Unsere Forschung untersucht das Pflegeverhalten bei Drosophila melanogaster nach RNAi-vermitteltem Atg8a-Knockdown, um GABARAP-Defizite zu modellieren, die bei Patienten mit Tourette-Syndrom beobachtet wurden. Unser Ziel ist es, die Rolle von aAtg8a bei der Verhaltensentwicklung zu verstehen und Einblicke in die regulatorischen Funktionen seines menschlichen Gegenstücks in neurologischen Verhaltensprozessen zu geben. Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen bei der manuellen Annotationsmethode gehören der komplexe Analyseprozess, wie z. B. das Kommentieren und Überprüfen von Filmmaterial, und die Subjektivität, die mit der manuellen Annotation verbunden ist.
Automatisierte Methoden stehen auch vor Herausforderungen, einschließlich der Notwendigkeit erheblicher Informatikkenntnisse, um effektiv zu implementieren und auszuführen. Wir haben herausgefunden, dass das Gen Atg8a eine Rolle bei der Entwicklung des Verhaltens von Fruchtfliegen spielt, die über das hinausgeht, was bisher bekannt ist. Genauer gesagt fanden wir heraus, dass es sowohl die Fellpflege als auch das Lernen reguliert, was darauf hindeutet, dass Atg8a-Orthologe in anderen Organismen eine ähnliche Rolle spielen könnten.
Diese Technik ermöglicht die direkte Quantifizierung der Häufigkeit und Verteilung der Fellpflege in Drosophila. Es ist besonders nützlich in Laboren, die keine automatisierten Methoden verwenden können, und ermöglicht eine detailliertere Analyse als indirekte, farbstoffbasierte Methoden. Insgesamt fördert unsere Forschung die Verwendung von Drosophila als Modellorganismus für die Untersuchung von neurologischen Entwicklungsstörungen, die zwanghaftes Verhalten wie das Tourette-Syndrom zeigen.
Es trägt auch zu den zunehmenden Beweisen bei, dass Autophagie-bezogene Proteine eine Rolle bei der Verhaltensentwicklung spielen. Stellen Sie zunächst vier Drei-Well-Schalen nebeneinander auf eine weiße Fläche und decken Sie jede Schale mit einem Glasobjektträger ab. Positionieren Sie eine Kamera über dem Geschirr.
Stellen Sie sicher, dass die Folien nicht blendbar sind, die die Sichtbarkeit von Fliegen in der Schüssel einschränken könnten, und passen Sie die Position des Tellers an oder dimmen Sie die Beleuchtung nach Bedarf, um Blendung zu vermeiden. Markieren Sie nun die Position der Gerichte und der Kamera auf der Bank, auf der die Aufnahme stattfindet. Legen Sie vier bis neun Tage alte Fliegen auf einen mit Parafilm bedeckten Eisblock und ein Papiertuch, um sie leicht zu betäuben.
Bringen Sie die Fliegen nach der Betäubung so schnell wie möglich mit einem Pinsel in die Beobachtungskammern. Platzieren Sie eine Fliege in jeder Vertiefung der Drei-Well-Schüssel und sorgen Sie für minimale Störungen, um stressbedingte Verhaltensänderungen nicht zu provozieren. Nachdem Sie die Fliegen 30 Minuten nach der Anästhesie akklimatisiert haben, nehmen Sie die Fliegen mit einer Kamera auf, öffnen Sie dann das Terminal und geben Sie cd PiSpy ein.
Geben Sie python3 PiSpy ein. py und geben Sie die gewünschte Aufnahmelänge und Bildrate ein. Wählen Sie die gewünschte Auflösung aus und klicken Sie auf Quick Capture.
Verwenden Sie nun die Kameravorschaufunktion in Pi Spy, um sicherzustellen, dass die Fliegen scharf und ausreichend sichtbar sind. Nehmen Sie die Fliegen 10 Minuten lang mit einer empfohlenen Bildrate von 24 Bildern pro Sekunde auf und speichern Sie die Datei. Um das Video zu analysieren, importieren Sie die Datei in die ELAN 6.8-Software, um detaillierte Anmerkungen zu machen und das Pflegeverhalten eingehend zu analysieren.
Wählen Sie "Ebene" aus, "Neue Ebene hinzufügen", geben Sie "location" in der Schüssel in den Ebenennamen ein und fügen Sie "Hinzufügen" aus, um jede Zeile zuzuweisen, um das Filmmaterial von Personen manuell mit Anmerkungen zu versehen. Um Verhalten mit Anmerkungen zu versehen, doppelklicken Sie auf die Stufe, die mit Anmerkungen versehen werden soll, klicken Sie mit der rechten Maustaste und ziehen Sie den Cursor entlang der ausgewählten Ebene für einen Zeitraum, in dem eine einzelne Pflegephase gezeigt wird. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um eine neue Anmerkung auszuwählen, und doppelklicken Sie auf den neu markierten Zeitraum, um die Abkürzung für das zu diesem Zeitpunkt beobachtete Verhalten einzugeben.
Sobald das Video vollständig kommentiert ist, erhalten Sie eine Aufschlüsselung der einzelnen Verhaltensweisen, indem Sie auf Ansicht klicken, gefolgt von Anmerkungsstatistiken. Identifizieren Sie die vordere Fellpflege als Fellpflege, die im vorderen Bereich des Fliegenkörpers durchgeführt wird. Identifizieren Sie die posteriore Fellpflege als Fellpflege, die am anterior-posterioren Ende des Fliegenkörpers durchgeführt wird.
Die Anzahl der Grooming-Anfälle stieg bei Atg8a-RNAi-Mutanten im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant an. Die Zeit, die für die Fellpflege aufgewendet wurde, war bei Atg8a-RNAi-Mutanten im Vergleich zu Kontrollen ebenfalls signifikant erhöht. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung des vorderen und hinteren Pflegeverhaltens beobachtet.
