Bioluminiscencia de imágenes de hemo oxigenasa-1 Upregulation en el procedimiento de Gua Sha

Resumen

Gua Sha, tradicional raspado de piel chino terapéutico, las causas subcutánea extravasación de sangre microvascular. Se presenta un protocolo de imágenes de bioluminiscencia de HO-1- Luciferasa Ratones transgénicos para demostrar que Gua Sha upregulates hemo oxigenasa-1 (HO-1) en múltiples órganos.

Resumen

Gua Sha es una terapia tradicional popular chino que emplea raspado de la piel a causa subcutánea extravasación microvascular y contusiones. El protocolo para obtener imágenes de bioluminiscencia óptico de HO-1-

Protocolo

1. Mujer HO-1-luciferasa ratones transgénicos (edad de 4-6 semanas) se pueden comprar de Taconic Farms, Inc. A su llegada, los ratones se colocan en un centro de alojamiento de los animales durante al menos 4 días para permitir el alojamiento.
2. Preparación para obtener imágenes de bioluminiscencia:
   1. Pese cada ratón HO-1. Peso de los animales es necesaria para calcular la dosis de la luciferina.
   2. La eliminación del vello: Utilice un algodón para aplicar el removedor de pelo Nair ® sobre el abdomen y / o en la espalda del animal. Espera de 5 a 10 segundos. Utilice un algodón limpio para limpiar el pelo. Sumerja un pedazo de tejido en agua destilada para limpiar el cabello limpio restantes.
   3. Coloque un papel negro no fluorescente (Strathmore Artagain ® de papel negro) en la plataforma de imágenes de una estación de IVIS 100 para reducir el ruido de fondo.
   4. Prepare luciferina (de Xenogen Corporation) solución a una concentración de 7,5 mg / ml (disuelto en agua estéril H ₂ O). La dosis de luciferina es 65.5 mg / kg de peso corporal. Por lo tanto, un ratón de 20 gramos requiere la inyección intraperitoneal de 0,175 ml de solución de luciferina. Para lograr esto, el volumen de inyección única de solución de luciferina (0.175ml) está precargado con una jeringa con una aguja de calibre 26
3. Gua Sha procedimiento: Gua Sha se aplica sólo una vez antes de ejecutar el protocolo de imágenes de bioluminiscencia. Desde Gua Sha no es doloroso, el ratón sólo tiene que ser breve anestesiados por isoflurano a mantener la calma. Gua Sha procedimiento incluye los siguientes pasos:
   1. Aplicar aceite de cocina o agua destilada para lubricar las áreas de piel blanco de Gua Sha un par de veces durante el procedimiento de Gua Sha.
   2. Repetitiva raspar la zona libre de vello de la espalda del ratón en la fuerza suave pero firme con una cuchara de sopa de cerámica o una cuchara de plástico.
   3. El raspado continúa hasta que la piel de la espalda se vuelve rojo, que es un signo de la extravasación de sangre por vía subcutánea, alcanza generalmente dentro de 2 a 3 minutos.
4. Imágenes de bioluminiscencia se puede iniciar inmediatamente o varias horas después de Gua Sha como HO-1 upregulation se construye poco a poco más de un par de horas. El procedimiento para obtener imágenes de bioluminiscencia es la siguiente:
   1. Anestesiar el ratón en una cámara de inducción de la anestesia llena con una mezcla de aire grado isoflurano (1,5%) y médicos.
   2. Una vez que el ratón está anestesiado, mueva el ratón a la cámara de imágenes en la estación de IVIS 100 imágenes ópticas. Coloque el ratón en una posición supina (abdomen hacia arriba). La cámara de imágenes continuamente infundido con un 1,5% de isoflurano. La plataforma de imágenes se calienta a 37 ° C para mantener el ratón caliente.
   3. Establecer la adquisición de imágenes en el "binning medio" y el tiempo de ajustar la exposición a 30 segundos. Comienzan a adquirir las imágenes. Configurar el equipo para repetir la adquisición de imágenes cada tres minutos, ya sea manual o automática. Después de la adquisición de la primera imagen, una región de interés (ROI) se dibuja para cubrir el pecho del abdomen, y la zona de la cabeza. Este retorno de la inversión se copia y se pega a las siguientes imágenes con "imagen viva ®", el software que acompaña a la estación de IVIS 100.
   4. Intensidad de la señal se mide en forma de fotones por segundo. El tiempo marca la intensidad de la señal para llegar a su valor máximo y mantener en la imagen del ratón durante unos 5 a 10 minutos después de la hora pico.
   5. Cuando la adquisición de imágenes en la posición supina se hace, dar la vuelta el ratón por encima y ponerla en la posición prona (copia de seguridad). Continuar imagen del animal de 5 a 10 minutos con el retorno de la inversión ya elaborado para cubrir la espalda y la zona de la cabeza en el uso de la "imagen viva ®". La elección de la imagen de la posición boca abajo después de la posición supina es arbitraria. Se puede optar por comenzar con la posición boca abajo, en función de los órganos principales de interés. Otra opción es la imagen de la posición decúbito supino y prono en experimentos separados.
   6. Cuando la adquisición de imágenes en la posición prona se termine, apague el isoflurano y el movimiento del ratón de la cámara de imágenes de la cámara de inducción para recuperarse. La cámara de inducción está impregnada de aire medicinal y sólo el ratón por lo general se despierta en menos de un minuto.
   7. Guardar datos de imágenes para el procesamiento posterior.
   8. Tras el estudio de imagen inicial, adquisiciones adicionales de imágenes se llevan a cabo durante varios días después de Gua Sha. Un programa de muestreo de imagen se repite en la 12 ^ª hora, 24 ^ª hora, 36 ^ª hora, 48 ^ª hora, 72 horas ^ª y 120 ^ª hora, pero el momento exacto de la programación de imágenes es flexible. Sesiones adicionales de imágenes se pueden agregar si un seguimiento más largo es necesario. Antes de imágenes, repita el procedimiento de eliminación de pelo si el pelo se ha vuelto a crecer.
5. Para el grupo control, repetir todo el procedimiento, pero vaya Gua Sha (paso 3). Si el mismo grupo de ratones se utiliza para el control y Gua Sha, la exp de controleriment debe llevarse a cabo preferentemente antes del procedimiento Gua Sha o por lo menos un mes después.

Los resultados representativos:

Las imágenes de bioluminiscencia en la figura 1 muestra en vivo de la regulación al alza de HO-1 en respuesta a Gua Sha. El gráfico de la figura 2 se muestra la evolución cuantitativa temporal de más de 120 horas de flujo óptico (fotones / seg) de todo el cuerpo del ratón es el mismo en relación con Gua Sha ...

Figura 1. De izquierda a derecha las imágenes, representante de la vista frontal (decúbito supino) del mismo ratón antes de Gua Sha, a las 18 horas, 36 horas y 120 horas después de Gua Sha, respectivamente. Después de Gua Sha, se observa el progreso del aumento significativo de la intensidad de la señal en múltiples órganos que abarcan las regiones del tracto gastrointestinal, el tracto genital, el hígado, los riñones (desde la vista atrás, no se muestra), y otros.

Figura 2. Cambio cuantitativo de flujo (fotones / seg) de todo el cuerpo un seguimiento de más de 120 horas después de Gua Sha en el mismo ratón de la figura 1.

Discusión

Transcripción de la HO-1, una forma inducible de la hemo oxigenasa, es aumentada por muchos factores, incluyendo hemo, el peróxido de hidrógeno, la radiación UV, la hipoxia y el estrés físico. Imágenes de cuerpo entero, como el reportado HO-1 protocolo de bioluminiscencia proporciona un panorama general de la sistémica HO-1 de expresión en múltiples órganos. En pequeños animales, imágenes de bioluminiscencia que permite una alta sensibilidad in vivo cuantitativa en tiempo real la evaluación longitudinal ó...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luciferin	Caliper Life Sciences	P/N 122796	Previously Xenogen
IVIS 100	Caliper Life Sciences		Previously Xenogen