Imaging bioluminescenza di eme ossigenasi-1 sovraregolazione alla Procedura di Gua Sha

Riepilogo

Gua Sha, raschiamento tradizionale cinese pelle terapeutiche, provoca stravaso di sangue sottocutaneo microvascolare. Riportiamo un protocollo di imaging bioluminescenza di HO-1- Luciferasi Topi transgenici per dimostrare che Gua Sha sovraregolazione eme ossigenasi-1 (HO-1) in molti organi.

Abstract

Gua Sha è una terapia tradizionale popolare cinese che impiega la pelle raschiando a causa microvascolare sottocutaneo stravaso di sangue e lividi. Il protocollo per bioluminescenti imaging ottico di HO-1-

Protocollo

1. Femmina topi transgenici HO-1-luciferasi (età di 4-6 settimane) possono essere acquistati presso Taconic Farms, Inc. All'arrivo, i topi sono collocati in una struttura di stabulazione degli animali per almeno 4 giorni per consentire alloggio.
2. Preparazione per l'imaging bioluminescenza:
   1. Pesare ogni HO-1 del mouse. Peso dell'animale è necessario per calcolare il dosaggio di luciferina.
   2. Depilazione: usare uno swap di cotone per applicare i capelli rimozione Nair ® sopra l'addome e / o posteriore dell'animale. In attesa di 5 a 10 secondi. Utilizzare uno scambio di cotone pulito per togliere i capelli. Immergere un pezzo di tessuto in acqua distillata per pulire i capelli rimanenti.
   3. Posizionare un non-fluorescente carta nera (Strathmore Artagain ® carta nera) sulla piattaforma di imaging di una stazione 100 IVIS per ridurre il rumore di fondo.
   4. Preparare luciferina (da Xenogen Corporation) soluzione a concentrazione di 7,5 mg / ml (sciolto in sterili H ₂ O). La dose di luciferina è 65,5 mg / kg di peso corporeo. Così, a 20 grammi del mouse richiede l'iniezione intraperitoneale di 0,175 ml di soluzione luciferina. Per raggiungere questo obiettivo, un volume singola iniezione di luciferina soluzione (0.175ml) è precaricata ad una siringa con una 26-gauge
3. Gua Sha procedura: Gua Sha viene applicata una sola volta prima di eseguire il protocollo di imaging bioluminescenza. Dal Gua Sha non è doloroso, il mouse ha solo bisogno di essere brevemente anestetizzati da isoflurano di mantenere la calma. Gua Sha procedura prevede le seguenti fasi:
   1. Applicare l'olio da cucina o acqua distillata per lubrificare le zone della pelle bersaglio Gua Sha un paio di volte durante la procedura di Gua Sha.
   2. Ripetutamente raschiare i capelli regione libera della parte posteriore del mouse in vigore gentile ma fermo con un cucchiaio di ceramica zuppa o un cucchiaio di plastica.
   3. La raschiatura continua fino a quando la pelle diventa rossa posteriore, che è un segno di stravaso di sangue sottocutaneo, solitamente raggiunta entro 2 o 3 minuti.
4. Di imaging bioluminescenza può essere iniziato immediatamente o dopo molte ore Gua Sha come HO-1 upregulation è costruita lentamente nel corso di poche ore. La procedura per l'imaging bioluminescenza è:
   1. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione dell'anestesia riempito con una miscela di aria isoflurano grado (1,5%) e medici.
   2. Una volta che il mouse è anestetizzato, spostare il mouse alla camera di imaging sulla stazione 100 IVIS di imaging ottico. Posizionare il mouse in posizione supina (ventre in su). La camera di imaging è continuamente infuso con 1,5% di isoflurano. La piattaforma di imaging viene riscaldato a 37 ° C per mantenere caldo il mouse.
   3. Impostare l'acquisizione di immagini a "binning medio" e tempo di esposizione impostato a 30 secondi. Avvio di acquisire le immagini. Impostare la macchina di ripetere l'acquisizione di immagini ogni tre minuti, manualmente o automaticamente. Dopo l'acquisizione della prima immagine, una regione di interesse (ROI) è disegnato per coprire le addominali, al torace, e la zona della testa. Questo ROI è poi copiato e incollato le seguenti immagini con "Living Immagine ®", il software che accompagna il IVIS 100 destinazione.
   4. Intensità del segnale viene misurata in fotoni al secondo. Tempo di Marco per l'intensità del segnale per raggiungere il suo valore di picco e continuare a immagini con il mouse per circa 5 a 10 minuti dopo l'ora di punta.
   5. Quando l'acquisizione di immagini in posizione supina è fatto, capovolgere il mouse e adagiarla in posizione prona (backup). Continua l'imaging l'animale per 5 o 10 minuti con il ROI ora disegnato per coprire la schiena e la zona della testa nell'uso dell '"immagine vivente ®" del software. La scelta di imaging posizione prona dopo la posizione supina è arbitraria. Si può scegliere di iniziare con la posizione prona, a seconda degli organi primari di interesse. Un'altra opzione è quella di immagine posizioni supina e prona ad esperimenti separati.
   6. Quando l'acquisizione di immagini in posizione prona è terminato, spegnere isoflurano e spostare il mouse dalla camera di imaging per la camera di induzione per recuperare. La camera di induzione è infuso con aria medicale e solo il mouse si sveglia di solito in meno di un minuto.
   7. Salvare i dati di imaging per la post-elaborazione.
   8. Dopo lo studio di imaging iniziale, le acquisizioni di immagini aggiuntive vengono effettuate per diversi giorni dopo Gua Sha. Un programma campione si ripete l'imaging nell'ora 12 ^°, 24 ^° ora, 36 ore ^°, 48 ^° ora, 72 ore e 120 ore ^{° °} ma i tempi esatti del programma di imaging è flessibile. Sessioni di imaging addizionali possono essere aggiunti se un lungo follow-up è necessario. Prima di imaging, ripetere la procedura di rimozione dei capelli se i capelli sono ricresciuti.
5. Per il gruppo di controllo, ripetere tutte le procedure ma saltare Gua Sha (fase 3). Se lo stesso gruppo di topi è utilizzato sia per il controllo e Gua Sha, l'exp controlloeriment deve essere effettuato preferibilmente prima della procedura di Gua sha o almeno un mese dopo.

Rappresentante dei risultati:

Le immagini bioluminescenza in figura 1 mostra a sovraregolazione vivo di HO-1 in risposta a Gua Sha. Il grafico in Figura 2 mostra la variazione quantitativa temporale oltre 120 ore in flusso ottico (fotoni / sec) dal corpo del mouse stesso relative a Gua Sha ...

Figura 1. Da sinistra a destra, immagini rappresentative della vista frontale (supina) del mouse stesso prima di Gua Sha, a 18 ore, 36 ore e 120 ore dopo Gua Sha, rispettivamente. Dopo Gua Sha, si osserva l'andamento del significativo aumento dell'intensità del segnale di organi diversi che comprendono le regioni del tratto gastrointestinale, del tratto genitale, il fegato, i reni (dal punto di vista posteriore, non mostrato), e altri. Si prega di cliccare qui per una versione più grande della figura 1.

Figura 2. Modifica quantitativa del flusso (fotoni / sec) dal corpo intero tracciato di oltre 120 ore successive Gua Sha nel topo lo stesso della Figura 1. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.

Discussione

Trascrizione di HO-1, una forma inducibile di eme ossigenasi, è upregulated da molti fattori tra cui l'eme, perossido di idrogeno, l'irradiazione UV, ipossia e stress fisici. Immagini del corpo intero come il riferito HO-1 protocollo bioluminescenza fornisce un'istantanea delle sistemica HO-1 espressione di organi multipli. Nei piccoli animali, imaging bioluminescenza permette ad alta sensibilità in vivo quantitativa in tempo reale valutazione longitudinale ottica di alterazioni nell'espressione genica...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luciferin	Caliper Life Sciences	P/N 122796	Previously Xenogen
IVIS 100	Caliper Life Sciences		Previously Xenogen