Dieses Protokoll hilft bei der Bestimmung der Aktivität von ATPase-Proteinen, indem es das freie Phosphat misst, das bei der ATP-Hydrolyse durch die Proteine entsteht. Der Malachitgrün-Assay ist ein einfaches, empfindliches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zum Nachweis von anorganischem Phosphat. Es eignet sich für die Automatisierung und das Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen gegen ihr Ziel.
Diese Technik wird eine wichtige Rolle bei der schnellen Entdeckung von Inhibitoren gegen das Hsp90-Protein spielen, das ein wichtiges Ziel gegen Krebs ist. Pipettieren Sie zunächst 40 Mikroliter eines einmillimolaren Phosphatstandards in 960 Mikroliter Reinstwasser, um eine 40-mikromolare Phosphatlösung zu erhalten. Fügen Sie diese Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu, um eine serielle Verdünnung von Phosphat von 0 auf 40 Mikromolaren zu bilden.
Verwenden Sie als Nächstes acht Mikroliter Hefe Hsp90 für eine messbare ATPase-Aktivität. Fügen Sie Malachitgrün-Reagenz zu der Blind- und Positivkontrolle hinzu und überprüfen Sie, ob die optische Dichtedifferenz zwischen der Blind- und der Positivkontrolle nach der Zugabe mindestens 0,5 und kleiner als 1 beträgt. Zur Herstellung von ATP wird ein Milligramm ATP in eine Durchstechflasche mit 453,39 Mikrolitern Reinstwasser überführt, um eine viermillimolare Stammlösung zu erhalten.
Bereiten Sie das ATP frisch zu, da es mit der Zeit spontan hydrolysieren kann. Geben Sie vier Mikroliter ATP-Stammlösung in jede Vertiefung, um eine endgültige Vertiefungskonzentration von 0,2 Millimolaren zu erhalten. Fügen Sie ATP als letzte Komponente der Reaktion mit einer Mehrkanalpipette hinzu, so dass alle Reaktionen gleichzeitig starten.
Als nächstes bereiten Sie einen 10-Millimol-Vorrat an Geldanamycin vor, indem Sie ein Milligramm in 178,37 Mikrolitern DMSO auflösen. Unter Verwendung der Stammlösung werden 4-Millimolaren, 0,8 Millimolaren, 0,16 Millimolaren, 0,032 Millimolaren, 0,0064 Millimolaren und 0,00128 Millimolare Lösungen in DMSO durch serielle Verdünnung hergestellt. Geben Sie zwei Mikroliter dieser Stammlösungen in jede Vertiefung, um eine endgültige Vertiefungskonzentration von 0,1 Millimolaren, 0,02 Millimolaren, 0,04 Millimolaren, 0,0008 Millimolaren, 0,00016 Millimolaren und 0,000032 Millimolaren zu erhalten.
Bereiten Sie dann die Bohrungen zusammen mit den Bohrlöchern vor, die den Leer- und Negativcode enthalten. Die Vertiefungen, die Geldanamycin enthalten, dienen als Positivkontrolle. Bereiten Sie die 96-Well-Platten vor und bereiten Sie eine separate Vertiefung für die Verbindungen vor, die eine Absorption bei 620 Nanometern aufweisen, um die Absorption bei dieser Wellenlänge aufzuzeichnen.
Für Geldanamycin ist keine separate Vertiefung zu zeigen, da Geldanamycin bei 620 Nanometern für die in diesem Assay verwendete Konzentration keine Absorption aufweist. Richten Sie Assay-Vertiefungen ein, indem Sie jeder Vertiefung Reinstwasser hinzufügen. Fügen Sie dann die erforderliche Menge Assay-Puffer und eine zusammengesetzte Lösung wie Geldanamycin-Lösung hinzu.
Hsp90 in die entsprechenden Vertiefungen geben und die Teller zwei Minuten lang auf einem Tellerschüttler bei Raumtemperatur schütteln. Fügen Sie vier Mikroliter ATP-Lösung mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein und schütteln Sie sie zwei Minuten lang auf einem Tellerschüttler bei Raumtemperatur bei 200 U/min.
Die Platte bei 37 Grad Celsius drei Stunden lang inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 20 Mikroliter Malachitgrün-Reagenz in der gleichen Reihenfolge wie ATP mit einer Mehrkanalpipette zugeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zum Schluss messen Sie die Absorption der Platte bei 620 Nanometern in einem Plattenlesegerät.
Zusätzlich zu Platte A werden 90 Mikroliter Assay-Puffer in jede Vertiefung gegeben. Zusätzlich zu Platte B 90 Mikroliter Puffer mit Hsp90 in jede Vertiefung geben. Fügen Sie zusätzlich zu Platte C 90 Mikroliter ATP hinzu, und zusätzlich zu Platte D fügen Sie 90 Mikroliter Malachitgrünes Reagenz in jede Vertiefung hinzu.
Verwenden Sie ein automatisiertes Mehrkanal-Dosiersystem, um 40 Mikroliter Lösung aus jeder Vertiefung der Zugabeplatte A auf die Hauptplatten eins und zwei und die Platte B auf die Hauptplatte drei und vier zu übertragen. Übertragen Sie 20 Mikroliter der Lösung aus jeder Vertiefung der Verbundplatte auf die Hauptplatten eins, die Hauptplatten zwei, die Hauptplatten drei und die Hauptplatten vier. Schütteln Sie die Teller eine Minute lang in einem Shaker mit 200 U/min.
Übertragen Sie 20 Mikroliter der Lösung aus jeder Vertiefung der Zugabeplatten C auf die Hauptplatten eins, zwei, drei und vier. Schütteln Sie die Teller eine Minute lang in einem Shaker mit 200 U/min. Inkubieren Sie die Platten drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und übertragen Sie dann 20 Mikroliter Malachitgrün-Reagenz von der Additionsplatte D in die Vertiefungen der Hauptplatten eins, zwei, drei und vier.
Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Absorption der Platte bei 620 Nanometern in einem Plattenlesegerät gemessen. Die Struktur von Malachitgrün und die Reaktionen von Malachitgrün-Reagenz A mit freiem Phosphat und die anschließende Reaktion mit Reagenz B sind hier dargestellt. In dieser Abbildung ist ein Standarddiagramm für die Standardphosphatkonzentration dargestellt.
Hier stellt die x-Achse die freie Phosphat- oder Pi-Konzentration im Mikromolaren dar, und die Absorption bei 620 Nanometern ist auf der y-Achse dargestellt. Die Fehlerbalken stellen die Abweichung zwischen den beiden Stichprobennummern dar. Die prozentuale ATPase-Aktivität wird verwendet, um die dosisabhängige Hemmung des Proteins durch Geldanamycin zu messen.
Es wurde beobachtet, dass Geldanamycin das Protein dosisabhängig mit einem IC50-Wert von 0,85-Mikromolaren hemmt. Dabei ist jeder Punkt ein Mittelwert aus zwei Bestimmungen. Die Farbentwicklung in der Hauptplatte eins nach Zugabe des Malachitgrünmittels ist in diesem Bild dargestellt.
Die rosa Farbe im A11-Brunnen ist auf die zusammengesetzte Farbe zurückzuführen. In ähnlicher Weise ist hier die Farbentwicklung in Hauptplatte zwei dargestellt. Die rosa Farbe im A11-Brunnen ist auf die farbige Beschaffenheit der Verbindung zurückzuführen.
Die Farbentwicklung nach Zugabe des Malachitgrün-Reagenzes in Hauptplatte drei und in Hauptplatte vier ist hier dargestellt. Die Zugabe von ATP und Malachitgrün-Reagenz im gleichen Zeitintervall zu jeder Vertiefung ist eine wichtige Sache, die bei der Durchführung dieses Verfahrens zu beachten ist.
