Ein Teil dieser Arbeit wurde durch das Institut zur Förderung der Innovation durch Wissenschaft und Technologie-strategische Grundlagenforschung (IWT-SBO) Projekt Sonnenlicht und Biosolar Zellen unterstützt. Erik Bolder und BackKim Nguyen sind für ihren Beitrag zur Optimierung der Wulst Schlagen Verfahren anerkannt.

1. Probenvorbereitung Es gibt zwei alternative Protokolle für die Probenvorbereitung enthalten wie die Schritte 1.1 und 1.2. Beide Verfahren sind gleichermaßen geeignet und ergeben ähnliche Ergebnisse, aber, wenn eine begrenzte Menge von Algen Kulturvolumen zur Verfügung steht, ist 1,1-Methode empfohlen. HINWEIS: Für beide Protokolle, bereiten zwei zusätzliche Kugelmühle Rohre nach die gesamte Protokoll, jedoch ohne Zugabe von Algen, um sie als eine leere verwendet werden. Auf diese Weise können Peaks im GC-Chromatogramm von der Extraktion von Komponenten aus den verwendeten Materialien identifiziert und quantifiziert werden. 1.1. Probenvorbereitung Protokoll Option 1: Empfohlen, wenn eine begrenzte Anzahl von Algenkulturen ist verfügbar <ol><li> Bestimmen Sie die Algentrockenmasse-Konzentration (g / L) in der Kulturbrühe, zum Beispiel wie von Breuer et al. Ein. </li><li> Wird ein Volumen von Kulturbrühe, die 5-10 mg Algentrockenmasse enthält, umein Glaszentrifugenröhrchen. Berechnen Sie die genaue Menge an Biomasse überführt mit der Biomassekonzentration in Schritt 1.1.1 bestimmt. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 1.200 x g. </li><li> Entsorgen Sie Teil der Überstand, lassen etwa 0,25 ml in die Röhre. </li><li> Re-suspend die Algen in dem verbleibenden Überstand durch vorsichtiges Pipettieren der Pellet auf und ab und übertragen die komplette Zellpellet zu einer Kugelmühle Rohr mit einer 200 ul Pipette. </li><li> Mit ± 0,15 ml Milli-Q-Wasser spülen die Zentrifugenröhrchen und Glaspipette und dann die Flüssigkeit auf die gleiche Kugelmühle Röhre. </li><li> Zentrifugenröhrchen Kugelmühle für eine Minute bei Höchstdrehzahl, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Unterseite der Rohre bleiben. Es ist möglich, geschlossene Kugelmühle Röhrchen bei -80 ° C lagern </li><li> Lyophilisieren die Kugelmühle Rohre mit der Probe. Es ist möglich, die geschlossene Kugelmühle Röhrchen bei -80 ° C aufbewahren </li></ol> 1.2. Probenvorbereitung Protokoll Option 2 <ol><li> Zentrifugieren Sie eine unbestimmte Volumen von Algen Kulturbrühe und Überstand verwerfen. Es ist nicht notwendig, die Konzentration der Biomasse zu bestimmen oder die verwendete Volumen zu messen. </li><li> Messung oder Berechnung der Osmolarität des Kulturmediums mit der Konzentration der in dem Kulturmedium vorhanden Haupt Salze. </li><li> Waschen des Zellpellets durch Resuspendieren des Zellpellets in dem gleichen Volumen, wie es in Schritt 1.2.1, einer Ammoniumformiat-Lösung, die die Osmolarität des Kulturmediums annähert. Ein equiosmolar Ammoniumformiat-Lösung verhindert Zelllyse beim Waschen der Zellen. </li></ol> HINWEIS: Waschen der Zellen notwendig ist, um in dem Kulturmedium enthaltenen Salze zu entfernen. Dies ist wegen der hohen Salzkonzentrationen in ihrem Kulturmedium besonders wichtig für die Fettsäureanalyse in Meeresmikroalgen. Wenn Salze immer noch vorhanden sein, würde diese Überschätzung der Höhe der Zelltrockengewicht, die später in t festgelegt wird dazu führen,seinem Protokoll. Ammoniumformiat wird verwendet, um Zellen zu waschen, weil diese Lösung vollständig während der Gefriertrocknung zu verdampfen und keine Rückstände hinterlassen. <ol start="4"><li> Centrifuge Algensuspension und Ablagestand. </li><li> Lyophilisieren das Zellpellet. </li><li> Wiegen 5-10 mg gefriergetrocknete Mikroalgen Pulver in eine Kugelmühle Röhre. Nehmen Sie das genaue Gewicht. </li></ol> 2. Zellaufschluss und Lipidextraktion HINWEIS: Dieser Abschnitt wird eine ausgedehnte Zellaufschluss Verfahren. Möglicherweise sind einige der Zellaufschluss Schritte redundante und weniger umfangreiche Zellaufschluss vielleicht die gleichen Ergebnisse für einige Arten von Mikroalgen oder für Biomasse aus bestimmten Anbaubedingungen abgeleitet ergeben. Dies würde Validierung für die jeweilige Situation müssen jedoch. Deshalb ist die vorgeschlagene umfangreiche Störung Protokoll als universelle Methode eignet sich für alle Mikroalgenmaterial empfohlen. <ol><li> Wiegen eine exakte Menge an tripentadecanoin (triacylglycerol mit drei C15: 0-Fettsäuren) und es auf einen genau bekannten Menge 4:5 (v / v) Chloroform hinzu: Methanol. Auf diese Weise wird die Konzentration der tripentadecanoin genau bekannt ist. Ziel für eine Konzentration von 50 mg / L. Tripentadecanoin dient als interner Standard für die Quantifizierung Fettsäure. </li><li> 1 ml Chloroform: Methanol 04.05 (v / v) enthält tripentadecanoin jedem Schlagen Rohr (in den Reagenzien und Ausrüstung Tabelle). Überprüfen Sie, dass es keine Perlen im Inneren der Kappe des BeadBeater Rohr bleibt, wird dies in der undichten Rohre führen. Verwenden Sie eine positive Verschiebung Pipette für genaue Zusatz von Lösemitteln. </li><li> Bead schlugen die Kugelmühle Röhrchen bei 2500 min-8x für 60 Sekunden, jedes Mal mit einem internen 120 Sekunden zwischen jeder schlagen. </li><li> Die Lösung wird von den Kugelmühle Rohre zu einer sauberen hitzebeständig 15 ml Glaszentrifugenröhrchen mit Teflon-Einsatz Schraubverschlüsse. Seien Sie sicher, alle Perlen aus der Kugelmühle Rohr übertragen als gut. </li><li> Um warh der Kugelmühle Rohr, 1 ml Chloroform: Methanol 4.05 (v / v) mit tripentadecanoin in die Kugelmühle Rohr, in der Nähe Kappe und mischen, und übertragen Sie diese Lösung auf die gleiche Glasrohr von Schritt 2.4. Dreimaliges Waschen der Röhre (insgesamt 4 ml Chloroform: Methanol 04.05 (v / v) enthält tripentadecanoin pro Probe verwendet - 1 ml in Schritt 2.2 zugegeben und 3 ml für 3 Waschschritte). </li><li> Vortex die Glasröhren für 5 Sekunden und beschallen in einem Ultraschallbad für 10 min. </li><li> In 2,5 ml MilliQ-Wasser, das 50 mM 2-Amino-2-hydroxymethyl-propan-1 ,3-diol (Tris) und 1 M NaCl, pH 7, die mit einem HCl-Lösung eingestellt. Dies führt zu einer Phasentrennung zwischen Chloroform und Methanol: Wasser. 1 M NaCl verwendet wird, um das Gleichgewicht von Lipiden zu der Chloroform-Phase zu verbessern. </li><li> Vortex für 5 Sekunden und dann für 10 Minuten beschallen. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 1.200 x g. </li><li> Übertragen Sie das gesamte Chloroform-Phase (untere Phase) auf eine saubere Glasrohr mit einem Glas-Pasteur pipettE. Stellen Sie sicher, keine Interphase oder oberen Phase zu übertragen. </li><li> Re-wird die Probe durch Zugabe von 1 ml Chloroform alte Röhre (die das Methanol: Wasser-Lösung). </li><li> Vortex für 5 Sekunden und dann für 10 Minuten beschallen. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 1.200 x g. </li><li> Sammeln Sie die Chloroform-Phase (untere Phase) mit einer Glaspasteurpipette und Pool mit der ersten Chloroform-Fraktion aus Schritt 2.10. </li><li> Wenn Schwierigkeiten bei der Erhebung der gesamten Chloroform-Fraktion in der vorherigen Schritt erfahren, wiederholen Sie die Schritte von 2,11 bis 2,14. Ansonsten mit Schritt 2.16 fortfahren. </li><li> Verdampfe das Chloroform aus dem Rohr in einem Stickstoffgasstrom. Nach diesem Schritt können die Proben bei -20 ° C unter einer Stickstoffatmosphäre gelagert werden. </li></ol> 3. Umesterung zu Fettsäuremethylester <ol><li> 3 ml Methanol, das 5% (v / v) Schwefelsäure zu der Entnahme des getrockneten extrahierten Lipide (Rohr ursprünglich die Chloroformfraktion enthält) undschließen Sie das Rohr fest. </li><li> Rührers 5 Sekunden. </li><li> Proben für 3 h Inkubation bei 70 ° C in einem Heizblock oder Wasserbad. In regelmäßigen Abständen (jeden ± 30 min) sicherzustellen, dass die Proben nicht Sieden (durch ein nicht ordnungsgemäß geschlossenen Deckel verursacht) und Wirbelrohren. Während dieser Reaktion Fettsäuren, ihre Fettsäuremethylester (FAME) methyliert. </li><li> Coole Proben auf Raumtemperatur und 3 ml MilliQ Wasser und 3 ml n-Hexan. </li><li> Vortex für 5 Sekunden und mischen Sie für 15 Minuten mit einem Reagenzglas-Rotator. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 1.200 x g. </li><li> Sammeln Sie 2 ml Hexan (oben) Phase und in frischem Glasrohr setzen mit einer Glaspasteurpipette. </li><li> 2 ml MilliQ Wasser auf die gesammelten Hexan-Phase, es zu waschen. </li><li> Rührers 5 Sekunden und Zentrifuge für 5 min bei 1.200 x g. Nach diesem Schritt ist es möglich, die Proben bei -20 ° C unter Stickstoffgasatmosphäre (Phasentrennung nicht erforderlich) speichern. </li></ol> 4. Quantifizierung der FAME Usingen Gaschromatographie <ol><li> Füllen GC-Vials mit dem Hexan-Phase (obere Phase) mit einer Glaspasteurpipette. </li><li> Setzen Sie die Kappen auf den GC-Vials. Stellen Sie sicher, dass die Kappen sind vollständig versiegelt und kann nicht eingeschaltet werden, um die Verdampfung aus dem Fläschchen zu verhindern. </li><li> Füllen Sie die GC Wasch Lösungsmittel (Hexan), leeren die Abfall Fläschchen, und legte Probenfläschchen in Autosampler. Bevor Sie die eigentlichen Proben auf der GC, ersten Lauf zwei Rohlinge, die nur auf der GC-Hexan. </li><li> Führen Sie die Proben auf einem GC-FID mit einer Nukol Säule (30 mx 0,53 mm x 1,0 um). Verwenden Eintrittstemperatur von 250 ° C und mit Helium als Trägergas, Druck von 81,7 kPa und Split-Verhältnis von 0,1:1, Gesamtdurchflussrate: 20 ml / min. FID Detektortemperatur von 270 ° C mit H 2-Flussrate von 40 ml / min Luftdurchsatz von 400 ml / min und He Flussrate von 9,3 ml / min. Eingestellt Injektionsvolumen 1 &amp;mgr; l / Probe. Vor und nach der Wasch Injektor mit n-Hexan. Initial Ofentemperatur für 0,5 min auf 90 ° C eingestellt und hob dann with 20 ° C / min bis zu einer Ofentemperatur von 200 ° C erreicht ist. Ofentemperatur wird dann bei 200 ° C für 39 min gehalten. Die gesamte Laufzeit beträgt 45 min. </li></ol>

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Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um den Inhalt zu bestimmen sowie die Zusammensetzung der Gesamtfettsäuren in Mikroalgen-Biomasse vorhandenen Säuren werden. Fettsäuren von allen Lipidklassen, einschließlich Speicher (TAG) als auch Membranlipide (Phospholipide und Glycolipide) abgeleitet werden erkannt. Alle Fettsäurekettenlängen und Sättigungsgrade, die in der Mikroalgen vorhanden sind, können erkannt und unterschieden werden. Das Verfahren beruht auf mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelb...

Fettsäuren sind einer der wichtigsten Bestandteile der Mikroalgen-Biomasse und machen in der Regel zwischen 5-50% der Zelltrockengewicht 1-3. Sie sind vor allem in Form von Glycerolipide vorhanden. Diese Glycerolipiden wiederum hauptsächlich aus Phospholipiden, Glycolipiden und Triacylglycerin (TAG). Vor allem die in der TAG vorliegenden Fettsäuren von kommerziellem Interesse, weil sie als Ressource für die Produktion von Kraftstoffen, Massenchemikalien, Nutraceuticals (ω-3-Fettsäuren) und Nahrungsmittelrohstoffen 6.3 verwendet werden. Mikroalgen in Meerwasserbasis Kultivierungsmedien wachsen, kann eine viel höhere Flächenproduktivität als Landpflanzen haben und kann in Photobioreaktoren an Standorten, die für die Landwirtschaft ungeeignet sind kultiviert werden, gegebenenfalls auch offshore. Aus diesen Gründen sind Mikroalgen oft als eine vielversprechende Alternative zu terrestrischen Pflanzen für die Herstellung von Biodiesel und anderen Schüttgütern 3-6. Potenziell keine landwirtschaftliche lund oder Frischwasser (in geschlossenen Photobioreaktoren, wenn oder wenn kultiviert marine Mikroalgen verwendet werden) wird für ihre Herstellung benötigt wird. Daher werden Biokraftstoffen aus Mikroalgen als 3. Generation von Biokraftstoffen. Die gesamte zelluläre Gehalt an Fettsäuren (% Trockengewicht) der Lipidklassenzusammensetzung sowie der Fettsäure Länge und der Grad der Sättigung sehr variabel zwischen Arten von Mikroalgen. Darüber hinaus sind diese Eigenschaften variieren mit Kultivierungsbedingungen wie Nährstoffverfügbarkeit, Temperatur, pH-Wert, und die Lichtintensität 1,2. Zum Beispiel, wenn an Stickstoffmangel ausgesetzt, Mikroalgen können große Mengen von TAG ansammeln. Unter optimalen Wachstumsbedingungen TAG stellt in der Regel weniger als 2% des Trockengewichts, aber wenn auf Stickstoffmangel TAG-Gehalt ausgesetzt sind, können bis zu 40% der Mikroalgentrockengewicht 1 zu erhöhen. Mikroalgen produzieren hauptsächlich Fettsäuren mit Kettenlängen von 16 und 18Kohlenstoffatomen, aber einige Arten können Fettsäuren mit bis zu 24 Kohlenstoffatomen in der Länge zu machen. Sowohl gesättigte als auch hoch ungesättigte Fettsäuren werden durch Mikroalgen. Letztere sind Fettsäuren mit ernährungsphysiologischen Vorteile (ω-3-Fettsäuren), wie C20: 5 (Eicosapentaensäure, EPA) und C22: 6 (Docosahexaensäure, DHA), für die keine pflanzlichen Alternativen gibt 1,2,4,7. Die (Verteilung der)-Fettsäurekettenlänge und Sättigungsgrad bestimmt auch die Eigenschaften und die Qualität der Algen stamm Biokraftstoffe und Speiseöle 4,8. Um kommerziellen Anwendungen der Mikroalgen abgeleitet Fettsäuren zu entwickeln, sind verlässliche Analysemethoden zur Quantifizierung der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung benötigt. Wie auch von Ryckebosch et al. 9 erwähnt, zeichnet sich Analyse von Fettsäuren in Mikroalgen aus anderen Substraten (zB Pflanzenöl, Nahrungsmittel, Tiergeweben etc.)Ursache 1) Mikroalgen sind einzelne Zellen durch starre Zellwand umgeben ist, verkompliziert Lipidextraktion, 2) Mikroalgen enthalten eine Vielzahl von Lipidklassen und die Lipidklassenverteilung sehr variabel 7 ist. Diese verschiedenen Lipidklassen eine Vielzahl der chemischen Struktur und Eigenschaften wie Polarität. Auch sind andere als Acyllipiden Lipidklassen hergestellt, 3) Mikroalgen enthalten eine Vielzahl von Fettsäuren, zwischen 12-24 Kohlenstoffatome in der Länge und die sowohl gesättigte als auch hoch ungesättigte Fettsäuren. Daher entwickelt, um Fettsäuren in anderen als Mikroalgen Substrate zu analysieren Methoden, vielleicht nicht geeignet, um Fettsäuren in Mikroalgen zu analysieren. Wie durch Ryckebosch et al. 9 Bewertung ist der Hauptunterschied zwischen gängigen Lipidextraktionsverfahren in der Lösungsmittelsysteme, die verwendet werden. Aufgrund der großen Vielfalt von Mikroalgen in Gegenwart Lipidklassen, die jeweils unterschiedlicher Polarität, die extrahiertenLipid-Menge wird mit Lösungsmitteln verwendet 10-12 variieren. Dies führt zu Inkonsistenzen in der Lipidgehalt und in der Literatur vorgestellt Zusammensetzung 9,10. Abhängig von der verwendeten Lösungsmittelsystem, Verfahren auf der Basis der Lösungsmittelextraktion ohne Aufbrechen der Zellen durch beispielsweise Wulst Schlagen oder Ultraschallbehandlung, nicht wegen der starren Struktur einiger Arten von Mikroalgen 9,13 extrahieren können alle Lipide. Im Falle von unvollständigen Lipidextraktion kann die Extraktionseffizienz der verschiedenen Lipidklassen 14 variieren. Dies kann auch einen Einfluss auf das Mess Fettsäure-Zusammensetzung, da die Fettsäurezusammensetzung ist variabel zwischen Lipidklassen 7. Unser Verfahren basiert auf einer Sequenz von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion Umesterung von Fettsäuren zu Fettsäuremethylester (FAME) sowie die Quantifizierung und Identifizierung von FAME mittels Gaschromatographie in Kombination mit einem Flamm Ionisation basierendtion Detektor (GC-FID). Ein interner Standard in der Form einer Triacylglycerol (tripentadecanoin) vor dem Analyseverfahren aufgenommen. Mögliche Verluste bei der Extraktion und unvollständiger Umesterung kann dann korrigiert werden. Die Methode kann verwendet werden, um den Inhalt zu bestimmen sowie die Zusammensetzung der Mikroalgenbiomasse in vorhandenen Fettsäuren werden. Alle in den verschiedenen Acyl-Lipidklassen, einschließlich Speicher (TAG) als auch Membranlipide (Glykolipide, Phospholipide), erkannt werden, identifiziert und unter Verwendung von nur geringen Mengen an Probe (5 mg) durch dieses Verfahren genau und reproduzierbar zu quantifizieren vorliegenden Fettsäuren . Diese Methode liefert keine Informationen über die relative Häufigkeit der verschiedenen Lipidklassen. Jedoch kann das Verfahren erweitert werden, um Lipidklassen voneinander 1 zu trennen. Die Konzentration und die Fettsäurezusammensetzung der verschiedenen Lipidklassen können dann individuell bestimmt werden. In der Literatur sind mehrere andere Methodenbeschrieben, um Lipide in Mikroalgen zu analysieren. Einige Methoden konzentrieren sich auf insgesamt 15 lipophilen Bestandteile, während andere Methoden konzentrieren sich auf Gesamtfettsäuren 9,16. Zu diesen Optionen gehören gravimetrischen Bestimmung des extrahierten Lipide, direkte Umesterung von Fettsäuren, kombiniert mit Quantifizierung mittels Chromatographie und Färben von Zellen mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen. Eine häufig verwendete Alternative zur Quantifizierung von Fettsäuren mittels Chromatographie ist die Quantifizierung von Lipiden mit Hilfe eines gravimetrischen Bestimmung 17,18. Vorteile einer gravimetrischen Bestimmung sind das Fehlen von Anforderungen für fortgeschrittene und teure Ausrüstung wie ein Gaschromatograph, einfach zu, weil die Verfügbarkeit von standardisierten Analysegeräte (zB Soxhlet) einzurichten, das Verfahren, und eine gravimetrische Bestimmung ist weniger zeitaufwendig als Chromatographie basierten Verfahren. Der Hauptvorteil der Verwendung von Chromatographie basierten Verfahren auf der andeer Hand, daß bei einem solchen Verfahren nur die Fettsäuren gemessen. In einer gravimetrischen Bestimmung der Nicht-Fettsäure, Lipiden, wie Pigmente oder Steroide, werden auch in der Bestimmung enthalten. Diese nicht-Fettsäure, die Lipide bilden einen großen Anteil (&gt; 50%) der Gesamtlipide. Wenn man nur an der Fettsäuregehalt (zB für die Biodiesel-Anwendungen) ist, wird es überbewertet, wenn eine gravimetrische Bestimmung verwendet werden. Darüber hinaus in einer gravimetrischen Bestimmung der Genauigkeit der Analysenwaage verwendet, um die extrahierten Lipide wiegen bestimmt, die Stichprobengröße, die verwendet werden muss. Diese Menge ist in der Regel weit mehr als benötigt wird, wenn die Chromatographie verwendeten Menge. Schließlich ist ein weiterer Vorteil der Verwendung von Chromatographie über gravimetrische Bestimmung, dass Chromatographie liefert Informationen über die Fettsäurezusammensetzung. Eine weitere Alternative zu unseren vorgestellten Verfahren ist die direkte Umesterung 16,19,20.Bei diesem Verfahren wird der Lipidextraktion und Umesterung von Fettsäuren zu FAME werden in einem Schritt zusammengefasst. Dieses Verfahren ist schneller als eine separate Extraktion und Umesterung, sondern die Kombination dieser Maßnahmen begrenzt die Lösungsmittel, die zur Extraktion verwendet werden können. Dies könnte negativ beeinflussen Extraktionseffizienz. Ein weiterer Vorteil eines separaten Lipidextraktion und Umesterung ist, dass es eine zusätzliche Lipidklassentrennung zwischen diesen Schritten 1. Dies ist nicht möglich, wenn eine direkte Umesterung verwendet wird. Andere häufig verwendete Methoden, um den Lipidgehalt in Mikroalgen gehören zu bestimmen Färbung der Biomasse mit lipophilen fluoreszierenden Flecken wie Nil rot oder BODIPY und die Messung der Fluoreszenzsignal 21,22. Ein Vorteil dieser Verfahren ist, dass sie weniger aufwendig als bei anderen Methoden. Ein Nachteil dieser Verfahren ist, daß die Fluoreszenzantwort ist, die aus verschiedenen Gründen variabel zwischen Spezies, Anbaubedingungen, Lipidklassen und analytischen Verfahren. Als ein Beispiel sind einige dieser Variationen werden durch Unterschiede in der Aufnahme des Farbstoffs durch die Mikroalgen verursacht. Kalibrierung unter Verwendung einer anderen quantitativen Verfahren ist daher erforderlich, vorzugsweise für alle unterschiedlichen Anzuchtbedingungen und Wachstumsstadien durchgeführt wird. Schließlich hat dieses Verfahren keine Information über die Fettsäurezusammensetzung und ist weniger genau und reproduzierbar als Chromatographie-basierte Verfahren. Das vorgestellte Verfahren beruht auf der von Lamers et al. 23 und Santos et al. 24 beschriebenen Methode und wurde auch von anderen Autoren 1,25-27 angewendet. Auch andere Methoden zur Verfügung, die auf den gleichen Prinzipien basieren und könnte ähnliche Ergebnisse liefern 9,28.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent and equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tripentadecanoin (C15:0 TAG)</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>T4257</td>
 <td>CAS Number 7370-46-9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Sigma Aldrich </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Lipidox</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample</td>
 <td>Larodan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beadbeater</td>
 <td>Bertin Technologies</td>
 <td>Precellys 24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>beadbeater tubes</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>Lysing matrix E 
 116914500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC-FID</td>
 <td>Hewlett-Packer</td>
 <td>HP6871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GC column</td>
 <td>Supelco</td>
 <td>Nukol 25357</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipette 100-1000&mu;l</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>MR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positive displacement pipet tips C-1000</td>
 <td>Mettler Toledo</td>
 <td>C-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml</td>
 <td>VWR</td>
 <td>612-1925</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glass tubes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERE5100160011G1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Teflon coated screw-caps</td>
 <td>VWR</td>
 <td>SCERKSSR15415BY10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>445-2101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heated Evaporator/Concentrator</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>YO-28690-25</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

analysis of fatty acid content and composition in microalgae

Ein Verfahren, um den Inhalt und die Zusammensetzung der Gesamtfettsäuren in Mikroalgen enthaltenen Säuren bestimmen beschrieben. Fettsäuren sind ein Hauptbestandteil der Mikroalgenbiomasse. Diese Fettsäuren können in verschiedenen Acyl-Lipidklassen vorhanden sein. Vor allem die in Triacylglycerol (TAG) enthaltenen Fettsäuren sind von wirtschaftlichem Interesse, da sie für die Produktion von Kraftstoffen, Massenchemikalien, Nutraceuticals (ω-3-Fettsäuren) und Nahrungsmitteln verwendet werden. Um kommerzielle Anwendungen zu entwickeln, sind verlässliche Analysemethoden zur Quantifizierung der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung benötigt. Mikroalgen sind einzelne Zellen durch eine starre Zellwand umgeben. Eine Fettsäure Analysemethode sollte ausreichend Zellaufschluss bieten alle Acyl-Lipide und das verwendete Extraktionsverfahren sollte in der Lage, alle Acyl Lipidklassen extrahieren befreien. Mit dem hier vorgestellten Verfahren alle in Mikroalgen enthaltenen Fettsäuren können genau und reproduzierbar sein idenSCHICHT und quantifiziert mit kleinen Probenmengen (5 mg), unabhängig von ihrer Kettenlänge, Unsättigungsgrad oder der Lipidklasse sie gehören. Diese Methode liefert keine Informationen über die relative Häufigkeit der verschiedenen Lipidklassen, kann aber verlängert, um Lipidklassen voneinander zu trennen. Das Verfahren beruht auf einer Folge von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion Umesterung von Fettsäuren zu Fettsäuremethylester (FAME) sowie die Quantifizierung und Identifizierung von FAME mit Hilfe der Gaschromatographie (GC-FID) basiert. Ein TAG internen Standard (tripentadecanoin) vor dem Analyseverfahren hinzugefügt, um Verluste während der Extraktion und unvollständige Umesterung korrigieren.

Ein typisches Chromatogramm, das durch dieses Verfahren erhalten wird, ist in Fig. 1 gezeigt. FAME werden durch Größe und Grad der Sättigung durch die GC-Säule und des verwendeten Protokolls getrennt. Kürzerer Kettenlänge Fettsäuren und gesättigte Fettsäuren (weniger Doppelbindungen) kürzere Verweilzeiten. Das verwendete GC-Säule und das Protokoll nicht beabsichtigen, Fettsäure-Isomeren (gleicher Kettenlänge und Sättigungsgrad, aber unterschiedlichen Positionen der Doppelbindungen) zu tren...

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Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Ein Verfahren zur Bestimmung der Fettsäuregehalt und der Zusammensetzung in Mikroalgen anhand von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion, Umesterung und die Quantifizierung und Identifizierung der Fettsäuren mittels Gaschromatographie beschrieben. Ein tripentadecanoin interner Standard verwendet wird, um für die möglichen Verluste bei der Extraktion und unvollständiger Umesterung kompensieren.

Die Analyse der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung in Mikroalgen

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

analysis-of-fatty-acid-content-and-composition-in-microalgae

Research

JoVE Journal

Environment

59.4K Aufrufe.  Wageningen University and Research Center.  Ein Verfahren zur Bestimmung der Fettsäuregehalt und der Zusammensetzung in Mikroalgen anhand von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion, Umesterung und die Quantifizierung und Identifizierung der Fettsäuren mittels Gaschromatographie beschrieben. Ein tripentadecanoin interner Standard verwendet wird, um für die möglichen Verluste bei der Extraktion und unvollständiger Umesterung kompensieren. 

Serie: Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Optimieren Rauchgas Einstellungen, um Mikroalgen in Photobioreaktoren Wachstum über Computer-Simulationen fördern

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Forschung

Umwelt

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages include high potential yield, use of non-arable land and integration with waste streams. The nutrient requirements of a large-scale microalgae production system will require the coupling of cultivation systems with industrial waste resources, such as carbon dioxide from flue gas and nutrients from wastewater. Inorganic contaminants present in these wastes can potentially lead to bioaccumulation in microalgal biomass negatively impact productivity and limiting end use. This study focuses on the experimental evaluation of the impact and the fate of 14 inorganic contaminants (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn) on Nannochloropsis salina growth. Microalgae were cultivated in photobioreactors illuminated at 984 &#181;mol m-2 sec-1 and maintained at pH 7 in a growth media polluted with inorganic contaminants at levels expected based on the composition found in commercial coal flue gas systems. Contaminants present in the biomass and the medium at the end of a 7 day growth period were analytically quantified through cold vapor atomic absorption spectrometry for Hg and through inductively coupled plasma mass spectrometry for As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn. Results show N. salina is a sensitive strain to the multi-metal environment with a statistical decrease in biomass yieldwith the introduction of these contaminants. The techniques presented here are adequate for quantifying algal growth and determining the fate of inorganic contaminants.

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Quantifizierung von Schwermetallen und anderen anorganischen Kontaminanten auf die Produktivität von Mikroalgen

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Air-abgetastete Filteranalyse für Endotoxine und DNA-Gehalt

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Composition and Properties of Aquafaba: Water Recovered from Commercially Canned Chickpeas

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce stable foams and emulsions, and can act as a thickener. Recently interest in this product has been enhanced through the internet where it is proposed that this solution, now called aquafaba by a growing community, can be used a replacement for egg and milk protein. As aquafaba is both new and being developed by an internet based community little is known of its composition or properties. Aquafaba was recovered from 10 commercial canned chickpea products and correlations among aquafaba composition, density, viscosity and foaming properties were investigated. Proton NMR was used to characterize aquafaba composition before and after ultrafiltration through membranes with different molecular weight cut offs (MWCOs of 3, 10, or 50 kDa). A protocol for electrophoresis, and peptide mass fingerprinting is also presented. Those methods provided valuable information regarding components responsible for aquafaba functional properties. This information will allow the development of practices to produce standard commercial aquafaba products and may help consumers select products of superior or consistent utility.

Aquafaba is a viscous juice from canned chickpea that, when stirred vigorously, produces a relatively stable white froth or foam. The primary research goal is to identify the components of aquafaba that contribute viscosifying/thickening properties using nuclear magnetic resonance (NMR), ultrafiltration, electrophoresis, and peptide mass fingerprinting.

Zusammensetzung und Eigenschaften der Aquafaba: Wasser erholt kommerziell Dosen Kichererbsen

Chickpea and other pulses are commonly sold as canned products packed in a thick solution or a brine. This solution has recently been shown to produce ...

The Calibration and Use of Capacitance Sensors to Monitor Stem Water Content in Trees

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus area. Biomass capacitance plays an integral role in the avoidance of hydraulic impairment to transpiration. However, high temporal resolution measurements of dynamic changes in the hydraulic capacitance of large trees are rare. Here, we present procedures for the calibration and use of capacitance sensors, typically used to monitor soil water content, to measure the volumetric water content in trees in the field. Frequency domain reflectometry-style observations are sensitive to the density of the media being studied. Therefore, it is necessary to perform species-specific calibrations to convert from the sensor-reported values of dielectric permittivity to volumetric water content. Calibration is performed on a harvested branch or stem cut into segments that are dried or re-hydrated to produce a full range of water contents used to generate a best-fit regression with sensor observations. Sensors are inserted into calibration segments or installed in trees after pre-drilling holes to a tolerance fit using a fabricated template to ensure proper drill alignment. Special care is taken to ensure that sensor tines make good contact with the surrounding media, while allowing them to be inserted without excessive force. Volumetric water content dynamics observed via the presented methodology align with sap flow measurements recorded using thermal dissipation techniques and environmental forcing data. Biomass water content data can be used to observe the onset of water stress, drought response and recovery, and has the potential to be applied to the calibration and evaluation of new plant-level hydrodynamics models, as well as to the partitioning of remotely sensed moisture products into above- and belowground components.

The hydraulic capacitance of biomass is a key component of the vegetation water budget, which serves as a buffer against short and long-term drought stresses. Here, we present a protocol for the calibration and use of soil moisture capacitance sensors to monitor water content in the stems of large trees.

Die Kalibrierung und die Nutzung der Kapazität Sensoren Stem Wassergehalt in den Bäumen zu überwachen

Water transport and storage through the soil-plant-atmosphere continuum is critical to the terrestrial water cycle, and has become a major research focus ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. Eye-tracking informatics are known to connect to a range of feelings, health conditions, mental states and actions. But because vision is the result of constant eye-movements, teasing out what is important from what is noise is complex and data intensive. Furthermore, a significant challenge is controlling for what people look at compared to what is presented to them.
The following presents a methodology for combining and analyzing eye-tracking on a video of a natural and complex scene with a machine learning technique for analyzing the content of the video. In the protocol we focus on analyzing data from filmed videos, how a video can be best used to record participants&#39; eye-tracking data, and importantly how the content of the video can be analyzed and combined with the eye-tracking data. We present a brief summary of the results and a discussion of the potential of the method for further studies in complex environments.

The objective of the protocol is to detail how to collect video data for use in the laboratory; how to record eye-tracking data of participants looking at the data and how to efficiently analyze the content of the videos that they were looking at using a machine learning technique.

Die Kombination von Eye-Tracking-Daten mit einer Analyse von Video-Inhalten aus dem Free-Viewing eines Videos von einem Walk in einer urbanen Park-Umgebung

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Zusammensetzung und Verteilungsanalyse Bioaerosole unter verschiedenen Umweltbedingungen

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Anbau von grünen Mikroalgen in Bubble Spalte Photobioreaktoren und ein Test für neutrale Lipide

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Manufacturing Simple and Inexpensive Soil Surface Temperature and Gravimetric Water Content Sensors

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. However, at the soil surface these variables are highly dynamic and standard sensors do not explicitly measure temperature or moisture in the upper few millimeters of the soil profile. This paper describes methods for manufacturing simple, inexpensive sensors that simultaneously measure the temperature and moisture of the upper 5 mm of the soil surface. In addition to sensor construction, steps for quality control, as well as for calibration for various substrates, are explained. The sensors incorporate a Type E thermocouple to measure temperature and assess soil moisture by measuring the resistance between two gold-plated metal probes at the end of the sensor at a depth of 5 mm. The methods presented here can be altered to customize probes for different depths or substrates. These sensors have been effective in a variety of environments and have endured months of heavy rains in tropical forests as well as intense solar radiation in deserts of the southwestern U.S. Results demonstrate the effectiveness of these sensors for evaluating warming, drying, and freezing of the soil surface in a global change experiment.

Accurately measuring temperature and water content of the upper 5 mm of the soil surface can improve our understanding of environmental controls on biological, chemical, and physical processes. Here we describe a protocol for manufacturing, calibrating, and conducting measurements with soil surface temperature and moisture sensors.

Herstellung einfacher und kostengünstiger Bodenoberflächentemperatur- und Gravimetrischer Wassergehaltssensoren

Quantifying temperature and moisture at the soil surface is essential for understanding how soil surface biota respond to changes in the environment. ...