NZ möchte lab Mitglieder Subhas Biswas, Andrew Sproul und Ryan Willet für die Ausbildung ihrer in sezieren und Ernte sympathischen Neuronen zu danken. Unterstützt durch Zuschüsse aus dem NIH-NINDS.

1. Vorbereitung für die Zerlegung: <ol><li> Wählen Sie den entsprechenden Kulturschale (10 cm oder 6-well oder 24-Well-Platten, etc.) abhängig von der Art Ihrer Experimente und überziehen sie mit Rattenschwanz Collagen 24 Stunden vor dem Sezieren. Das Verfahren zur Herstellung von Rattenschwanz Collagen und dessen Verwendung zur Beschichtung von Kulturschalen wurden an anderer Stelle (1) beschrieben. </li><li> Bereiten Sie eine 0,25% Trypsin-Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (kein EDTA) und Filter zu sterilisieren. Bereiten Sie 1 ml aliquotiert und bei -20 º C. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung, die 2,5 mM jeweils von Uridin und 5-FDU in destilliertem / deionisiertem H 2 O. Filter-sterilisiert und bereiten 50 pl-Aliquots. Lagerung bei -20 º C. </li><li> Bereiten Sie komplette Medium: RPMI 1640 Kulturmedium mit 10% Hitze-inaktiviertem Pferdeserum (Wärme durch Inkubation in einem 56 º C im Wasserbad für 30 Minuten inaktiviert) und 5% fötales Rinderserum. </li><li> Bereiten Finale Medium: RPMI 1640 Kulturmedium mit 1% hitzeinaktiviertem Pferdeserum + NGF (100ηg/ml Endkonzentration) + Penicillin / Streptomycin (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU-Lösung (10 nM Endkonzentration) . Hinweis: dieses Medium sollte nachgeholt werden frisch vor Gebrauch jedesmal. Für ein Experiment in einem 24-Well-Platten-Format, wird man brauchen, um 12 ml dieses Mediums vorbereitet. Es wird empfohlen, dass Sie ein wenig mehr Vorbereitung. NGF kann aus einer Vielzahl von kommerziellen Quellen (siehe Tabelle am Ende dieses Protokolls) erworben werden. </li><li> Ausstattung: Man wird einem Binokular und Lichtquelle benötigen. Ein Dual-Schwanenhals LWL-Hilfslicht mit Schwerpunkt Tipps bevorzugt. Darüber hinaus wird ein Bedarf zu reinigen und zu sterilisieren (durch Autoklavieren oder Eintauchen in 70% Ethanol für mindestens 20 Minuten) folgende Zerlegung-Werkzeuge: zwei Paare von Mikro-Sezieren Edelstahl Pinzette, und ein Paar Präparierscheren (auch aus Edelstahl und sowohl aus Roboz). Zwei sterile Injektionsnadeln (26 gague x 1 ½ Zoll oder ähnliches) wird auch benötigt werden. Es ist notwendig, eine Dissektion Bord, die eine 3 &quot;x3&quot; Stück Styropor in Aluminiumfolie eingewickelt und mit einem Kimwipe ist. Sprühen Sie die Karte mit 70% Ethanol zu dekontaminieren. Schließlich bereiten ein Feuer-poliertem Glas Weide Pipette. Um Feuer-Politur, nehmen Sie die Glaspipette und halten Sie die Spitze in die Flamme ein paar Sekunden, während der Rotation. Bei näherer Betrachtung wird die Spitze glatter aussehen und die Öffnung wird enger. Dies ist notwendig für den Schritt, wo die Zellen getrennt werden können. Führen Feuerpolitur in einer Zellkultur Haube, so dass die Pipette steril bleibt. </li></ol> 2. Dissection von Superior Halsganglien: <ol><li> Sammeln neugeborenen Ratten Welpen, die im Alter von P0 oder P1 sind. </li><li> Schnell wischen den Welpen für die Präparation mit 70% Ethanol, um die Chancen der Verschmutzung zu reduzieren. </li><li> Schnell enthaupten Welpe mit einem scharfen Schere (dieser Schritt wird nicht im Video angezeigt werden). Halten Sie den Kopf mit einer sterilen Pinzette gegen sterile Gaze kurz drain überschüssiges Blut. </li><li> Platzieren Sie den Kopf auf die Zerlegung Pad mit der Bauchseite nach oben und der kaudalen Ende orientierten Richtung. Der abgetrennte Luftröhre sollte gut sichtbar sein. Verwenden Sie die sterile Injektionsnadeln auf den abgetrennten Kopf der Sezieren Pad in der folgenden Weise zu sichern: push einen Pin obwohl das Dach des Mundes in die Polster und drücken Sie den zweiten Stift wenn der abgetrennte Luftröhre in die Polster. Platzieren Sie die Pads unter dem Binokular und beginnen Dissektion. </li><li> Mit beiden Pinzetten (eine in jeder Hand) wegzuräumen Haut und Fett um die Luftröhre, dabei nicht zu tief. Dadurch wird aussetzen ein Paar Muskeln laufen fast parallel zueinander auf beiden Seiten der Luftröhre. Hinweis: bei der Präparation, müssen Sie mit kaltem sterilem PBS oder kalt, serumfreien RPMI 1640-Medium mit einer sterilen, Pasteurpipette geliefert abzuwaschen überschüssiges Blut und zu halten, den Bereich sauber und feucht zu bewässern. Dies kann nur einmal oder mehrmals je nach getan werden, wie schnell man arbeitet. Für ein Erlebnis Dissektor, dauert es nur etwa zwei Minuten vor drei Minuten bis zu sezieren ein Paar Ganglien. </li><li> Verwenden Sie die Zange zu schneiden und entfernen Sie die Muskeln auf der einen Seite zuerst. </li><li> Sobald die Muskeln entfernt wird, wird die Halsschlagader sichtbar. Oft ist es hell rosa und enthält Blut. Es kann vorkommen, heller als andere Blutgefäße, dass Sie möglicherweise in der Nähe zu sehen und aus diesem Grund der Halsschlagader unter Umständen nicht sofort sichtbar. Diese Arterie verläuft entlang der Luftröhre und gabelt sich in das, was aussieht wie ein &quot;Y&quot;-förmigen Schleife. Diese Zweiteilung ist ein wichtiger Meilenstein und einmal er sich befindet, wird es relativ einfach, die SCG finden. </li><li> Sever die Arterie am meisten kaudalen Ende und heben Sie sie leicht mit der Zange (das andere Ende ist noch angeschlossen ist). Sobald Sie dies tun, werden Sie sehen, eine mandelförmige, glänzend aussehende kleine Masse von Gewebe, das lose an der Arterie ist nur zum Zeitpunkt der Bifurkation befestigt und das hat thread-wie Pre-und / oder postganglionären Verknüpfungen. Dies ist das Ganglion cervicale superius. Verwenden Sie eine zweite Zange in der anderen Hand vorsichtig heraus, und in einem kleinen Kulturschale (35 mm) mit kaltem, serumfreien RPMI 1640-Medium. </li><li> Anschließend entpacken Sie das Ganglion auf der anderen Seite der Luftröhre nach dem gleichen Protokoll. </li></ol> 3. Reinigung der Ganglia: <ol><li> Sobald alle Ganglien wurden herauspräpariert, sollten sie so viel wie möglich von fremden Gewebe befreit werden. </li><li> Unter dem Dissektionsmikroskop, können Sie sehen, dass die Ganglien haben Stücke von Arteria carotis, Fett oder anderes Gewebe angebracht. Arbeiten Sie mit einer Pinzette in jeder Hand zu necken sich diese unerwünschten Stoffe. Ort und Stelle gereinigt Ganglien in ein steriles 15 ml konische, Polypropylen-Röhrchen, mit RPMI 1640-Medium. </li><li> Die Vor-und / oder postganglionären Verknüpfungen sollten auch weggeschnitten werden. Jedes Ganglion hat etwa 10.000 Neuronen. Sobald die Neuronen vergoldet sind, werden sie wieder nachwachsen ihre Neuriten. </li></ol> 4. Gründung sympathische Neuron Kultur: <ol><li> Centrifuge die Ganglien an 200xg für 2 Minuten und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Ganglien in 0,5 bis 1 ml 0,25% Trypsin-Lösung. Legen Sie in einem 37 ˚ C Wasserbad oder Inkubator für 30 Minuten. Dies wird dazu beitragen distanzieren die Zellen in den Ganglien. </li><li> Nach 30 Minuten mit 10 ml Vollmedium zu verdünnen und zu neutralisieren die Trypsin und Zentrifuge bei 200xg für 2 Minuten. </li><li> Überstand und resuspendieren in 2 ml von Final Medium. </li><li> Weitere distanzieren die Zellen durch Zerreiben der Ganglien nach oben und unten mit dem Feuer-poliertem Glas Weide Pipette. Man reibt die Ganglien 20 Mal und legen Sie die Röhrchen auf Eis für ein paar Minuten. </li><li> In der Zwischenzeit, Feuer-polish der Pipette mehr, um die Öffnung schmaler (ca. 2 / 3 bis 1 / 2 mm im Durchmesser). Warten Sie ein paar Minuten, bis sie abkühlt und verreiben den Ganglien 20-mal mehr. Wie Sie fortfahren, wird das Medium geworden schrittweise trüber darauf hinweist, dass die Zellen werden dissoziiert. Wiederholen Sie diesen Schritt ein-oder zweimal, je nachdem wie gut die Zellen zu distanzieren. Nach einiger Zeit werden Sie feststellen, dass alle die Ganglien dissoziiert in Neuronen und keine intakten Ganglien sind sichtbar in die Röhre. Es kann einige Gewebe Material, das nicht distanzieren wird. An dieser Stelle lassen Sie die Röhre in Eis sitzen für ein paar Minuten so, dass jede undissoziierten Schutt auf dem Boden absetzen können. Jetzt sorgfältig sammeln fast alle des Mediums von oben und in einem anderen Rohr. Um sicherzustellen, dass Sie nicht sammeln die undissoziierten Schutt, verlassen etwa 50 ul am Boden des Röhrchens. Fügen Sie mehr von der Final Medium, um die Röhrchen mit dissoziierten Zellen: dieses Volumen ist abhängig von der Art der Kultur Platte ist man zur Kultur mit den Neuronen. Zum Beispiel: Wenn ein 24-well Schale eingesetzt werden, dann mit 0,5 Ganglien pro Well (~ 10.000 Neuronen pro Well) in 0,5 ml von Final Medium pro Vertiefung. Eine typische Ratte Wurf besteht aus 12 Welpen, die 24 Ganglien geben würde. Das ist genug, um Samen einer 24-Well-Platte und das Gesamtvolumen von Final Medium 12 ml. Hinweis: die Ganglien enthalten auch eine kleine Population von Gliazellen und anderen Zelltypen, die in der Kultur wird. Mit Uridine/5-FDU im Finale Medium verhindert ihre Verbreitung und Förderung ihres Todes. </li><li> Feed Zellen alle 48 Stunden durch den Austausch 2 / 3 des Mediums mit frischem RPMI +1% Pferdeserum + NGF und uridine/5-FDU. Hinweis: Auf den ersten, enthält die Kultur sympathischen Neuronen in dieser Runde ohne Neuriten zu suchen. Short Neuriten sichtbar 24 Stunden nach der Sektion und progressiv geworden dichter und im Laufe der Zeit verzweigt. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways.">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li><li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nerve+Growth+Factor:+purification+as+a+30,000-molecular-weight+protein.">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li><li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chat+in+the+Trophic+Web:+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling.">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li><li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development.">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+(NGF)+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons.">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li><li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents.">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).</li><li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways.">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir verwenden Sprague Dawley Ratten für unsere Kulturen. Nehmen Sie sich Zeit und Sorgfalt bei der Reinigung der Ganglien. Entfernen Sie alle Fremdkörper, Blutgefäße und Fett. Dieser Schritt ist bei der Gewährleistung einer Kultur, die mehr oder weniger homogen und frei von fremden Zelltypen ist wichtig. Die Zugabe von uridine/5-FDU wird weitgehend beseitigt alle restlichen nicht-neuronalen (Mitose) Zellen Kontamination der Kultur oder zumindest zu unterdrücken ihre Verbreitung. Darüber hinaus, während die Dissoziati...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Forceps, Stainless steel #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS4976</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5</td>
<td>Tool</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS6760</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640 w/ L-Glutamin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
<td>10-040-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>12103c</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donor Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>JRH Biosciences</td>
<td>12449</td>
<td>Heat-inactivate by incubating in 56&deg;C waterbath for 30 minutes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco, Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin without EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Difco</td>
<td>MT 25-050-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uridine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>U3003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Fluoro-5' deoxyuridine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>F-8791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Harlan Bioproduct</td>
<td>BT-5025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Microscope and light source</td>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml polypropylene tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell culture dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning, Nunclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (scg)

Die überlegene Halsganglien (SCG) in Ratten sind klein, glänzend, mandelförmige Strukturen, die sympathischen Neuronen enthalten. Diese Neuronen liefern sympathischen Innervationen für die Kopf-Hals-Region, und sie stellen eine gut charakterisierte und relativ homogenen Bevölkerung (4). Sympathischen Neuronen sind abhängig von nerve growth factor (NGF) für das Überleben, Differenzierung und axonalen Wachstum und der weit verbreiteten Verfügbarkeit von NGF erleichtert, ihre Kultur und experimentelle Manipulation (2, 3, 6). Aus diesen Gründen haben kultivierten sympathischen Neuronen in einer Vielzahl von Studien, einschließlich der neuronalen Entwicklung und Differenzierung, die Mechanismen des programmierten und pathologischen Zelltod und Signaltransduktion (1, 2, 5 und 6) verwendet worden. Dissecting die SCG von neugeborenen Ratten und Kultivierung sympathischen Neuronen ist nicht sehr kompliziert und kann ziemlich schnell gemeistert werden. In diesem Artikel werden wir im Detail beschreiben, wie Sie sezieren die SCG von neugeborenen Ratten Welpen und sie zu nutzen, um Kulturen von sympathischen Neuronen zu etablieren. Der Artikel beschreibt auch die vorbereitenden Schritte und die verschiedenen Reagenzien und Geräte, die benötigt wird, um dies zu erreichen sind.

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Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

Dies ist ein Protokoll beschreibt, wie zu isolieren und Kultur primären sympathischen Neuronen aus überlegen Halsganglien (SCG) der neugeborenen Ratte Welpen.

Protokoll zur Kultivierung sympathischen Neuronen aus Ratten-Superior Halsganglien (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

22.6K Aufrufe.  Columbia University. Dies ist ein Protokoll beschreibt, wie zu isolieren und Kultur primären sympathischen Neuronen aus überlegen Halsganglien (SCG) der neugeborenen Ratte Welpen.

Serie: Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Forschung

Biologie

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Neutrophile Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

An Introduction to Worm Lab: von Kultivierung Worms zu Mutagenese

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP binds to vasopressin V2 receptors (V2R) on the surface of the cells and thereby induces synthesis of cAMP. This stimulates cellular signaling processes leading to changes in the phosphorylation of the water channel aquaporin-2 (AQP2). Protein kinase A phoshorylates AQP2 and thereby triggers the translocation of AQP2 from intracellular vesicles into the plasma membrane facilitating water reabsorption from primary urine. Aberrations of AVP release from the pituitary or AVP-activated signaling in principal cells can cause central or nephrogenic diabetes insipidus, respectively; an elevated blood plasma AVP level is associated with cardiovascular diseases such as chronic heart failure and the syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion.
Here, we present a protocol for cultivation of primary rat inner medullary collecting duct (IMCD) cells, which express V2R and AQP2 endogenously. The cells are suitable for elucidating molecular mechanisms underlying the control of AQP2 and thus to discover novel drug targets for the treatment of diseases associated with dysregulation of AVP-mediated water reabsorption. IMCD cells are obtained from rat renal inner medullae and are used for experiments six to eight days after seeding. IMCD cells can be cultured in regular cell culture dishes, flasks and micro-titer plates of different formats, the procedure only requires a few hours, and is appropriate for standard cell culture laboratories.

Arginine-vasopressin (AVP) controls fine-tuning of body water homeostasis through facilitating water reabsorption by renal principal cells. Here, we present a protocol for the cultivation of primary rat inner medullary collecting duct cells suitable for the elucidation of molecular mechanisms underlying AVP-mediated water reabsorption.

Kultivierung primären Ratten Inner Medulläre Sammelkanal Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Blutprobenentnahme aus der laterale Schwanzvene der Ratte

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle biopsies are often collected for these endeavors. However, relatively few technical descriptions of biopsy procedures, outside of the commonly used musculus vastus lateralis, are available. Although the biopsy techniques are often adjusted to accommodate the characteristics of each muscle under study, few technical reports share these changes to the greater community. Thus, muscle tissue from human participants is often wasted as the operator reinvents the wheel. Expanding the available material on biopsies from a variety of muscles can reduce the incident of failed biopsies. This technical report describes a variation of the modified Bergstr&#246;m technique on the musculus tibialis anterior that limits fiber damage and provides fiber lengths adequate for mechanical evaluation. The surgery is an outpatient procedure that can be completed in an hour. The recovery period for this procedure is immediate for light activity (i.e., walking), up to three days for the resumption of normal physical activity, and about one week for wound care. The extracted tissue can be used for mechanical force experiments and here we present representative activation data. This protocol is appropriate for most collection purposes, potentially adaptable to other skeletal muscles, and may be improved by modifications to the collection needle.

This technical report describes a variation of the modified Bergstr&#246;m technique for the biopsy of the musculus tibialis anterior that limits fiber damage.

Sammlung von Skelettmuskelbiopsien aus dem Superior-Fach des menschlichen Musculus Tibialis Anterior für mechanische Bewertung

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...