Wir möchten Mark lukanische und Hwai-Jong Cheng für die Hilfe bei dem Erwerb der geringer Vergrößerung Bilder des gesamten Hippocampus Scheiben in diesem Video vorgestellt danken. Wir möchten auch Sarah Parrish für die Unterstützung mit dem Begleittext das Video zu danken.

PROTOKOLL FÜR biolistischen TRANSFEKTION Erstellen Kugeln Bullets sind gut für bis zu 6 Monate, kann aber anfangen, in Transfektionseffizienz nach 2-3 Monaten zu verringern. Bullets sollte bei 4 ° C in Anwesenheit von Trockenmittel Pellets gelagert werden. Lassen Sie immer das Szintillationsgefäße, in denen Kugeln gespeichert sind, auf Raumtemperatur erwärmt vor dem Öffnen der Flasche. Bevor Sie beginnen müssen bereit: <ul><li> Spermidin (0,05 M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100%-high grade-ungeöffnete Flasche) </li><li> Autoklaviert H 2 0 </li><li> DNA zu transfizieren </li><li> Polyvinylpyrrolidon (PVP-20 mg / ml Stammlösung) </li><li> 2 X 15 ml konisch (2/bullet set) </li><li> Tubing (Schnitt in 1 X ~ 30 Zoll / Kugel gesetzt) </li><li> Szintillationsgefäße (1/bullet set) </li><li> Austrocknung Pellets </li><li> 10 ml Spritze w / Schläuche am Ende </li></ul> Bereiten Schlauch: <ol><li> Dry ~ 30 Zoll-Schlauch (ungefähr 2 Zoll, die über rechten O-Ring) in den Schlauch Station w / N 2-Gas (0,4 Druck) für mindestens 20 min. </li></ol> Ausfallende DNA auf Gold Perlen: <ol><li> Bereiten DNA in 50 μmL Gesamtvolumen in Mikrozentrifugenröhrchen (maximal 50 ug Gesamt-DNA) transfiziert werden </li><li> Abwiegen 6-8 mg Gold und Überweisung auf ein Mikrozentrifugenröhrchen </li><li> 100 l 0,05 M Spermidin, um Gold und beschallen für 20 sec </li><li> Fügen Sie die 50 ul DNA, um das Gold / Spermidin </li><li> Vortex (rund Einstellung 5) w / cap öffnen </li><li> Fügen Sie tropfenweise 100 ul 1M CaCl 2 </li><li> Ultraschallbad kurz (&lt;5 sec) </li><li> Absetzen lassen für 10 Minuten bei Raumtemperatur </li><li> Ultraschallbad kurz </li></ol> Bereiten Sie PVP-Lösung während der Beschallung: <ol><li> Machen Sie verdünnten PVP-Lösung in 15 ml konisch, 3.5ml verdünnten PVP für jeden Satz von Kugeln (add 7,5 ul der 20mg/ml PVP Lager zu 3,5 ml 100% EtOH) </li></ol> Spülen Goldperlen mit EtOH: <ol><li> Spin down Goldperlen bei voller Geschwindigkeit für 10 Sekunden in Mikrozentrifuge </li><li> Überstand, aber halten Sie eine kleine Menge der Flüssigkeit auf der Goldperlen </li><li> Waschen mit 1 ml EtOH 3X, kurz beschallen jedes Mal, wenn nötig </li></ol> Resuspendieren gold / DNA in PVP-Lösung: <ol><li> Resuspendieren Gold Pellet in 200 ul der 3,5 ml verdünnten PVP / EtOH-Lösung </li><li> Vortex das Gold Pellet zu resuspendieren (kurz beschallen falls erforderlich) </li><li> Übertragen Sie die 200 ul von Gold / PVP-Lösung zu einem neuen 15 ml konischen </li><li> Fahren Sie auf diese Art und Weise, Zugabe von 200 ul von PVP in einer Zeit, bis alles Gold ist, die 15 ml konische übertragen worden, und das Endvolumen beträgt 3,2 mL </li></ol> Coating-Schlauch: <ol><li> Schalten N 2 bei der Schlauch-Station und nehmen Sie getrocknete Schlauch </li><li> Bringen getrocknet Schlauch an den 10 ml-Spritze </li><li> Kräftig schütteln 15 ml konisch mit gold / PVP gefüllt </li><li> Das Ende des Schlauches in gold / PVP-Lösung und saugen sich langsam darauf achten, um Blasen zu vermeiden </li><li> Lassen Sie ~ 2 Zoll trocken von beiden Enden des Rohres </li><li> Mit dem Schlauch noch Spritze befestigt und mit dem Gold / PVP-Lösung, vorsichtig die Schläuche wieder in die Station </li><li> Mark die Enden des Rohres, wo die Lösung liegt </li><li> Lassen Sie das Gold für 5 Minuten absetzen mit der Spritze befestigt </li><li> Suck-up die Lösung sehr langsam, indem Sie die Spritze so, dass die ständige Gold hinter sich (vergewissern Sie sich, um Back-wash) links </li><li> Trennen Sie die Spritze </li><li> Um 90 ° und lassen Sie sich 2 Sekunden </li><li> Um 180 ° drehen und lassen Sie sich weitere 2 Sekunden </li><li> Drehen Rohr für 5 Sek. </li><li> Schalten Sie die N 2, so dass das Ventil liest zwischen 0,4 bis 0,5 und drehen Sie das gold-beschichtete Schlauch während der Trocknung für 5 min. </li></ol> Cutting-Schlauch: <ol><li> Entfernen Sie den Schlauch aus dem Schlauch prep-Station und schneiden Sie die Enden an den Markierungen. </li><li> Setzen Sie ein markiertes Scintillationsfläschchen unter dem Schlauch Chopper zu schneiden Patronen zu fangen </li><li> Legen Sie Schlauch in das Rohr Chopper und schneiden Sie den Schlauch mit sauberen Rasierklinge </li><li> Legen Sie eine Austrocknung Pellets in Scintillationsfläschchen </li><li> Lagern Sie Kassetten bei 4 ° C </li></ol> Shooting Gewebeschnitten Bei der Aufnahme von kultivierten Scheiben, ist es wichtig, eine relativ sterile Technik einzusetzen, um Kontaminationen zu vermeiden. Denken Sie daran, dass bei der Aufnahme von zwei verschiedenen Konstrukte, beide Sätze von Kugeln in der gleichen Patronenhalter geladen werden kann, aber der Lauf-Liner und Bildschirm sollte zwischen Konstrukten verändert werden. Bevor Sie beginnen müssen bereit: <ul><li> DNA Kugeln (let Scintillationsfläschchen auf Raumtemperatur erwärmt, bevor) </li><li> Gewebeschnitten </li><li> Helios Gene Gun </li><li> Helium-Tank mit Gen-Kanone Schlauch angebracht &lt;/ Li&gt; <li> Kartuschenhalter </li><li> Barrel-Liner mit Kunststoff-O-Ring an seinem Platz </li><li> Diffuser (modifiziert) </li><li> Streuscheibe </li><li> Zange </li></ul> Prepping der Gen-Kanone: <ol><li> Mit einer Pinzette Ort der mit Gold beschichteten Kunststoff-Patronen in den Patronenhalter. </li><li> Setzen Sie den Patronenhalter in die Gen-Kanone, indem Sie zuerst Zurückschieben lock </li><li> Sichern Sie den Patronenhalter mit Schloss </li><li> Besorgen Sie sich einen Barrel-Liner mit einem O-Ring und der Diffusor Bildschirm sicher in Position </li><li> Schrauben Sie die Lauf-Liner in die Gen-Kanone </li></ol> Shooting kultivierten Scheiben mit der Gen-Kanone: <ol><li> Setzen Sie auf Gehörschutz </li><li> Stecken Sie den Gen-Kanone in Schlauch verbunden Helium-Gas-Tank </li><li> Schalten Sie den Druck auf Tank bis 180 PSI </li><li> Nehmen Sie ein leeres in die Luft, um Staub und Schmutz aus dem Diffusor Bildschirm zu entfernen. Um die Waffe zu schießen, zuerst drücken Sie die Sicherheitsverriegelung drücken, bis die Waffe piept, dann abdrücken. </li><li> Nach der Aufnahme des Rohlings, entfernen Sie die Scheiben aus dem Inkubator </li><li> Advance-Pistole an erste Konstrukt </li><li> Schießen Sie mit dem Diffusor-Bildschirm über 0,5 bis 1 Zoll von der Scheibe </li><li> Schieben Sie die Patrone zwischen den Wells. </li><li> Nach der Aufnahme der letzten gut, legen Sie die Scheiben wieder in den Inkubator </li><li> Schalten Sie Gas-und Lösedruck vor dem Abnehmen der Pistole aus dem Helium-Schlauch </li><li> Lösen Sie den Lauf-Liner, und entfernen Sie die Patrone und die verwendeten Schalen </li></ol> Reinigungskassette Inhaber und Lauf-Liner: <ol><li> Legen Sie Patronen, Fass-Linern und Diffusor-Bildschirme in ein Becherglas mit Seifenwasser </li><li> Legen Becher in Ultraschallbad und beschallen für 20 min </li><li> Gründlich mit Wasser ausspülen, bis alle Seifenreste entfernt werden </li><li> Tauchen Sie ein in 70% EtOH für eine Stunde </li><li> Legen Sie auf trockenen Papiertuch über Nacht zu trocknen </li><li> Reinigen der Patronen, Fass-Linern und Bildschirmen kann dann in nachfolgenden biolistischen Transfektionen wiederverwendet werden </li></ol> Fehlersuche Tipps für Biolistic Transfektion Biolistic Transfektion kann manchmal zu einer suboptimalen Transfektionsbedingungen führen. Es kann zu wenige oder zu viele Zellen transfiziert, zu hohe oder zu niedrige Expression führen können oder Gewebeschnitten dazu führen, dass sich in der Regel gesund. Oft ungesund Scheiben ergeben sich aus der Druckwelle. Hier sind einige Tipps, um optimal transfiziert Gewebeschnitte zu erhalten. Wenn Scheiben scheinen ungesund sein (oder, wenn zu viele Zellen / Scheibe transfiziert), versuchen Sie: <ul><li> zunehmende Aufnahmeabstand </li><li> abnehmendem Druck auf Gastank </li><li> Verringerung der Menge an Gold </li><li> Ausschneiden der Mitte des Bio-Rad-Diffusor und Ersetzen der Mitte mit einer Streuscheibe. </li></ul> Wenn zu wenige Zellen transfiziert sind, versuchen Sie: <ul><li> abnehmender Aufnahmeabstand </li><li> zunehmenden Druck auf die Gas-Tank </li><li> Erhöhung der Menge von Gold </li><li> Erhöhung der Anzahl von Gewebeschnitten / well </li><li> sicherstellen, dass die O-Ring in den Lauf-liner ist intakt. </li></ul> Wenn Sie Slices erhalten sowohl mit zu vielen und zu wenigen Zellen während der gleichen Aufnahmebedingungen stellen Sie sicher, transfiziert: <ul><li> dass Sie mit der Waffe symmetrisch über gut </li><li> dass Gold gleichmäßig Beschichtung der Innenseite der Rohre. (Wenn Sie immer eine Reihe von Gold sind, ziehen den Überstand vom Schlauch mit einer schnelleren Rate, wenn das Gold abgesetzt hat, und drehen Sie das Gold mehr, bevor Sie den Stickstoff. Wenn auf der anderen Seite bekommen Sie Streifenbildung von Gold Dies ist wahrscheinlich auf zu viel Feuchtigkeit Exposition während der Kugel machen: stellen Sie sicher, Sie verwenden eine ungeöffnete Flasche EtOH, dass der Schlauch gründlich vor der Beschichtung trocken, und dass Sie Capping Deckel und Vorbereitung Kugeln in einer fristgerechten Weise). </li></ul> Wenn Transfektionseffizienz scheint optimal (#-Zellen transfiziert / Stück), aber der Ausdruck Ebene scheint zu hoch oder zu niedrig: <ul><li> Anpassung des Verhältnisses DNA zu Gold. (ZB wenn sie zu niedrig halten die Menge des Goldes, sondern die Menge an DNA.) </li><li> Anpassung der Höhe der Zeit zwischen Aufnahme-und Datenerfassung </li></ul> Im Falle von Dual-Transfektion, wenn Sie auch zu wenig Ausdruck eines Ihrer Konstrukte, passen Sie das Verhältnis der beiden Konstrukte in geeigneter Weise und stellen Sie sicher, dass beide Konstrukte unter den gleichen Promotor, so stellen Sie sicher, dass man Promotor wird nicht out-Wettbewerb der anderen Seite.

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Biolistic Transfektion ist eine physikalische Mittel zur Transfektion von Zellen über Beschuss von lebendem Gewebe mit hoher Geschwindigkeit DNA beschichtete Goldpartikel. In der Teilchen-vermittelten Gentransfer im Allgemeinen transfizierten Zellen entstehen, wenn die Kugel kommt in den Kern ruhen. Während viele verschiedene Transfektion Methoden existieren, wie Mikroinjektion, Lipofektion, Calcium-Phosphat-Transfektion, Elektroporation und virale Transfektion kann biolistischen Transfektion bieten eine weniger arbeitsintensiv und effiziente Alternative zur Transfektion von Zellen, die nicht einfach sind, transfiziert mit diesen anderen Methoden. In der Tat war es zunächst als eine Technik für den Gentransfer in Pflanzen entwickelt, da das Vorhandensein der Zellwand aus Transfektion schwierig mit existierenden Methoden 1. Ebenso hat Biolistik Popularität auf dem Gebiet der Neurobiologie gewonnen, da post-mitotischen Neuronen notorisch schwer zu 2,3 transfizieren sind. Insbesondere ist es weithin als das Prinzip Technik, um in Experimenten bei der Beurteilung feinen Morphologie der einzelnen Neuronen im intakten Gehirn Scheiben sollen verwendet werden anerkannt. Die hier beschriebenen Methoden liefern eine detaillierte und umfassende Erklärung, wie biolistischen Transfektion von kultivierten Hirnschnitten durchführen mit einer Hand gehalten Gen-Kanone (die Helios Gene Gun-System; Bio-Rad). Biolistic Transfektion ist die bevorzugte Methode zur Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur, weil es die Transfektion von einem spärlichen Anzahl von Zellen im Gehirn Scheibe ermöglicht. Auf diese Weise können einzelne Neuronen isoliert betrachtet werden. Da diese Technik eignet sich besonders gut zur Transfektion von Neuronen im Gehirn Scheibe geeignet, ist es oft in Verbindung mit 2-Photonen-Mikroskopie verwendet, da 2-Photonen-Anregung ermöglicht die Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Zellen tief im Lichtstreuung Gewebe 4. In der Tat die hohe Vergrößerung Bilder einzelner Pyramidenneuronen in diesem Video vorgestellt wurden unter Verwendung einer speziell angefertigten 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop. Abschließend biolistischen Transfektion ist ein effizientes Mittel zur Transfektion von einzelnen Zellen im Kontext einer hohen Dichte von umgebenden Zellen, und als solche hat sich als extrem nützlich für die Fluoreszenzmarkierung einzelner Neuronen in neuronalen Stück Kultur.

Obwohl wir alle aufgeführten Produkte sind getrennt, ist es wirtschaftlich in der Anschaffung &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, das mit allen Produkten von Bio-Rad oben aufgeführt wurden (cat # 165-2431) enthält.

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

Biolistic Transfektion ist eine physikalische Mittel zur Transfektion von Zellen durch den Beschuss Gewebe mit hoher Geschwindigkeit DNA beschichtete Partikel. Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll für biolistischen Transfektion von Ratten-Hippocampus Scheiben, von der ersten Herstellung von DNA-ummantelten Kugeln um die letzten Schießen der organotypischen Kulturen mit einer Gen-Kanone. Gene gun Transfektion ist eine effiziente und einfach mittels Transfektion von Neuronen und ist besonders nützlich für Fluoreszenzmarkierung eine kleine Untergruppe von Zellen im Gewebe zu schneiden. In diesem Video haben wir zunächst einen Überblick über die erforderlichen Schritte zu beschichten Goldpartikel mit DNA. Wir nächsten demonstrieren, wie auf der Innenseite der Kunststoffschlauch mit dem Gold / DNA Kugeln Linie, und wie man diese Rohre geschnitten, um die Kunststoff-Patronen zum Laden in den Gen-Kanone zu erhalten. Schließlich führen wir biolistischen Transfektion von Ratten-Hippocampus Scheibe Kulturen demonstrieren Umgang mit dem Bio-Rad Helios Gene Gun, und bietet Fehlersuche Ratschläge für gesunde und optimal transfiziert Gewebeschnitte zu erhalten.

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Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von DNA beschichteten Gold-Kugeln und zeigen die Verwendung solcher Geschosse zu biolistically transfizieren Neuronen in kultivierten Hippocampus-Schnitten.

Vorbereitung der Gene Gun und Aufzählungszeichen Biolistic Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Biology

52.2K Aufrufe.  University of California, Davis. Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von DNA beschichteten Gold-Kugeln und zeigen die Verwendung solcher Geschosse zu biolistically transfizieren Neuronen in kultivierten Hippocampus-Schnitten.

Serie: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Forschung

Biologie

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfektion von Neuronen im Hippocampus

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Organotypischen Kultur der E18 Gehirn von Ratten

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.