Unsere Forschungsschwerpunkte liegen in den Bereichen mikrobielle Diversität, Phylogenomik und Fermentationsanwendungen, wobei der Schwerpunkt auf der Hefevielfalt, Anpassungen und speziell auf der industriellen Anwendung der Hefebiologie liegt. Speziell für diese Anwendungen untersuchen wir die Fermentationseffizienz, die Geschmacksproduktion und die Stresstoleranz bei Hefe. Unsere jüngsten Fortschritte hängen also mit der Phylogenomik der Hefe zusammen, insbesondere aus Patagonien.
Dann verwenden wir dies, um neuartige Lagerhefe für die Biergärung zu erzeugen, aber wir verwenden auch neuartige Hefe für Bier mit niedrigem Alkoholgehalt. Insgesamt verwenden wir verschiedene omische Techniken und experimentelle Evolutionsmethoden, um diese neuartige Hefe für biogeologische Anwendungen zu entwickeln. Wir verwenden derzeit verschiedene Techniken wie Genomsequenzierung, Long-Read-Genomsequenzierung und auch Transkriptomik.
Dann verwenden wir diese Informationen, um eine experimentelle Evolution der verschiedenen Stämme vorzunehmen, die wir haben, und dann versuchen wir, einige der genomischen Veränderungen mit CRISPR-Techniken oder anderen Hefetransformationstechniken zu validieren, und auf diese Weise gelangen wir in die molekularen Details der Hefeanpassung an fermentative Umgebungen. Wir stehen also vor zwei großen Herausforderungen. Eine besteht darin, neuartige Lagerhefe mit effizienter Biergärung zu erzeugen, und eine andere ist das Gegenteil.
Wir wollen neuartige Stämme, insbesondere aus Patagonien, gewinnen, die in der Lage sind, Bier mit niedrigem Alkoholgehalt zu erzeugen. Ich möchte zwei Hauptergebnisse aus unserem Labor hervorheben. Eine davon ist, dass wir einen außerhalb Patagoniens stammenden Ursprung der Mutter der Lagerhefe, Saccharomyces eubayanus, identifizieren.
Und jetzt haben wir auch Dutzende von neuartigen Lagerbierhybriden für die Biergärung entwickelt. Ich denke, das sind die beiden wichtigsten Ergebnisse unserer Forschung. Nehmen Sie zunächst eine Probe aus einem transformierten Hefestammpflaster und inokulieren Sie sie in ein Hefe-Pepton-Medium, das 5 % Glukose und 200 mikromolares Hygromycin enthält.
Inkubieren Sie die Kultur 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius, ohne sie zu schütteln. Die Kulturen werden in frischem Medium in einer Verdünnung von 1 bis 10 aufgefrischt, bevor sie weitere 24 Stunden inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit zuckerfreiem Hefe-Pepton-Medium und inokulieren Sie sie dann in einer Verdünnung von 1 bis 10 in das Testmedium.
Ergänzen Sie das Testmedium mit Luciferin bis zu einer Endkonzentration von 3 Millimolar und mit 200 Mikromolar Hygromycin, um die Plasmidstabilität zu erhalten. Verwenden Sie für Mischzuckerwachstumstests eine Glukose-Maltose-Matrix mit steigenden Glukose- und Maltosekonzentrationen im Hefe-Pepton-Medium. Geben Sie 200 Mikroliter Kultur in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
Verwenden Sie nun ein Luminometer-Plattenlesegerät, um die Lumineszenz und die optische Dichte bei 620 Nanometern alle 30 Minuten für 72 Stunden zu messen. Stellen Sie die Integrationszeit auf eine Sekunde ein und deaktivieren Sie die Dämpfung, um eine kontinuierliche Überwachung der Reporteraktivität und der Zelldichte zu gewährleisten. Für die Fermentationsprobenahme und die Lumineszenzüberwachung wird der Malzextrakt zunächst in Wasser aufgelöst, um das Malzextraktmedium herzustellen.
Vorkultivierte transformierte Hefestämme in 5 Millilitern YPD-Medium bei 20 Grad Celsius und Rühren bei 200 U/min für 24 Stunden. Die Vorkultur auf 50 Milliliter Malzextraktmedium umfüllen und weitere 24 Stunden bei 20 Grad Celsius unter Rühren bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Die Kultur wird bei 21.380 g für eine Minute bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die Zellen zu ernten.
Dann resuspendieren Sie die Zellen in einer 12-Grad-Platte Malzextraktmedium in dreifacher Ausfertigung für 50-Milliliter-Mikrofermentationen. Ergänzen Sie das Medium mit 0,3 Milligramm Zinkchlorid pro Liter, um die Fermentationsleistung zu verbessern. Berechnen Sie das Inokulumvolumen, um eine konsistente Zelldichte über alle Replikate hinweg zu gewährleisten.
Beimpfen Sie das vorbereitete Medium mit der berechneten Menge Inokulum. Stellen Sie die Kulturen dann 14 Tage lang bei 20 Grad Celsius ohne Schütteln ein. Überwachen Sie den Fermentationsfortschritt, indem Sie täglich den Kohlendioxidverlust aufzeichnen.
Wiegen Sie die Gefäße jeden Tag, um den kumulativen Gewichtsverlust als Indikator für die Kohlendioxidproduktion zu messen. Für die Lumineszenzüberwachung nehmen Sie regelmäßig Proben von 200 Mikrolitern von jeder Mikrofermentation. Fügen Sie Luciferin hinzu, um eine Endkonzentration von 3 Millimolar zu erreichen.
Messen Sie die Lumineszenz und optische Dichte bei 620 Nanometern mit einem Luminometer-Plattenlesegerät ohne Dämpfung und mit einer Sekunde Integrationszeit. Das episomale Reporterplasmid pRS426-PMAL32-LUC-HphMX wurde erfolgreich mit dem PMAL32-Promotor Luciferase ORF und der hphMX-Kassette konstruiert. Eine unterschiedliche Luciferase-Aktivität wurde zwischen den drei transformierten Stämmen unter unterschiedlichen Glukose- und Maltosekonzentrationen beobachtet.
CBS12357T und CL467.1 zeigten eine Aktivierung ohne Glukose, während QC18 eine Glukosekonzentration von über 1 % für die Aktivierung benötigte. Unter Mikrofermentationsbedingungen zeigten alle drei transformierten Stämme eine starke Lumineszenz, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten ihren Höhepunkt erreichte. Lumineszenz war in Wildtyp-Stämmen nicht vorhanden.
