Die Tyrosinphosphatase SHP2, ist ein wichtiger Vermittler der zellulären Signalisierung, Förderung des Zellüberlebens und der Proliferation. Mein Team konzentriert sich auf die Suche nach kleinen Molekül-SHP2-Hemmern für die Behandlung von Krebs. Unsere Technik bietet eine schnelle und leistungsfähige Methode, um Zell-Penetrante zu etablieren, sowie Zielengagement von kleinen Molekül-SHP2-Inhibitoren, in Zellen.
Dadurch wird sichergestellt, dass Ermittlungsressourcen effizient gesteuert werden. SHP2 als attraktives Ziel für die Krebstherapie. Und mehrere SHP2-Hemmer befinden sich in klinischen Studien.
Unsere Technik, um die Entdeckung von Inhibitoren der nächsten Generation mit verbesserten Wirksamkeitsprofilen zu erleichtern. Die Verfahrensweise würden Celeste Romero, wissenschaftliche Mitarbeiterin, und Douglas Sheffler, wissenschaftlicher Assistenzprofessor, aus unserem Labor demonstrieren. Um mit drei Millilitern Zellablösungsreagenz zu beginnen, heK293 T-Zellen von den Platten zu lösen.
Verdünnen Sie die Zellen mit 12 Milliliter Wachstumsmedien und sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 1, 400 mal G, für vier Minuten. Setzen Sie den Zellpalate in 10 Milliliter Wachstumsmedien aus und messen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau und einem Zellzähler. Platte 700. 000 exponentiell wachsende Zellen in jeden Brunnen einer sechs Brunnenkulturplatte und bebrütet sie für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Am nächsten Tag zwei Mikrogramm Plasma-DNA in 200 Mikroliter Transfektionspuffer verdünnen. Wirbeln Sie die Plasma-DNA für 10 Sekunden und zentralflieren Sie sie bei 1, 400 mal G für vier Minuten. Fügen Sie der verdünnten DNA vier Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu.
Wirbeln Sie es für 10 Sekunden, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Inkubieren Sie die DNA bei 23 Grad Celsius für 10 Minuten, fügen Sie dann die Transfektionsmischung zu den angeschlossenen HEK293 T-Zellen in der sechs Brunnenplatte hinzu und geben Sie die Zellen für weitere 24 Stunden in den Inkubator zurück. Zur Herstellung von Assayplatten, verdünnen Inhibitorlösungen in DMSO, für eine Lagerkonzentration von 10 Millimolar und geben Sie sie in eine 384 gut niedrige Totvolumen-Quellplatte, für den sofortigen Gebrauch.
Entdecken Sie das gewünschte Volumen von Inhibitoren oder Fahrzeug, mit einem Flüssigkeitshandler in 384 gut Echtzeit-PCR-Platten bei einem Ziel-Endvolumen von weniger als 0,5%DMSO. Versiegeln Sie die Platten mit einem Plattenversiegeler mit Inertgasspülung. Um die transfizierten Zellen vorzubereiten, brüten Wachstumsmedien vor und verkaufen Ablösungsreagenz in einem 37 Grad Celsius Wasserbad.
Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen Sie die Medien vorsichtig aus den Brunnen. Fügen Sie 0,3 Milliliter des Zellablösungsreagenz zu jedem Brunnen hinzu und schaukeln Sie die Platte sanft hin und her, um die Oberfläche des Plattenbodens gründlich zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte bei 23 Grad Celsius für zwei Minuten.
Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter Wachstumsmedien hinzu und pipetten Sie die Zellen im Brunnen sanft. Dann übertragen Sie sie in eine 15 Milliliter Falcon Zentrifugenrohr Zentrifuge die Zellen bei 1, 400 mal G für vier Minuten, um die Zellen zu sammeln. Saugen Sie die Medien vorsichtig an, und setzen Sie das Zellpellet in zwei MilliliterWachstumsmedien wieder aus.
Stellen Sie sicher, dass die Zelllebensfähigkeit größer als 90 % ist, indem Sie Try Pan Blue und einen Zellzähler verwenden. Verdünnt Zellen auf eine Konzentration von 125 Zellen pro Mikroliter, so dass die Zellen für eine optimale Lebensfähigkeit nicht länger als zwei Stunden in Suspension gehalten werden. Für die Inkubation mit SHP2-Inhibitoren, geben Sie die Zellen in eine sterile Einkanal-Lösung Trog.
Zentrifugieren Sie die zuvor vorbereitete 384 gut Echtzeit-PCR-Platte bei 2, 500 mal G für fünf Minuten, dann entfernen Sie die Dichtung und verwenden Sie eine 125 Mikroliter Mehrkanal-Pipette, um fünf Mikroliter der verdünnten Zellen zu den gewünschten Wells hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 42 mal G für 30 Sekunden ohne Deckel, dann befestigen Sie einen Deckel und inkubieren Sie die Platte für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Programmieren Sie den Thermo-Cycler nach Manuskriptrichtungen für den thermischen Profilgradienten oder das isotherme Experiment.
Starten Sie das Thermocycler-Wärmepulsprogramm und legen Sie die Assayplatte auf den Thermoblock. Wenn das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Assay-Platte. Ergänzen Sie jeden Brunnen der Assayplatte mit fünf Mikroliterlizenzierten Detektionsmaster-Mix.
Zentrifugieren Sie die Platte bei 42 mal G für 30 Sekunden, und lagern Sie sie bei 23 Grad Celsius in der Dunkelheit für 30 bis 60 Minuten. Messen Sie die Chemilumineszenz mit einem Mikroplattenleser mit der optimierten Integrationszeit. Das thermische Gradientenexperiment für den Wildtyp SHP2 führte zu einem sigmoidalen zellulären thermischen Profil mit einem schmalen Schmelzübergang, der typisch für ein gefaltetes Protein ist.
Inkubation des wilden Typs SHP2 mit dem allosterischen Inhibitor SHP099, stabilisiert auf das thermische Profil in signifikantem und messbarem Maße. Die Stabilisierung von SHP2, auch mit der Potenz von SHP099 wie allosterische Verbindungen verfolgt. Bei 10 Mikromolaren erzeugte der stärkere RMC-4550 einen höheren Stabilisierungsgrad als SHP099 für Wildtyp SHP2.
Aufgrund ihres einzigartigen Mechanismus, SHP099 wie allosterische Inhibitoren sind weniger wirksam gegen viele SHP2 onkogene Mutagene, einschließlich SHP2-E76K. In Übereinstimmung mit diesen bekannten Eigenschaften wird nur eine marginale thermische Stabilisierung von SHP2-E76K durch SHP099 beobachtet. Der Expressionspegel des EPL-Tag-Proteins kann die Signalintensität dramatisch beeinflussen.
Thermische Profile für transiente und stabil integrierte Wildtypzellen. unter identischen Asset-Bedingungen angezeigt. Die Normalisierung der unterschiedlichen Kurven ermöglicht vergleichbare thermische Profile und zeigt die große Bandbreite des EFC-Erkennungssystems auf.
Nutzung der thermischen Cycler-Fähigkeit, thermische Gradienten auf der kurzen Achse einer 384-Wellplatte zu erzeugen. eine Reihe von isothermen Titrationen kann auf einer einzigen Platte durchgeführt werden. Bei optimaler Temperatur ergab eine isotherme Titration mit einem vollen 10-Punkt-Dosis-Response einen nützlichen EC50 für RMC-4550.
Die Prinzipien dieses Vermögenswerts könnten verwendet werden, um den Abbau von Proteinen in Zellen zu überwachen, induziert durch PROTAC-Verbindungen. Wir verwenden zelluläre Thelma-Schichttechnik, um Inhibitoren von mutiertem SHP2 und Leukämien zu entdecken, Medikamente, die spezifisch gegen häufige SHP2-Onkogene Mutagene sind, die einen signifikanten Einfluss auf die Behandlung dieser Krebsarten haben werden.
