유방이나 췌장의 고형 종양으로 진단된 환자의 경우, 전이 또는 치료 저항성과 같은 질병 진행 사건과 좋지 않은 결과 사이에는 강한 상관관계가 있습니다. 조직의 항상성과 섬유증을 관장하는 세포 분자 메커니즘은 고형 종양의 진행도 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 저희 연구실은 환자를 돕기 위한 치료법과 진단 방법을 더 잘 개발할 수 있도록 이러한 메커니즘을 이해하는 데 관심이 있습니다.
주요 실험적 과제 중 하나는 생리학적 및 병태생리학적 과정에서 세포 간 상호 작용을 포착할 수 있는 3D 암 모델이 절실히 필요하며, 이러한 상호 작용을 이해함으로써 질병에 대한 추가적인 통찰력을 이해하여 새로운 치료 전략을 개발할 수 있다는 것입니다. 당사의 프로토콜은 생체 내 조직 미세환경 특성을 복제하는 비용 효율적이고 재현 가능한 3D 세포 배양 방법을 제공할 것입니다. 당사의 프로토콜은 이질적인 세포 상호 작용을 정량화할 수 있는 쉽고 빠른 스캐폴드가 없는 스캐폴드 기반 3D 세포 배양 방법을 제공할 것입니다.
우리는 스캐폴드가 없는 모델과 함께 사용할 수 있을 뿐만 아니라 스캐폴드 기반 시스템과 병합하여 세포 침입 및 거동을 측정할 수 있는 3D 스페로이드 배양을 효율적으로 공식화하는 방법을 발견했습니다. 시작하려면 자외선을 켜서 생물 안전 캐비닛 내부를 15 분 동안 소독하십시오. 생물 안전 캐비닛 창틀을 열어 공기 흐름을 안정화하고 진공 흡입 시스템을 켭니다.
내부 후드 표면과 진공 흡입 시스템의 튜브를 70% 에탄올로 청소합니다. 비드 배스에서 세포 배양 배지, PBS 및 0.25% 트립신 EDTA를 섭씨 37도로 가열합니다. 이제 현미경으로 세포를 검사하여 70-80%의 포화도를 확인합니다.
진공 흡입기를 사용하여 도금된 세포에서 배양 배지를 흡인하고 폐기합니다. 나머지 배지를 2ml의 PBS로 한 번 세척한 다음 세척 후 PBS를 흡인하고 폐기합니다. 다음으로, 마이크로피펫을 사용하여 세포 배양 접시에 트립신 1ml를 넣고 플레이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.
이제 PBS에 함유된 대두 트립신 억제제 1ml를 플레이트에 첨가하여 트립신을 비활성화합니다. 세포 클러스터를 분산시키기 위해 P-1000 마이크로피펫을 사용하여 액체 혼합물을 피펫팅합니다. 플레이트 바닥에서 세포 현탁액을 모아 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.
튜브를 100G에서 실온에서 5분 동안 원심분리하고 진공 흡입기를 사용하여 상층액을 버립니다. 분자 형광 프로브를 섭씨 37도에서 템퍼링된 비드 수조에서 15분 동안 실온으로 예열합니다. 마이크로피펫을 사용하여 2mL의 각 working cell tracker dye media 용액에 세포를 재현탁합니다.
섭씨 37도의 온도에서 튜브를 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양합니다. 30분 배양 후 실온에서 100G으로 튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 진공 흡입기를 사용하여 상층액을 흡인하고 버립니다.
마이크로피펫을 사용하여 10%FBS 함유 DMEM 1밀리리터에 펠릿을 완전히 재현탁합니다. 이제 10마이크로리터의 세포 현탁액을 수집하여 동일한 부피의 트리판 블루가 들어 있는 마이크로튜브로 옮깁니다. 세포를 혼합한 후 20마이크로리터의 세포 트리판 용액을 세포 계수 챔버 슬라이드에 추가합니다.
슬라이드를 자동화된 셀 카운터에 삽입하여 셀 번호를 확인합니다. 두 번의 판독값에서 평균 총 살아있는 세포 수를 계산합니다. 각 세포 유형에 대한 작업 세포 스톡을 6.67 곱하기 10의 농도로 3 셀의 밀리리터당 3 제곱, 300 마이크로리터당 2, 000 세포에 해당합니다.
마이크로피펫을 사용하여 3회의 기술 복제에 필요한 부피와 1회의 추가 시료를 마이크로튜브로 전달합니다. 피펫으로 철저히 혼합한 후 샘플 300마이크로리터를 U자형 바닥 초저 부착 96웰 마이크로플레이트의 웰로 옮깁니다. 96웰 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다.
위상차 현미경을 사용하여 24시간마다, 최대 96시간까지 스페로이드 성장 및 형태를 이미지화합니다. 이미징 및 자동 인큐베이터 장치를 켭니다. 이미징 소프트웨어의 작업 관리자에서 새로운 이미징 프로토콜을 생성하여 BJ-5ta 섬유아세포와 공동 배양된 BT-474 스페로이드 및 세포 추적기가 각각 파란색, 주황색 및 진한 빨간색으로 염색된 EA.hy926 내피 세포의 48시간 성장을 캡처합니다.
얼음 양동이에 얼음을 채워 기저막 추출물 용액을 차갑게 유지하고 용액을 얼음 위에 놓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 배양 접시에서 약 170마이크로리터의 배지를 흡입합니다. 돋보기와 미니 라이트 박스를 구하여 작은 스페로이드를 자세히 관찰하십시오.
96웰 스페로이드 플레이트를 라이트 박스 위에 놓고 돋보기를 머리 위에 놓습니다. P-200 피펫을 30마이크로리터로 설정하고 기저막 추출물을 수집하여 3개의 마이크로액적을 생성합니다. 96웰 플레이트가 평평한지 확인하고 피펫을 스페로이드 위에 수직으로 배치합니다.
이제 우물 바닥에 닿지 않고 물방울을 놓으십시오. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 20분 동안 놓습니다. 배양 후 웰당 추가로 50마이크로리터의 기저 멤브레인 추출물 용액을 스페로이드에 오버레이하고 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 마이크로피펫을 사용하여 각 웰에 100마이크로리터의 세포 배양 배지를 추가합니다. EA.hy926 및 THP-1 또는 BJ5-ta 및 THP-1과 공동 배양한 MCF-10A, MCF-10Ca1H 및 BT-474 세포는 도금 후 72시간 후에 단일 배양 상피 스페로이드에 비해 스페로이드 면적이 크게 증가했습니다. 대조적으로, 공동 배양된 MDA-MB-468 세포는 단일배양에 비해 스페로이드 면적이 현저히 감소한 것으로 나타났습니다.
스페로이드 확립 전에 BT-474 종양형성 상피세포와 기질세포에 세포 추적기 염료를 적용한 결과, EA.hy926 및 BJ-5ta를 포함한 기질세포가 중앙 BT-474 스페로이드 주변에서 발아 구조를 형성한다는 사실이 입증되었습니다. 도금 후 24시간이 지나면 기저세포와 공동배양된 BT-474 종양형성 상피세포에 기저막을 오버레이하여 침습성 구조의 형성을 입증했습니다.
