrechtzuerhalten, ersetzen Sie die Stripping-Lösung durch eine frische Charge, bevor die MCFA-Konzentration eine Sättigung von 80 % erreicht. HINWEIS: Die maximale Löslichkeit von n-Capronsäure beträgt 10,3 g· L-1 bei 25 °C und der von n-Caprylsäure beträgt 0,67 g· L-1 bei 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Ersetzen Sie die Abbeizlösung.<ol><li>Schalten Sie die Membranpumpe aus (Abbildung 1D).</li>
		<li>Schalten Sie die Schlauchpumpe für die Stripplösung aus (Abbildung 1M).</li>
		<li>Verwenden Sie Schlauchschellen, um den rohrseitigen Einlass und den rohrseitigen Auslass des BEM zu klemmen.</li>
		<li>Schalten Sie das pH-Kontrollsystem aus und entfernen Sie den Deckel des Behälters für die Stripplösung, während Sie die Anschlüsse (falls möglich) angeschlossen lassen.</li>
		<li>Nehmen Sie das Reservoir für die Stripplösung heraus (Abbildung 1E).</li>
		<li>Das Reservoir der Stripping-Lösung wird durch eine frische Charge wässriger 0,5 M Borsäurelösung ersetzt, die unter Verwendung von NaOH auf pH 9 eingestellt wurde (siehe Schritt 1.4). Bringen Sie den Deckel wieder am Behälter an.</li>
		<li>Entfernen Sie die Schlauchschellen vom rohrseitigen Einlass und dem rohrseitigen Auslass des BEM.</li>
		<li>Schalten Sie die Peristaltikpumpe der Strippinglösung ein (Abbildung 1M), gefolgt von der Membranpumpe (Abbildung 1D). Der Systembetrieb ist nun wiederhergestellt.</li>
	</ol></li>
	<li>Wartung der Membran.<ol><li>Entfernen Sie FEM und BEM alle drei Monate zur Reinigung aus dem LLE-System. Drei Monate ist eine konservativ geschätzte Reinigungshäufigkeit. HINWEIS: Je nach Anwendung kann es vorkommen, dass der Benutzer die Membranen mehr oder weniger häufig reinigt. Anzeichen einer verminderten Membranleistung werden im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse beschrieben. Während der Wartung sollten die Pumpen und der pH-Regler ausgeschaltet sein. Reinigungsanweisungen sollten vom Hersteller der Membran zur Verfügung gestellt werden.</li>
		<li>Lassen Sie die Flüssigkeiten aus dem LLE-System in separate Behälter ab, beginnend mit den Extraktionslösungsleitungen für die organische Phase, gefolgt von den Fermentationsbrühenlinien und den Stripping-Lösungsleitungen.</li>
		<li>Sobald die Membranen gereinigt und wieder installiert sind, geben Sie die Flüssigkeiten in ihre jeweiligen Behälter zurück.</li>
		<li>Starten Sie das LLE-System mit dem oben beschriebenen Ansatz erneut (siehe Schritte 2.1-2.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

Nachhaltige MCFA-Produktion durch Kettendehnung und Flüssig-Flüssig-Extraktion

<ol>
	<li>Palomo-Briones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-neutral+ph+increased+n-caprylate+production+in+a+microbiome+with+product+inhibition+of+methanogenesis.">Near-neutral ph increased n-caprylate production in a microbiome with product inhibition of methanogenesis.</a> Chem Eng J. 446, 137170 (2022).</li><li>Wang, J., Yin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+production+of+medium-chain+carboxylates+through+chain+elongation:+An+overview.">Biological production of medium-chain carboxylates through chain elongation: An overview.</a> Biotechnol Adv. 55, 107882 (2022).</li><li>Watanabe, S., Tsujino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+medium-chain+triglycerides+in+foods.">Applications of medium-chain triglycerides in foods.</a> Front Nutr. 9, 802805 (2022).</li><li>Meijaard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+impacts+of+palm+oil+in+context.">The environmental impacts of palm oil in context.</a> Nat Plants. 6 (12), 1418-1426 (2020).</li><li>Meijaard, E., Abrams, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogeneous+microbial+consortium+producing+short-chain+fatty+acids+from+lignocellulose.">A heterogeneous microbial consortium producing short-chain fatty acids from lignocellulose.</a> Science. 369 (6507), 1214 (2020).</li><li>Magdalena, J. A., Angenent, L. T., Usack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement,+application,+and+effect+of+oxygen+in+microbial+fermentations:+Focusing+on+methane+and+carboxylate+production.">The measurement, application, and effect of oxygen in microbial fermentations: Focusing on methane and carboxylate production.</a> Fermentation. 8 (4), 138 (2022).</li><li>Agler, M. T., Spirito, C. M., Usack, J. G., Werner, J. J., Angenent, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+highly+specific+and+productive+process+for+n-caproic+acid+production:+Applying+lessons+from+methanogenic+microbiomes.">Development of a highly specific and productive process for n-caproic acid production: Applying lessons from methanogenic microbiomes.</a> Water Sci Technol. 69 (1), 62-68 (2013).</li><li>Gildemyn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+syngas+fermentation+effluent+using+Clostridium+kluyveri+in+a+continuous+fermentation.">Upgrading syngas fermentation effluent using Clostridium kluyveri in a continuous fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 10 (1), 83 (2017).</li><li>Ge, S., Usack, J. G., Spirito, C. M., Angenent, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+n-caproic+acid+production+from+yeast-fermentation+beer+in+an+anaerobic+bioreactor+with+continuous+product+extraction.">Long-term n-caproic acid production from yeast-fermentation beer in an anaerobic bioreactor with continuous product extraction.</a> Env Sci Technol. 49 (13), 8012-8021 (2015).</li><li>Saboe, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+extraction+of+medium-chain+carboxylic+acids+at+a+semi-pilot+scale.">Production and extraction of medium-chain carboxylic acids at a semi-pilot scale.</a> Chem Eng J. 416, 127886 (2021).</li><li>Choi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+biphasic+extractive+fermentation+for+hexanoic+acid+production+from+sucrose+by+Megasphaera+elsdenii+NCIMB+702410.">In situ biphasic extractive fermentation for hexanoic acid production from sucrose by Megasphaera elsdenii NCIMB 702410.</a> Appl Biochem Biotechnol. 171 (5), 1094-1107 (2013).</li><li>Grootscholten, T., Steinbusch, K., Hamelers, H., Buisman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+medium+chain+fatty+acid+productivity+using+chain+elongation+by+reducing+the+hydraulic+retention+time+in+an+upflow+anaerobic+filter.">Improving medium chain fatty acid productivity using chain elongation by reducing the hydraulic retention time in an upflow anaerobic filter.</a> Bioresour Technol. 136, 735-738 (2013).</li><li>Grootscholten, T., Dal Borgo, F. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+elongation+with+reactor+microbiomes:+Upgrading+dilute+ethanol+to+medium-chain+carboxylates.">Chain elongation with reactor microbiomes: Upgrading dilute ethanol to medium-chain carboxylates.</a> Energy Environ Sci. 5 (8), 8189-8192 (2012).</li></ol>

Es besteht kein Interessenkonflikt.

Biologisch hergestellte MCFAs sind häufig in Gemischen neben verschiedenen organischen Verbindungen, einschließlich SCFAs und Alkoholen, enthalten2. Folglich ist ein selektiver Trennprozess notwendig, um sie zurückzugewinnen und effektiv zu verwerten. Das hier entwickelte LLE-System extrahiert selektiv und kontinuierlich MCFAs aus diesen Gemischen unter Schonung von SCFAs und Alkoholen. Diese Funktionalität macht das LLE-System besonders geeignet für Fermentationsanwendungen, wie z. B. die mikrobielle Kettenverlängerung, bei der MCFAs, SCFAs und Alkohole die primären Metaboliten darstellen8. Konkret ermöglicht das LLE-System den Ablauf des Kettenverlängerungsprozesses, indem MCFA entfernt werden, wodurch eine Produkthemmung1 verhindert wird, während die SCFA und die Alkoholreaktanten für die anschließende biologische Umwandlung in der Fermentationsbrühe verbleiben. Das LLE-System kann für andere Anwendungen angepasst werden, indem die spezifische Extraktionslösung modifiziert wird. Zum Beispiel könnte eine kontinuierliche Extraktion von SCFAs, die während der Fermentation anfallen, mit demselben LLE-System erreicht werden, indem TOPO aus dem Gemisch der Extraktionslösung entfernt wird.
Daher liegt die Bedeutung der LLE-Methode darin, dass sie im Vergleich zu anderen Methoden eine robustere MCFA-Extraktionstechnik für diese bioprozesstechnischen und biotechnologischen Anwendungen bereitstellt. Die biphasische In-situ-Extraktion mit nicht mischbaren Flüssigkeiten ist ein weiterer Ansatz zur Extraktion von MCFAs aus Fermentationsbouillon15. Dieser Ansatz ist jedoch relativ ineffizient. Zwischen der wässrigen Phase (d. h. der Fermentationsbrühe) und der organischen Phase bilden sich Emulsionsschichten, die die Stoffübergangsraten stark einschränken. Eine minimale Vermischung der Grenzflächenflüssigkeit zwischen den Phasenschichten begrenzt ebenfalls den Stofftransport. Ein weiterer Nachteil ist, dass mikrobielle Zellen in direktem Kontakt mit der organischen Phase stehen, was zu Entrainment, Hemmung und Zelltod führt15. Schließlich erfordert die biphasische In-situ-Extraktion eine häufige Wartung, um die organische Phase zu entfernen und zu ersetzen.
Das Anwenden hoher Verdünnungsraten innerhalb des Bioreaktors ist ein weiteres Verfahren zur Vermeidung einer Produkthemmung16. Hohe Verdünnungsraten können eine hohe Produktivität erzielen, indem hohe Reaktantenkonzentrationen im Bioreaktor aufrechterhalten werden. Dieser Ansatz ist jedoch nachteilig, da er zur Auswaschung der Biomasse, zur Erzeugung großer Abwassermengen und zu hohen Substratverlusten (z. B. SCFAs und Alkohole) beiträgt, was zu geringen Erträgen führt. Diese Nachteile können durch immobilisierte Biomasse und Abwasserrecycling gemildert werden, aber diese Eingriffe erhöhen die Systemkomplexität17. Schließlich wird die MCFA-Konzentration im Produktstrom verdünnt, was MCFA ineffizient und kostspielig macht.
Ein neuer Extraktionsansatz könnte darin bestehen, die MCFAs kontinuierlich mit einer einzigen Vorwärtsextraktionsmembran zu destillieren, die die organische und die wässrige Phase physikalisch trennt und so die mikrobielle Biomasse zurückhält und schützt. Die MCFAs würden selektiv in die organische Phase extrahiert und dann destilliert. Das Raffinat konnte kontinuierlich in die Extraktionsmembran zurückgeführt werden. Die kontinuierliche Destillation ist jedoch eine technische Herausforderung, insbesondere im Labor, und kann während des Langzeitbetriebs zu einer Verschlechterung oder einem Verlust des chemischen Extraktionsmittels führen. Die Destillation kann auch zu einer thermischen Degradation der organischen Phase und der MCFA-Produkteführen 18.
Der LLE-Prozess vermeidet viele der Nachteile, die mit diesen alternativen Ansätzen verbunden sind, indem er mehrere kritische Merkmale und Verarbeitungsschritte integriert. Erstens dient der hydrophile Hohlfaser-Membranfilter dem doppelten Zweck, Biomassezellen (die Biokatalysatoren) vor der Exposition gegenüber der Extraktionslösung im FEB zu schützen und gleichzeitig ein klares MCFA-reiches Filtrat bereitzustellen, das Verschmutzung und Feststoffakkumulation im LLE-System reduziert. Zweitens haben wir, um ein Überkreuzen von Flüssigkeit zu verhindern, Nadelventile eingebaut, um einen Gegendruck auf der Rohrseite jedes Membranschützors zu erzeugen. Diese Vorsichtsmaßnahme hält einen leichten Transmembrandruckgradienten aufrecht und verhindert so ein unerwünschtes Austreten des hydrophoben organischen Lösungsmittels von der Mantelseite zur wässrigen Rohrseite im FEM und BEM. Darüber hinaus sind die Flüssigkeitsströme so konfiguriert, dass sie parallel von der Basis zur Oberseite des FEM und BEM fließen, um das Einfangen von Gasblasen zu verhindern, die sich in den Membranmodulen ansammeln könnten, was die Übertragungseffizienz verringert und eine Verschleppung verursacht. Darüber hinaus wird bei diesem Verfahren eine Membranpumpe mit einem chemisch beständigen PTFE-Pumpenkopf verwendet, um die korrosive MCFA-haltige Extraktionslösung zu pumpen und so das System vor Korrosion und Ausfällen zu schützen, die den Extraktionsprozess beeinträchtigen könnten. Schließlich behält die pH-kontrollierte alkalische Stripping-Lösung einen pH-Gradienten bei, der den kontinuierlichen Transfer von MCFAs durch das LLE-System mit hohen Raten vom Bioreaktor zum Stripping-Lösungsreservoir ermöglicht, wo die MCFAs deprotonieren und sich zu hohen Titern ansammeln, was die nachgelagerte Produktrückgewinnung erleichtert.
Diese LLE-Methode eignet sich für die kontinuierliche MCFA-Extraktion aus Bioreaktoren im Labormaßstab (bis zu einem Arbeitsvolumen von 6 l) und wurde in mehreren Studien für den Langzeitbetrieb validiert 1,9,11,19. Das LLE-Verfahren kann auch für größere Anwendungen14 (d. h. Bioreaktoren im Pilotmaßstab) angewendet werden, erfordert jedoch proportional skalierte Membranen und Fluid-Handling-Geräte. Die Methode hat jedoch einige Einschränkungen, vor allem im Bereich der Wartung und der Systemkomplexität. Da der Prozess auf einen kontinuierlichen Betrieb ausgelegt ist, müssen die Membranmodule und Pumpen häufig gewartet werden, was zu erheblichen Stillstandszeiten führt. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Stripping-Lösung relativ große Mengen an NaOH und Borsäure benötigt. Darüber hinaus sind MCFAs korrosiv und führen dazu, dass sich bestimmte LLE-Systemkomponenten im Laufe der Zeit verschlechtern. So können z.B. Kunststoffverbinder und das Membrangehäuse spröde werden, so dass sie während des Betriebs ausgetauscht werden müssen. Schließlich ist das Fluid-Handling-Netzwerk im LLE-System komplex und umfasst viele Verbindungspunkte, an denen sich Leckagen entwickeln können. Die meisten dieser Einschränkungen und Nachteile sind jedoch typisch für kontinuierliche Membrantrennverfahren und sollten erwartet werden.
Insgesamt bietet dieses LLE-Protokoll einen robusten und effizienten Ansatz für die selektive MCFA-Extraktion, der Auswirkungen auf die Förderung der Forschung in verschiedenen Bereichen hat. Das Verfahren könnte viele relevante Anwendungen im Bereich der Präzisionsfermentation zur in-situ Rückgewinnung von extrazellulären Metabolitenprodukten während der Fermentation finden. LLE könnte eine kostengünstigere Alternative zu herkömmlichen Downstream-Processing-Ansätzen (DSP) sein, wie z. B. Zentrifugation nach dem Lauf, Mikro- und Ultrafiltration oder Lösungsmittelextraktionen, die in Chargen durchgeführt werden. In der Tat stellt DSP oft einen großen Kostentreiber in industriellen Fermentationsprozessen dar. Die kontinuierliche Produktextraktion mit LLE kann auch kontinuierliche Fermentationen ermöglichen, was die Produktivität und Laufzeiteffizienz des Betriebs im Vergleich zu herkömmlichen Batch- oder Fed-Batch-Ansätzen drastisch verbessert. Zukünftige Forschungen könnten auch andere Extraktionsmittel als organische Lösungsmittel untersuchen, wie z. B. tiefe eutektische Lösungsmittel oder ionische Flüssigkeiten. Schließlich war das in diesem Protokoll beschriebene LLE-System für Versuchszwecke in einer Laborumgebung bestimmt; Daher besteht noch erheblicher Spielraum für Optimierungsstudien, um den Energiebedarf, die Membranfläche sowie die Gesamtextraktionserträge und -raten zu reduzieren.

Mittelkettige Fettsäuren (MCFAs) sind hochwertige Bausteinchemikalien mit Kettenlängen von sechs (C6) bis zwölf (C12) Kohlenstoffatomen. MCFAs finden industrielle Anwendungen in Lebensmitteln, Futtermitteln, Pharmazeutika, Kosmetika, Duftstoffen, antimikrobiellen Wirkstoffen und in der chemischen Synthese 1,2,3. Derzeit werden die meisten MCFAs aus Palm- und Kokosöl gewonnen, das aus Südostasien und Südamerika stammt 4,5. Die schwerwiegenden ökologischen Schäden, die mit der Produktion von Palm- und Kokosöl verbunden sind, werden von Interessengruppen und der Öffentlichkeit anerkannt. Die Forscher erforschen biologische Ansätze (z. B. Präzisions- und Open-Culture-Fermentationen), um MCFAs nachhaltiger zu erzeugen, indem sie minderwertige Substrate oder organische Abfälle als Ausgangsmaterial verwenden 6,7. Eine nachhaltige Möglichkeit zur Herstellung von MCFAs ist das Upcycling organischer Abfallströme mit einem Verfahren namens mikrobielle Kettenverlängerung (CE). Dieser sekundäre Fermentations-Bioprozess ähnelt der anaeroben Vergärung insofern, als er die Vielseitigkeit anaerober Open-Culture-Mikrobiome ausnutzt, aber anstatt die Methanbildung zu fördern, unterdrücken CE-Systeme bewusst den methanogenen Weg. In einem Mikrobiom, in dem Kohlenstoff nicht maximal zu CH4 reduziert werden kann und H2 nicht durch wasserstoffverbrauchende Archaeen unter 10-4 atm gehalten werden kann, kann die β-Oxidationsreaktion, die normalerweise längerkettige Carboxylate zu Acetat abbauen würde (z. B. C6 → C4 → C2), rückgängig gemacht werden (z. B. C2 → C4 → C6 usw.), solange eine reduzierte Verbindung (d. h. B. Elektronendonor) wie Ethanol oder Laktat zugeführt wird8. In diesem Stoffwechsel dient das Fettsäuremolekül, das sich in der Dehnung befindet, als Elektronenakzeptor. Anstatt also wie bei der anaeroben Vergärung ein Produkt mit einer Kohlenstofflänge von eins (CH4) zu erzeugen, erzeugt das CE-Verfahren MCFAs mit Kohlenstofflängen von sechs bis acht. Ein großer und wachsender Markt ist bereit, diese grünen Plattformchemikalien zu erhalten. Bisher konnte jedoch nicht gezeigt werden, dass das CE-Verfahren MCFAs mit Kohlenstofflängen von mehr als acht Kohlenstoffen in nennenswerten Raten produziert.
Eine effiziente Extraktion dieser MCFAs ist nicht nur für die Rückgewinnung des gewünschten Produkts wichtig, sondern auch, um eine Produkthemmung zu verhindern und das Mikrobiom zur Produktion von mehr MCFAs zu bewegen1. Mit zunehmender Konzentration von MCFAs wird der MCFA-Stoffwechsel gehemmt und wird thermodynamisch ungünstiger. Durch die kontinuierliche Entfernung der MCFAs werden die Produktionsraten aufrechterhalten. Da SCFAs als Untergerüste für den Prozess der Kettenverlängerung dienen, sollten sie nicht aus der Fermentationsbrühe entfernt werden. Gezielte Extraktionsmittelmischungen sollten MCFA-Produkte selektiv aus Fermentationsbrühen extrahieren, die SCFAs enthalten.
Hier wird ein robuster und praktischer Ansatz zur kontinuierlichen Extraktion von MCFAs aus SCFA-haltiger Fermentationsbouillon unter Verwendung eines Flüssig-Flüssig-Extraktionssystems (LLE) demonstriert, das aus einem hydrophoben Polypropylen-Hohlfasermembranextraktor, einer selektiven organischen Extraktionslösung (Trioctylphosphinoxid [TOPO]9,10,11) und ein Rückwärts-Hohlfaser-Membranabsauger. Dem LLE-System ist ein Cell-Guard-Filter vorgeschaltet, um Biomasse zurückzuhalten und Membranverschmutzung zu mindern. Die MCFAs werden in ihrer protonierten Form aus der wässrigen Fermentationsbouillon (typischerweise mit einem pH-Sollwert <5,8) in eine organische Extraktionslösung (d. h. 3 % TOPO (w/v) in Mineralöl) vorextrahiert und dann rückwärts in eine alkalische Strippinglösung (pH = 9) extrahiert, wo sie deprotonieren und sich für die nachgelagerte Verarbeitung auf hohe Titer konzentrieren. Die jeweiligen pH-Sollwerte sind wichtig, da sie den Konzentrationsgradienten zwischen den einzelnen Phasen des LLE-Prozesses bestimmen und so einen Nettotransfer von MCFAs aus der Fermentationsbrühe in die Stripplösung gewährleisten. LLE mit Vorwärts- und Rückwärtsextraktionsmembranen erzielen hohe Extraktionsraten bei gleichzeitiger Minimierung der Ko-Extraktion von Alkoholen und SCFAs. Das organische Lösungsmittel-Adjuvans TOPO ermöglicht die Bildung von MCFA-Komplexen. Diese Komplexe sind in organischen Phasen besser löslich als Wasser, was zu einer hohen MCFA-Selektivität führt. Der LLE-Prozess vermeidet auch die vielen Nachteile, die mit bestehenden Ansätzen verbunden sind und die im Abschnitt Diskussion diskutiert werden. Die langfristige Implementierung mit diesem LLE-Ansatz wurde in mehreren Studien nachgewiesen 9,10,11. Während dieser Ansatz besonders für Anwendungen geeignet ist, bei denen MCFA-Produktion über mikrobielle Kettenverlängerung erfolgt, ist er auch in anderen Anwendungen nützlich, die eine selektive Trennung von Verbindungen mit ähnlichen chemischen Eigenschaften erfordern, da das organische Extraktionssystem angepasst werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 L Media Bottle</td>
			<td>Duran</td>
			<td>218018658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Media Bottle</td>
			<td>Duran</td>
			<td>218016957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, 99.5%,&#160;</td>
			<td>ThermoScientific (Fisher Scientific)</td>
			<td>327132500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophilic MINIKROS 20CM 0.2UM PES 1MM 1.5TC X 3/4TC</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>N02-P20U-10-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Pump Drive; 100 rpm</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07528-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Pump Drive; 300 rpm</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07528-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Mineral Oil, NF (4 Liters) (CAS: 8042-47-5)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C761Z18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Cel 2.5x8 X50 membrane CO2, PP Housing Viton O-rings (0.5-3 gpm (0.1-0.7 m3/h)), 1/4-in FNPT connections</td>
			<td>3M</td>
			<td>LC-02508X50-G453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer, 20 L Capacity, 110 V</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-04661-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 14</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX06402-14</td>
			<td>Specific tubing size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 16</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX06402-16</td>
			<td>Specific tubing size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 17</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX06402-17</td>
			<td>Specific tubing size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 18</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX06402-18</td>
			<td>Specific tubing size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 14, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07014-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 14, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07014-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 16, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07016-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 17, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07017-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 18, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07018-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex PTFE-diaphragm pump head, 10 to 100 mL/min</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07090-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oakton 220 pH/ORP/Temperature Controller, 1/8 DIN</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products</td>
			<td>664-12595-E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oakton 220 pH/ORP/Temperature Controller, 1/8 DIN</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products</td>
			<td>664-12595-E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oakton Female BNC-to-Stripped Wire Adapter</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products</td>
			<td>664-12592-E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Probe with BNC Connector</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10010-788</td>
			<td>Any pH probe with a BNC connector will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Flow-Adjustment Valve, White Polypropylene, 1/4 NPT Male x Male</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>7792K57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProConnex&#160; Fittings Kits - A</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>ACPX-KT2-01N</td>
			<td>Compatible with Hydrophilic MINIKROS Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProConnex Fittings Kits - B</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>ACPX-KT1-01N</td>
			<td>Compatible with Hydrophilic MINIKROS Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Pellets for Analysis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-Steel Pressure Gauge 0-60 psi Stainless Steel 1/4&#34; NPT 2.5&#34; Face Dial</td>
			<td>NA</td>
			<td>XJ-219</td>
			<td>Any comparable pressure gauge covering 0-60 psig range will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trioctylphosphine oxide (TOPO)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346187-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous liquid-liquid extraction of medium-chain fatty acids from fermentation broth using hollow-fiber membranes

Mittelkettige Fettsäuren (MCFAs; Kohlenstofflängen: C6-C12) sind hochwertige Plattformchemikalien, die eine Vielzahl von industriellen Anwendungen bedienen, darunter grüne antimikrobielle Mittel, Lebensmittelzutaten, Futtermittelzusatzstoffe, Kosmetika, Duftstoffe, Pharmazeutika und strukturierte Lipide. Derzeit werden die meisten MCFAs aus Palm- und Kokosöl hergestellt, das aus Südostasien und Südamerika stammt. Die konventionelle Herangehensweise an die Ernte von Palm- und Kokosfrüchten verursacht in diesen Regionen erhebliche ökologische Schäden. Daher entwickeln Forscher biologische Ansätze (z. B. Präzisions- und Open-Culture-Fermentationen), um MCFAs nachhaltiger zu erzeugen, indem sie minderwertige Substrate (z. B. Methanol, Ethanol, Laktat) oder organische Abfälle als Ausgangsmaterial verwenden. Die mikrobielle Kettenverlängerung (CE) ist eine schnell reifende Fermentationsplattform in offenen Kulturen, die kurzkettige Fettsäuren (SCFAs; Kohlenstofflängen: C1-C5) in eine Untergruppe dieser MCFAs mit industriell relevanten Raten umwandelt. Eine kontinuierliche In-situ-Extraktion von MCFA-Produkten ist jedoch nicht nur notwendig, um Produkthemmungen zu vermeiden, sondern auch um die Rückgewinnung von MCFAs in reiner und verwertbarer Form zu erleichtern. Die Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) unter Verwendung von Hohlfasermembranen und gezielten Extraktionsmittelmischungen hat sich als robuster Ansatz zur selektiven Extraktion von MCFA-Produkten aus Fermentationsbrühen erwiesen, die SCFAs enthalten. Hier wird die Anwendung von LLE zur kontinuierlichen MCFA-Entfernung unter Verwendung von CE als Referenzfermentationssystem und 3 % (w/v) Trioctylphosphinoxid in Mineralöl als Extraktionssystem demonstriert. Fettsäuren von Valeriansäure (C5) bis Caprylsäure (C8) werden selektiv aus SCFA-haltigen Brühen entfernt und in einer alkalischen Semi-Batch-Stripping-Lösung für die Weiterverarbeitung auf hohe Titer konzentriert.

Medium-chain fatty acids (MCFAs) are high-value building block chemicals comprising chain lengths ranging from six (C6) to twelve (C12) carbons. MCFAs have industrial applications in foods, animal feeds, pharmaceuticals, cosmetics, fragrances, antimicrobial agents, and chemical synthesis1,2,3. Currently, most MCFAs derive from palm and coconut oil sourced from Southeast Asia and South America4,5. The severe ecological damage associated with palm and coconut oil production is well-recognized by stakeholders and the general public. Researchers are exploring biological approaches (e.g., precision and open-culture fermentations) to generate MCFAs more sustainably using low-value substrates or organic wastes as feedstock6,7. One sustainable way to produce MCFAs is by upcycling organic waste streams using a process called microbial chain elongation (CE). This secondary fermentation bioprocess is similar to anaerobic digestion in that it exploits the versatility of anaerobic open-culture microbiomes, but instead of promoting methane formation, CE systems deliberately suppress the methanogenic pathway. In a microbiome where carbon cannot be maximally reduced to CH4, nor H2 maintained below 10-4 atm by hydrogen-consuming archaea, the &#946;-oxidation reaction that would normally break down longer chain carboxylates to acetate (e.g., C6 &#8594; C4 &#8594; C2) can be reversed (e.g., C2 &#8594; C4 &#8594; C6, etc.), so long as a reduced compound (i.e., electron donor) such as ethanol or lactate is supplied8. In this metabolism, the fatty acid molecule undergoing elongation serves as the electron acceptor. Thus, instead of generating a product with a carbon length of one (CH4) as in anaerobic digestion, the CE process generates MCFAs with carbon lengths ranging from six to eight. A large and growing market is ready to receive these green platform chemicals. However, thus far, the CE process has not been shown to produce MCFAs with carbon lengths exceeding eight carbons at appreciable rates.
Efficient extraction of these MCFAs is important not only for the recovery of the desired product but also to prevent product inhibition and push the microbiome toward producing more MCFAs1. As the concentration of MCFAs increases, MCFA metabolism is inhibited and becomes less thermodynamically favorable. By removing the MCFAs continuously, production rates are maintained. Also, because SCFAs serve as the substructures for the chain-elongation process, they should not be removed from the fermentation broth. Targeted extractant mixtures should selectively extract MCFA products from fermentation broths containing SCFAs.
Here, a robust and practical approach is demonstrated to continuously extract MCFAs from SCFA-containing fermentation broth using a liquid-liquid extraction (LLE) system comprising a hydrophobic, polypropylene forward hollow-fiber membrane extractor, a selective organic extractant solution (trioctylphosphine oxide [TOPO]9,10,11), and a backward hollow-fiber membrane extractor. A cell-guard filter upstream of the LLE system is installed to retain biomass and mitigate membrane fouling. The MCFAs are forward extracted, in their protonated form, from the aqueous fermentation broth (typically with a pH set point &#60;5.8) into an organic extractant solution (i.e., 3% TOPO (w/v) in mineral oil) and then backward extracted into an alkaline stripping solution (pH = 9), where they deprotonate and concentrate to high titers for downstream processing. The particular pH set points are essential because they dictate the concentration gradient between each phase of the LLE process, ensuring a net transfer of MCFAs from the fermentation broth to the stripping solution. LLE using forward and backward extraction membranes achieve high extraction rates while minimizing alcohols and SCFAs co-extraction. The organic solvent adjuvant, TOPO, enables the formation of MCFA complexes. These complexes are more soluble in organic phases than water, resulting in high MCFA selectivity. The LLE process also avoids the many disadvantages associated with existing approaches, which will be discussed in the Discussion section. Long-term implementation using this LLE approach has been demonstrated in multiple studies9,10,11. While this approach is particularly suitable for applications involving MCFA production via microbial chain elongation, it is also useful in other applications that require selective separation of compounds possessing similar chemical properties because the organic extractant system can be customized.

Autor im Rampenlicht: Optimierung von Hohlfasermembranen für die kontinuierliche Flüssig-Flüssig-Extraktion von mittelkettigen Fettsäuren

Kontinuierliche Flüssig-Flüssig-Extraktion von mittelkettigen Fettsäuren aus Fermentationsbouillon mit Hilfe von Hohlfasermembranen

Positive MCFA-Extraktionsergebnisse werden durch eine stetige Akkumulation von MCFA-Produkten in der alkalischen wässrigen Strippinglösung (Abbildung 2) und relativ stabile MCFA-Konzentrationen in der Fermentationsbrühe angezeigt (Daten nicht gezeigt). Abbildung 2 zeigt drei Semi-Batch-Zyklen der Abstreiflösung während des kontinuierlichen LLE-Betriebs. Ein Zyklus besteht aus zwei Phasen: der Phase des Chargenaustauschs (Abbildung 2: Tag 24, Tag 46 und Tag 68) und der MCFA-Akkumulationsphase (Abbildung 2: Tage 0-24, Tage 25-46, Tage 47-68). Für dieses spezielle Fermentations- und LLE-System betrug die Zyklusdauer etwa 20-24 Tage. Die Zyklusdauer variiert jedoch je nach Anwendung, da sie von mehreren Faktoren abhängt, darunter das Volumen des Bioreaktors, die biologische Produktivität, das Volumen der Stripping-Lösung, die Fläche der Hohlfasermembran und die Flüssigkeitsrezirkulationsraten innerhalb des LLE-Systems. Während eines Chargenzyklus kann sich die Farbe der Stripplösung von klar zu gelblich-braun ändern, da verschiedene kleine organische Säuren (z. B. Huminsäure, Fulvosäuren), die in der Fermentationsbrühe vorhanden sind, in geringem Maße mitextrahiert werden (Abbildung 3). Negative MCFA-Extraktionsergebnisse werden durch eine langsame Akkumulation von MCFA-Produkten in der Stripping-Lösung und erhöhte MCFA-Konzentrationen in der Fermentationsbrühe im Vergleich zum vorab festgelegten Ausgangswert angezeigt.
Die biologische Produktivität von Caproat ist bei diesen Fermentationsprozessen im Allgemeinen höher als die von Caprylat; Daher ist es üblich, dass sich Caproat im Vergleich zu Caprylat schneller in der Stripplösung ansammelt. Außerdem ist es normal, dass sich SCFAs wie Acetat und Butyrat in geringeren Mengen in der Stripplösung ansammeln, wie in Abbildung 2 zu sehen ist. Das TOPO im Mineralöl hat eine höhere Affinität zu MCFAs als zu SCFAs, was eine selektive Entfernung der MCFAs bewirkt. Studien von Saboe et al.12, Kaur et al.13, Carvajal-Arroyo et al.14 und Ge et al.11 zeigten die hohe Selektivität von TOPO für Fettsäuren in mehreren Anwendungen mit wässrigen Lösungen. Das Partitionierungsverhältnis von MCFAs zu SCFAs während des zweiten Batch-Zyklus ist in Abbildung 4 dargestellt. Man kann MCFA:SCFA-Partitionierungsverhältnisse von mehr als 40:1 mehrere Tage nach Beginn eines Batch-Zyklus erwarten. Das MCFA:SCFA-Partitionierungsverhältnis wird ein Plateau erreichen, wenn sich der Extraktionsprozess einem pseudostationären Zustand nähert. Wenn nach mehreren Tagen keine Verhältnisse >40 erreicht werden können, deutet dies darauf hin, dass das TOPO-Extraktionsmittel abgebaut oder eluiert wurde. In diesem Fall sollte eine neue Extraktionslösung hergestellt werden (siehe Schritt 1.1). Wenn das Verhältnis nach der Plateauphase abnimmt, deutet dies darauf hin, dass sich die MCFAs über 80 % ihres Sättigungspunktes angesammelt haben. In diesem Fall sollte eine neue Abstreiflösung hergestellt werden (siehe Schritt 1.4)
Eine niedrige MCFA-Extraktionseffizienz kann durch unzureichende Durchflussraten innerhalb des LLE-Systems verursacht werden. In Abbildung 5 wurde das Saugvermögen in der Zirkulationsleitung für Fermentationsbrühe und Stripplösung reduziert, um die Auswirkungen verminderter Flüssigkeitsrezirkulationsraten auf die MCFA-Extraktionseffizienz zu veranschaulichen. Die Extraktionseffizienz ist definiert als der prozentuale Anteil der in der Stripping-Lösung extrahierten MCFA im Verhältnis zu den insgesamt vom Bioreaktor produzierten MCFAs zuzüglich der durch die LLE extrahierten MCFAs. Im Normalbetrieb ist mit einer Extraktionseffizienz von mehr als 85 % zu rechnen (Abbildung 5, Tag 1-14). Wenn die Pumpendrehzahl niedrig ist (Abbildung 5, Tag 14), nimmt die Absaugeffizienz entsprechend ab. Wenn eine angemessene Pumpendrehzahl wiederhergestellt ist, kann es mehrere Tage dauern, bis sich die Extraktionseffizienz erholt hat. Dies könnte durch eine Verringerung der Steady-State-Konzentration von MCFAs in der Extraktionslösung verursacht werden, die durch den Unterschied in den Extraktionsraten der Stripplösung (höher) und der Fermentationsbrühe (niedriger) verursacht wird.
Mehrere andere Faktoren können zu einer verminderten Extraktionseffizienz beitragen, darunter (1) Membranverschmutzung, (2) eingeschränkter Flüssigkeitsfluss in jeder Phase des LLE-Systems aufgrund von Verstopfungen, (3) die Bildung von Gastaschen in den Membrankontaktoren und (4) die Möglichkeit, dass sich die MCFA-Konzentrationen in der Stripping-Lösung ihren Sättigungspunkten nähern. Membranverschmutzung wird durch eine Verringerung des Membranflusses im Laufe der Zeit im Vergleich zu den Anfangsbedingungen angezeigt. Während eine Biofilmbildung bei der FEM unwahrscheinlich ist, kann es aufgrund der Ansammlung von Zelltrümmern und anderen Schwebstoffen zu Verschmutzung kommen. Obwohl das BEM aseptisch ist, kann der Durchfluss durch die Ausfällung von Fettsäuresalzen im Membrankontaktor oder in den Schläuchen im Laufe der Zeit behindert werden. Durch die routinemäßige Wartung und Reinigung der Membrankontaktoren (siehe Schritt 2.6) sollte jedoch die Entwicklung von Verschmutzungs- und Salzausfällungsproblemen ausgeschlossen werden. Auf der Oberseite der Membrankontaktoren bilden sich manchmal Gaseinschlüsse aufgrund einer falschen Positionierung. Die Membrankontaktoren sollten leicht aus der Vertikalen geneigt werden, um sicherzustellen, dass sich die Auslassöffnung auf der Gehäuseseite am höchsten Punkt befindet, damit das sich bildende Gas aus dem Schütz entweichen kann. Der Flüssigkeitsfluss im LLE-System ist so konfiguriert, dass er von unten nach oben fließt, um Gastaschen auszuspülen. Schließlich wird der MCFA-Transfer von der Extraktionslösung auf die Stripperlösung im BEM bei sehr hohen MCFA-Konzentrationen in der Stripping-Lösung verringert. Dieses Problem kann behoben werden, indem die Abisolierlösung häufiger ausgetauscht wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über das Flüssig-Flüssig-Extraktionssystem. Ein schematisches Rendering, das die wichtigsten Systemkomponenten, die verschiedenen Fluidkreisläufe und die Strömungsrichtungen zeigt. Die Hauptkomponenten des Systems sind wie folgt gekennzeichnet: (A) Reservoir für die Extraktionslösung in der organischen Phase, (B) Vorwärtsaustauschmembran, (C) Rückwärtsaustauschmembran, (D) Membranpumpe für Extraktionslösung, (E) Reservoir für Wässrige Phasen-Stripping-Lösung, (F) pH-Kontrollsystem, (G) Ausströmöffnung des Bioreaktors, (H) Rücklauföffnung des Bioreaktors, (I) Vorwärtsaustauschmembran und Peristaltikpumpe für Hohlfasermembranfilter, (J) Hohlfasermembranfilter, (K) Manometer, (L) Nadelventil und (M) Schlauchpumpe für Abstreiflösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig02.jpg"> Abbildung 2: Fettsäureakkumulation in der Stripping-Lösung. Daten, die die Konzentrationen von kurzkettigen Fettsäuren und mittelkettigen Fettsäuren während drei Chargenzyklen der Stripping-Lösung während eines kontinuierlichen Flüssig-Flüssig-Extraktionsvorgangs zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig03.jpg"> Abbildung 3: Farbänderung der Stripping-Lösung nach der Extraktion. Ein Foto, das die Farbänderung der wässrigen Phasenstripping-Lösung vor (d. h. vor der Charge) und nach (d. h. nach der Charge) eines Chargenzyklus zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig04.jpg"> Abbildung 4: Fettsäureverhältnisse in der Stripplösung. Daten, die das Verhältnis von mittelkettigen Fettsäuren zu kurzkettigen Fettsäuren während eines Chargenzyklus der Stripping-Lösung während eines kontinuierlichen Flüssig-Flüssig-Extraktionsvorgangs zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig05.jpg"> Abbildung 5: Einfluss der Membranflussraten auf die Extraktionseffizienz. Daten, die den Einfluss unzureichender Flussraten durch die Vorwärts- und Rückwärtsaustauschmembran auf die Effizienz der mittelkettigen Fettsäureextraktion während des Betriebs zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Es wurde ein Flüssig-Flüssig-Extraktionssystem (LLE) mit Hohlfasermembranen entwickelt, um mittelkettige Fettsäuren (MCFAs) kontinuierlich und selektiv aus der Fermentationsbrühe zu extrahieren. Das LLE-System erreicht hohe MCFA-Spezifitäten aus Brühen, die kurzkettige Fettsäuren und Alkohole enthalten. Außerdem werden MCFAs in einer Stripping-Lösung konzentriert, um die Produktrückgewinnung zu erleichtern.

Medium-chain fatty acids (MCFAs; carbon-lengths: C6-C12) are high-value platform chemicals that serve a variety of industrial applications, including ...

continuous-liquid-liquid-extraction-medium-chain-fatty-acids-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Liquid-Liquid Extraction of Medium-Chain Fatty Acids from Fermentation Broth Using Hollow-Fiber Membranes

603 Aufrufe.  University of Georgia. Meine Forschung zielte darauf ab, die Effizienz von Hohlfasermembranen und die kontinuierliche Flüssig-Flüssig-Extraktion von mittelkettigen Fettsäuren aus Fermentationsbrühe zu bewerten. Ich versuche zu verstehen, wie sich diese Membran von herkömmlichen Techniken unterscheidet, indem ich den Extraktionsprozess optimiere und die Skalierbarkeit dieser Methode für den industriellen Einsatz bestimme. Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen geh?...

Serie: Autor im Rampenlicht: Optimierung von Hohlfasermembranen für die kontinuierliche Flüssig-Flüssig-Extraktion von mittelkettigen Fettsäuren

Medium-chain fatty acids (MCFAs; carbon-lengths: C6-C12) are high-value platform chemicals that serve a variety of industrial applications, including green antimicrobials, food ingredients, animal feed additives, cosmetics, fragrances, pharmaceuticals, and structured lipids. Currently, most MCFAs are produced from palm and coconut oil originating from Southeast Asia and South America. The conventional approach to harvesting palm and coconut fruits causes considerable ecological damage in these regions. Therefore, researchers are developing biological approaches (e.g., precision and open-culture fermentations) to generate MCFAs more sustainably using low-value substrates (e.g., methanol, ethanol, lactate) or organic wastes as feedstock. Microbial chain-elongation (CE) is a rapidly maturing open-culture fermentation platform that converts short-chain fatty acids (SCFAs; carbon lengths: C1-C5) into a subset of these MCFAs at industrially relevant rates. However, continuous in situ extraction of MCFA products is necessary not only to avoid product inhibition but also to facilitate the recovery of MCFAs in a pure and usable form.&#160;Liquid-liquid extraction (LLE) using hollow-fiber membranes and targeted extractant mixtures has proven a robust approach to selectively extract MCFA products from fermentation broths containing SCFAs. Here, the application of LLE for continuous MCFA removal is demonstrated using CE as the reference fermentation system and 3% (w/v) trioctylphosphine oxide in mineral oil as the extractant system. Fatty acids ranging from valeric acid (C5) to caprylic acid (C8) are selectively removed from SCFA-containing broths and concentrated to high titers in a semi-batch alkaline stripping solution for downstream processing.

A liquid-liquid extraction (LLE) system involving hollow-fiber membranes was developed to continuously and selectively extract medium-chain fatty acids (MCFAs) from the fermentation broth. The LLE system achieves high MCFA specificities from broths containing short-chain fatty acids and alcohols. Also, MCFAs are concentrated in a stripping solution to facilitate product recovery.