Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health Grants (R01NS085215 bis K.F., T32 GM107000 und F30MH122146 bis A.C.) unterstützt. Die Autoren danken Frau Naoe Watanabe für die geschickte technische Unterstützung.

Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Massachusetts Medical School überprüft und genehmigt. Scheibenkulturvorbereitung, Plasmidvorbereitung und Elektroporation sind ebenfalls in unseren zuvor veröffentlichten Methoden detailliert beschrieben und können für zusätzliche Informationen10erwähnt werden.
1. Zubereitung der Scheibenkultur
<ol><li>Bereiten Sie organotypische Hippocampus-Scheibenkulturen der Maus wie zuvor beschrieben11vor, wobei postnatale 6 bis 7 Tage alte Mäuse beiderlei Geschlechts verwendet werden.<ol>
<li>Präpariermittel für die organotypische Scheibenkultur bestehend aus (in mM): 238 Saccharose, 2,5 KCl, 1CaCl2,4MgCl2,26 NaHCO3, 1NaH2PO4und 11 Glucose in entionisiertem Wasser, dann Gas mit 5%CO2/95% O2 bis zueinem pH-Wert von 7,4.</li>
		<li>Organotypische Scheibenkulturmedien werden hergestellt, bestehend aus: 78,8% (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, 20% (v/v) Pferdeserum, 17,9 mM NaHCO3,26,6 mM Glucose, 2 M CaCl2,2 M MgSO4,30 mM HEPES, Insulin (1 μg/ml) und 0,06 mM Ascorbinsäure, pH-Wert auf 7,3 eingestellt. Stellen Sie die Osmolarität mit einem Osmometer auf 310-330 Osmol ein.</li>
		<li>Sezieren Sie Hippocampi aus dem gesamten Gehirn, indem Sie zwei Spatel verwenden, und schneiden Sie (400 μm) mit einem Gewebehäcksler. Trennen Sie die Scheiben mit zwei Zinnen und geben Sie sie auf 30 mm Zellkultureinsätze in einer 6-Well-Platte, die mit Nährmedien (950 μL) unter den Einsätzen gefüllt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lagern Sie organotypische Scheibenkulturen in einem Gewebekultur-Inkubator (35°C, 5% CO2)und wechseln Sie die Scheibenkulturmedien alle zwei Tage.</li>
</ol>2. Plasmidpräparation
<ol><li>Bereiten Sie das Plasmid für das interessierende Gen vor.<ol>
<li>Subclone enhanced green fluorescent protein (EGFP) Gen in einen pCAG-Vektor.</li>
		<li>Reinigen Sie das pCAG-EGFP-Plasmid mit einem endotoxinfreien Reinigungskit und lösen Sie es in einer internen Lösung auf, die aus mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser besteht, das 140 mM K-Methansulfonat, 0,2 mM EGTA, 2 mMMgCl2und 10 mM HEPES enthält, eingestellt auf pH 7,3 mit KOH (Plasmidkonzentration: 0,1 μg/μL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Glaspipettenvorbereitung
<ol><li>Ziehen Sie Borosilikatglaspipetten (4,5 – 8 MΩ) auf einem Mikropipettenzieher (Abbildung 1A). HINWEIS: Die Glaspipetten, die für Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufnahmen verwendet werden, sind ideal für die Elektroporation.</li>
	<li>Glaspipetten über Nacht bei 200°C backen, um sie zu sterilisieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Größe der Pipettenspitze unter einem Seziermikroskop, um den elektrischen Widerstand anzunähern.<ol>
<li>Optional:Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand, indem Sie die Pipette an der Elektroporationselektrode befestigen und den Mikromanipulator verwenden, um die Pipettenspitze in filtersterilisierte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) zu manövrieren, die (in mM) enthält: 119 NaCl,2,5KCl, 0,5 CaCl2, 5MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 und 11 Glucose in entionisiertem Wasser, vergast mit 5%CO2/95%O2 bis zu einem pH-Wert von 7,4. Bestätigen Sie den tatsächlichen Widerstand mit der Ablesung am Elektroporator. HINWEIS: Je schärfer die Pipettenspitze, desto größer der elektrische Widerstand. Der Pipettenwiderstand sollte unter 10 MΩ liegen. Glaspipetten mit hohem Pipettenwiderstand (Abbildung 1B) verstopfen bei wiederholter Elektroporation oft an der Spitze.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Einrichtung der Elektroporationsanlage
<ol><li>Installieren Sie den Elektroporator in einem Standard-Ganzzellen-Elektrophysiologie-Rig, das mit einem aufrechten Mikroskop ausgestattet ist, das auf einem Schalttisch mit einem Mikromanipulator und einer Peristaltikpumpe montiert ist.</li>
	<li>Installieren Sie die Kopfbühne des Elektroporators auf einem Mikromanipulator und verbinden Sie ein Paar Lautsprecher mit dem Elektroporator. Verbinden Sie den Elektroporator mit einem Fußpedal, mit dem bei Bereitschaft ein Impuls gesendet werden kann. HINWEIS: Die Lautsprecher geben beim Einschalten einen Ton ab, der einen Indikator für den elektrischen Widerstand an der Elektrode ist. Dies ermöglicht es, relative Widerstandsänderungen zu bestimmen, ohne die Aufmerksamkeit vom Verfahren abzuwenden.</li>
</ol>5. Elektroporationsvorbereitung
<ol><li>Übertragen Sie die Scheibenkultureinsätze von 6 Well-Platten auf 3 cm Petrischalen, die mit 900 μL Nährmedien beladen sind, und lagern Sie sie ineinem CO 2-Inkubator auf der Tischplatte, bis sie zur Elektroporation bereit sind.<ol>
<li>Frische Kultureinsätze mit Scheibenkulturmedien (1 ml) für mindestens 30 min in einer 3,5 cm Petrischale zu Kulturscheiben nach der Elektroporation vorbestellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen und bereiten Sie das Rig für die Elektroporation vor.<ol>
<li>Durchseuchen Sie die Linien mit 10% Bleichmittel für 5 Minuten, um den Schlauch und die Kammer zu sterilisieren, bevor Sie mit dem Experiment für den Tag beginnen.</li>
		<li>Die Leitungen mindestens 30 Minuten lang mit entionisiertem autoklaviertem Wasser durchträgen, um sie vollständig abzuspülen.</li>
		<li>Durchtuchen Sie die Leitungen mit filtersterilisiertem aCSF, das 0,001 mM Tetrodotoxin (TTX) enthält. HINWEIS: TTX minimiert die zelluläre Toxizität und den Tod durch Übererregung der Interneuronen10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie die Pulsparameter des Elektroporators ein: Amplitude von –5 V, quadratischer Impuls, Zug von 500 ms, Frequenz von 50 Hz und eine Pulsbreite von 500 μs.</li>
	<li>Glaspipette mit 5 μL plasmidhaltiger Innenlösung füllen.<ol>
<li>Entfernen Sie alle eingeschlossenen Luftblasen von der Pipettenspitze, indem Sie mehrmals streichen und vorsichtig auf die Spitze tippen.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Spitze auf Beschädigungen, indem Sie sie unter einem Dissektionsmikroskop visualisieren oder Schritt 3.3.1 wiederholen, um den Pipettenwiderstand zu überprüfen. HINWEIS: Wenn die Spitze beschädigt ist, muss die Glaspipette entsorgt werden, und dieser Schritt muss mit einer neuen Glaspipette wiederholt werden, die zuvor in Schritt 3 vorbereitet wurde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Befestigen Sie die Pipettenspitze sicher an der Elektrode und schalten Sie die Lautsprecher ein. Notieren Sie die Auslesung (den Widerstand der Pipette) des Elektroporators, wenn die Spitze mit dem aCSF-Medium in Kontakt gekommen ist.</li>
	<li>Schneiden Sie die Kultureinsatzmembran mit einer scharfen Klinge ab und isolieren Sie eine Scheibenkultur. Übertragen Sie die Scheibenkultur vorsichtig mit einer scharf abgewinkelten Schärfe in die Elektroporationskammer und fixieren Sie ihre Position mit einem Scheibenanker.<ol>
<li>Halten Sie die Scheibenkultur nicht mehr als 30 Minuten am Stück außerhalb des Inkubators, um Nebenwirkungen wie Veränderungen der neuronalen Gesundheit oder Funktion zu vermeiden12.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Elektropulverzellen von Interesse
<ol><li>Drücken Sie mit dem Mund oder mit einer 1-ml-Spritze (0,2 - 0,5 ml Druck), die am Schlauch befestigt ist, auf die Pipette.</li>
	<li>Verwenden Sie die 3-dimensionalen Knopfsteuerungen des Mikromanipulators, um die Pipettenspitze in der Nähe der Oberfläche der Scheibenkultur zu manövrieren.</li>
	<li>Wählen Sie eine Zielzelle und nähern Sie sich ihr, wobei der übermässige Druck ausgeübt wird, bis sich ein Grübchen auf der Zelloberfläche bildet, das auf dem Mikroskop sichtbar ist.</li>
	<li>Führen Sie Druckzyklen durch.<ol>
<li>Schnell leichten Unterdruck durch den Mund ausüben, so dass sich zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran eine lose Versiegelung bildet, die optisch durch die Membran angezeigt wird, die etwas in die Pipettenspitze hinaufgeht. Beobachten Sie eine Erhöhung (~ 2,5x des Anfangswiderstands) des Pipettenwiderstands, indem Sie auf eine Tonerhöhung von den Lautsprechern hören. Wenden Sie schnell wieder Überdruck an, damit sich der Grübchen neu bildet.</li>
		<li>Schließen Sie sofort mindestens zwei weitere Druckzyklen ohne Pause ab und halten Sie dann den Unterdruck für 1 s. HINWEIS: Eine Pause zwischen den Zyklen, zu viel Druck oder zu langes Halten des Unterdrucks kann zu erheblichen Zellschäden führen und möglicherweise dazu führen, dass die Zelle während der Elektroporation stirbt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulsieren Sie den Elektroporator schnell mit dem Fußpedal, wenn der Ton der Lautsprecher einen stabilen Scheitelpunkt in der Tonhöhe erreicht, was den maximalen elektrischen Widerstand anzeigt. Warten Sie nicht länger als 1 s am Spitzenwiderstand, bevor Sie den Impuls senden. HINWEIS: Wir haben bei Verwendung dieses Protokolls10keine Off-Target-Elektroporation beobachtet. Nur die Zellen, die während der Druckzyklen mit der Glaspipette in Kontakt kamen, wurden transfiziert. Die Positionierung der Pipette in der Nähe anderer Neuronen führt nicht zu einer Gentransfektion.</li>
	<li>Ziehen Sie die Pipette vorsichtig ca. 100 μm aus der Zelle zurück, ohne Druck auszuüben.</li>
	<li>Wenden Sie erneut einen positiven Druck an, um sicherzustellen, dass der Widerstand dem aufgezeichneten Auslesen in Schritt 5.5 ähnelt, und nähern Sie sich dann der nächsten Zelle.<ol>
<li>Entfernen Sie potenzielle Verstopfungen, die visuell oder durch einen signifikant erhöhten (>15% höheren) Pipettenwiderstand nach der Elektroporation angezeigt werden, indem Sie einen positiven Druck ausüben. HINWEIS: Wenn es keine sichtbare Verstopfung gibt und der Widerstand immer noch deutlich höher ist, entsorgen Sie die Pipette und verwenden Sie eine neue. Im Durchschnitt kann eine Pipette für bis zu 20 Elektroporationsereignisse verwendet werden, wenn der Benutzer vorsichtig ist10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach der Elektroporation die Scheibenkultur auf einen frischen Kultureinsatz übertragen und bei 35°C im Inkubator bis zu 3 Tage inkubieren.</li>
</ol>7. Fixierung, Färbung und Bildgebung von organotypischen Hippocampus-Scheibenkulturen
<ol><li>Elektroporierte organotypische Scheibenkulturen 2 – 3 Tage nach der Transfektion mit 4% Paraformaldehyd und 4% Saccharose in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) für 1,5 h bei Raumtemperatur fixieren.</li>
	<li>Fixiermittel entfernen und Scheiben in 30% Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer (1x PB) für 2 h inkubieren.</li>
	<li>Legen Sie die Scheiben auf ein Diaglas und frieren Sie sie ein, indem Sie das Diaglas auf zerkleinertes Trockeneis legen. Die Scheiben bei Raumtemperatur auftauen und auf eine 6-Well-Platte geben, die mit 1x PBS gefüllt ist.</li>
	<li>Die Scheiben mit Maus-Anti-GFP- und Kaninchen-Anti-RFP-Antikörpern in GDB-Puffer (0,1% Gelatine, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl und 32% 1x PB, pH 7,4) für 2 h bei Raumtemperatur einfärben.</li>
	<li>Waschen Sie die Scheiben mit 1x PBS dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 10 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie Scheiben mit Anti-Maus Alexa 488-konjugiertem sekundären Antikörper und Anti-Kaninchen Alexa 594-konjugiertem sekundären Antikörper im GDB-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie Scheiben mit DAPI (4 μg/ml) in 1x PBS für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Scheiben mit 1x PBS dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 3 min.</li>
	<li>Montieren Sie Scheiben mit einem Montagemedium auf Glasobjektträgern und führen Sie eine Fluoreszenzbildgebung durch.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells.">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), 479-488 (1980).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. 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J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+microporation+technique+for+the+transfection+of+cultured+CNS+neurons.">A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).</li><li>Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+individual+neurons+using+modified+electrophysiology+techniques.">High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).</li><li>Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+small+interfering+RNA+by+single-cell+electroporation+in+cerebellar+cell+cultures.">Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).</li><li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporation+of+Neurons.">Single-Cell Electroporation of Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robot+for+high+yield+electrophysiology+and+morphology+of+single+neurons+in+vivo.">A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 15604 (2017).</li><li>Steinmeyer, J. D., Yanik, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li><li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Wir beschreiben hier eine Elektroporationsmethode, die sowohl exzitatorische als auch hemmende Neuronen mit hoher Effizienz und Präzision transfiziert. Unser optimiertes Elektroporationsprotokoll verfügt über drei innovative Durchbrüche, um eine hocheffiziente Gentransfektion zu erreichen. Unsere erste Modifikation bestand darin, die Pipettengröße im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten Protokollen3,5,6zuerhöhen. Dies...

In der Molekularbiologie ist eine der wichtigsten Überlegungen für einen Forscher, wie man ein Gen von Interesse in eine Zelle oder Zellpopulation liefert, um seine Funktion aufzuklären. Die verschiedenen Verabreichungsmethoden können entweder als biologisch (z. B. ein viraler Vektor), chemisch (z. B. Calciumphosphat oder Lipid) oder physikalisch (z. B. Elektroporation, Mikroinjektion oder Biolistik)1,2kategorisiert werden. Biologische Methoden sind hocheffizient und können zelltypspezifisch sein, sind aber durch die Entwicklung spezifischer genetischer Werkzeuge begrenzt. Chemische Ansätze sind in vitro sehr leistungsfähig, aber Transfektionen sind im Allgemeinen zufällig; Darüber hinaus sind diese Ansätze meist nur Primärzellen vorbehalten. Von den physikalischen Ansätzen ist die Biolistik aus technischer Sicht die einfachste und einfachste, produziert aber wiederum zufällige Transfektionsergebnisse mit einer relativ geringen Effizienz. Für Anwendungen, die den Transfer in bestimmte Zellen erfordern, ohne dass genetische Werkzeuge entwickelt werden müssen, schauen wir uns die Einzelzellelektroporationan 3,4.
Während sich die Elektroporation früher nur auf die Feldelektroporation bezog, wurden in den letzten zwanzig Jahren mehrere in vitro und in vivo Einzelzellelektroporationsprotokolle entwickelt, um die Spezifität und Effizienz zu verbessern5,6,7, die zeigen, dass die Elektroporation verwendet werden kann, um Gene auf einzelne Zellen zu übertragen und daher äußerst präzise sein kann. Die Verfahren sind jedoch technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig und relativ ineffizient. In der Tat haben neuere Arbeiten die Machbarkeit von mechanisierten Elektroporationsrigs8,9untersucht,die dazu beitragen können, mehrere dieser Barrieren für Forscher zu beseitigen, die an der Installation solcher Robotik interessiert sind. Aber für diejenigen, die nach einfacheren Mitteln suchen, bleiben die Probleme mit der Elektroporation, nämlich Zelltod, Transfektionsversagen und Pipettenverstopfung, ein Problem.
Wir haben kürzlich eine Elektroporationsmethode entwickelt, die größere Glaspipetten, mildere elektrische Pulsparameter und einen einzigartigen Druckzyklusschritt verwendet, der eine viel höhere Transfektionseffizienz in exzitatorischen Neuronen erzeugte als frühere Methoden und es uns zum ersten Mal ermöglichte, Gene in inhibitorischen Interneuronen zu transfizieren, einschließlich somatostatin-exprimierender inhibitorischer Interneuronen in der Hippocampus-CA1-Region der organotypischen Scheibenkultur der Maus10. Die Zuverlässigkeit dieser Elektroporationsmethode in verschiedenen inhibitorischen Interneurontypen und neuronalen Entwicklungsstadien wurde jedoch nicht untersucht. Hier haben wir gezeigt, dass diese Elektroporationstechnik in der Lage ist, Gene sowohl in exzitatorische Neuronen als auch in verschiedene Klassen von Interneuronen zu transfizieren. Wichtig ist, dass die Transfektionseffizienz unabhängig von den getesteten Tagen in vitro (DIV) Scheibenkultur hoch war. Diese etablierte und benutzerfreundliche Technik wird jedem Forscher empfohlen, der daran interessiert ist, die Einzelzellelektroporation für verschiedene Zelltypen im Zusammenhang mit In-vitro-Mausgehirngewebe zu verwenden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organotypic slice culture preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU02RE</td>
			<td>Filtration and storage of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Tissue chopper for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP03050</td>
			<td>Organotypic slice culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Precision Systems</td>
			<td>OSMETTE II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated spatulas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-06369-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td>Filtration and storage of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glasses</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetter Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD (E2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller Filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FB330B</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mm Falcon Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtable</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-7512E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Q Imaging</td>
			<td>Retiga-2000DC</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoporator 800A</td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination System</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-385</td>
			<td>Manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Dynamax, RP-2</td>
			<td>Perfusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shifting Table</td>
			<td>Luigs &#38; Neuman</td>
			<td>240 XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speaker</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td>Speakers connected to the electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons

Die Elektroporation hat sich als kritische Methode etabliert, um bestimmte Gene in Zellen zu übertragen, um ihre Funktion zu verstehen. Hier beschreiben wir eine Einzelzell-Elektroporationstechnik, die die Effizienz (~ 80%) der In-vitro-Gentransfektion in exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen in organotypischer Hippocampus-Slice-Kultur von Mäusen maximiert. Mit großen Glaselektroden, Tetrodotoxin-haltiger künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit und milden elektrischen Impulsen lieferten wir ein interessantes Gen in kultivierte Hippocampus-CA1-Pyramidenneuronen und inhibitorische Interneuronen. Darüber hinaus konnte die Elektroporation in kultivierten Hippocampus-Scheiben bis zu 21 Tage in vitro ohne Verringerung der Transfektionseffizienz durchgeführt werden, was die Untersuchung unterschiedlicher Entwicklungsstadien der Scheibenkultur ermöglichte. Mit wachsendem Interesse an der Untersuchung der molekularen Funktionen von Genen in einer Vielzahl von Zelltypen zeigt unsere Methode einen zuverlässigen und unkomplizierten Ansatz für die In-vitro-Gentransfektion im Gehirngewebe von Mäusen, der mit vorhandenen elektrophysiologischen Geräten und Techniken durchgeführt werden kann.

Unsere Einzelzellelektroporation ist in der Lage, Gene präzise in visuell identifizierte exzitatorische und hemmende Neuronen zu liefern. Wir haben drei verschiedene neuronale Zelltypen zu drei verschiedenen Zeitpunkten elektroporiert. Parvalbumin (Pv) oder vesikuläre Glutamat Typ 3 (VGT3) exprimierende Neuronen wurden visualisiert, indem Pvcre (JAX #008069) oder VGT3cre (JAX #018147) Linien mit TdTomato (eine Variante des rot fluoreszierenden Proteins) Reporterlinie (Jax #007905) überquert wurde...

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Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

single-cell-electroporation-across-different-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.6K Aufrufe.  University of Massachusetts Medical School. Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Serie: Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...