규아 샤 프로 시저에 헴 Oxygenase - 1 Upregulation의 Bioluminescence 이미징

요약

규아 샤, 중국어 번체 치료 피부 스크레이핑은 피하 microvascular 혈액 넘쳐 흐름을 발생합니다. 우리의 bioluminescence 이미징의 프로토콜보고 HO - 1 - 루시페라제 유전자 변형 생쥐 oxygenase - 1 여러 장기 (HO - 1).

초록

규아 샤는 피하 microvascular 혈액 넘쳐 흐름과 타박상을 일으킬 힘든 피부를 고용하고 중국의 전통 민속 요법입니다. 의 발광 생물 광학 이미징을위한 프로토콜 HO - 1 -

프로토콜

1. 여성 HO - 1 - 루시페라제 유전자 변형 생쥐 (4-6 주 세)가 도착되면, 주식 타코닉 팜에서 구입할 수 있으며, 생쥐는 숙박 시설을 허용하는 최소 4 일 동안 동물의 주택 시설에 배치됩니다.
2. bioluminescence 이미징을위한 준비 :
   1. 각 HO - 1 마우스의 무게를. 동물의 무게 luciferin의 복용량을 계산이 필요합니다.
   2. 제모 : 또는 다시 동물의 복부 및 /여 머리 제거제 나이르 ®를 적용하는 면으로 스왑을 사용합니다. 5-10초 기다 리면서. 머리를 닦아으로 깨끗한 면봉 스왑을 사용합니다. 깨끗한 남은 머리를 닦아 증류수에 조직의 한 조각을 찍어.
   3. 배경 잡음을 줄이기 위해 IVIS 100 역의 이미징 플랫폼 이외의 형광 검은 종이 (스트라 스 모어 Artagain ® 검은 종이)를 놓으십시오.
   4. luciferin (Xenogen 회사에서) 7.5 MG / ML (멸균 H ₂ O에 용해)의 농도에 솔루션을 준비합니다. luciferin의 복용은 65.5 밀리그램 / kg 체중이다. 따라서, 20g의 마우스 0.175 ML luciferin 솔루션의 intraperitoneal 주사를 필요로합니다. 이것을 달성하기 위해, luciferin 솔루션 (0.175ml)의 단일 사출 량은 26 게이지 바늘로 주사기에 미리입니다
3. 규아 샤 절차 : 규아 샤는 bioluminescence 이미징 프로토콜을 실행하기 전에 한 번만 적용됩니다. 규아 샤는 통증이 아니므로, 마우스는 진정 isoflurane으로 간단히 anesthetized해야합니다. 규아 샤 절차는 다음 단계를 포함 :
   1. 규아 샤 절차 중 규아 샤에 의해 몇 시간을 목표로 피부 부분에 기름칠을하는 요리 기름이나 증류수를 적용합니다.
   2. 반복 세라믹 수프 스푼이나 플라스틱 숟가락을 사용하여 부드러운하지만 회사 강제에서 마우스 뒤쪽의 머리카락이없는 지역을 다쳤어요.
   3. 다시 피부가 빨간색 때까지​​ 힘든 계속, 어떤은 일반적으로 2-3분 이내에 달성 피하 혈액 넘쳐 흐름의 표시입니다.
4. HO - 1 upregulation은 몇 시간에 걸쳐 천천히 쌓아이므로 Bioluminescence 이미징은 규아 샤 후 즉시 또는 몇 시간이 시작될 수 있습니다. bioluminescence 이미징을위한 절차는 다음과 같습니다
   1. isoflurane (1.5 %) 및 ​​의료 등급 공기의 혼합물로 채워진 마취 유도 챔버에 마우스를 마취.
   2. 마우스 anesthetized되면​​, IVIS 100 광학 이미징 역에서 이미징 챔버 마우스를 이동합니다. 나태한 자세 (최대 복부)에 마우스를 위치. 이미징 챔버가 계속 isoflurane의 1.5 %로 들어갈 수 있습니다. 이미징 플랫폼은 37 가열 ° C에서 마우스 보온 수 있습니다.
   3. "중간 비닝 '에서 이미지 수집 30 초 설정 노출 시간을 설정합니다. 이미지를 얻기 시작합니다. 수동 또는 자동으로 이미지 획득 매일 3 분 반복하는 기계를 설정합니다. 첫 번째 이미지의 취득 후, 관심 (ROI)의 지역은 복부, 가슴 및 머리 영역을 커버하기 위해 그려진 것입니다. 이것은 투자 수익 (ROI)은 다음 복사와 "생활 이미지 ®"IVIS 100 스테이션을 함께 소프트웨어를 사용하여 다음과 같은 이미지에 붙여넣을 수 있습니다.
   4. 신호 강도는 초당 광자 단위로 측정됩니다. 마크 시간은 신호 강도에 대한 최대 가치를 도달하고 최고 시간 이후 약 5-10분위한 이미징 마우스 계속.
   5. 부정사 위치에 이미지 인수가 완료되면, 마우스를 뒤집과 발생하기 쉬운 위치 (백업)의 그것을 믿는다. 이제 소프트웨어 "생활 이미지 ®"의 사용에 다시하고 머리 영역을 커버하기 위해 그린 투자 수익 (ROI)과 5-10분위한 이미징 동물을 계속합니다. 이미지의 선택은 나태한 자세 후 쓰러진 자세는 임의입니다. 하나는 관심의 주요 장기에 따라 발생하기 쉬운 위치로 시작하도록 선택할 수 있습니다. 또 다른 옵션은 이미지를 별도의 실험에서 부정사와 발생하기 쉬운 위치를하는 것입니다.
   6. 쓰러진 자세에서 이미징 인수가 완료되면, isoflurane 끄고 복구 유도 실로 이미징 챔버에서 마우스를 이동합니다. 유도 챔버는 현재 의료에만 공기와 마우스는 보통 미만 분 깨어나서 함께 들어갈 수 있습니다.
   7. 후처리에 대한 영상 자료를 저장합니다.
   8. 초기 이미징 연구 이후, 추가 영상 인수는 규아 샤 후 몇 일 동안 실시됩니다. 하나의 샘플 일정은 12 ^{일 시간,} 24 ^번째 시간, 36 ^번째 시간, 48 ^번째 시간, 72 ^차 시간 120 ^{일 시간에} 영상을 반복하지만 이미징 일정의 정확한 타이밍은 유연성입니다. 더 이상 후속이 필요한 경우 추가 이미지 세션 추가할 수 있습니다. 이미징 전에 머리를 다시 성장이있다면 절차를 제거하는 머리를 반복합니다.
5. 컨트롤 그룹에 대한 모든 절차를 반복하지만 규아 샤 (3 단계)를 건너 뛰십시오. 생쥐 같은 그룹은 제어와 규아 샤, 제어 EXP 모두 사용하는 경우eriment는 한 달쯤 후에 규아 샤 절차 전에 선호 수행하거나해야합니다.

대표 결과 :

규아 샤에 대응 HO - 1의 생체내 upregulation 그림의 bioluminescence 이미지 1 보여줍니다. 그림 2의 그래프는 규아 샤와 관련된 동일한 마우스의 몸 전체에서 광학 흐름 (광자 / 초) 120 시간 이상의 양적 시간적 변화를 보여주는 ...

그림 1. 왼쪽부터 각각 18시간 36 시간 1백20시간 게시 규아 샤에서 규아 샤 전에 같은 마우스의 전면보기 (부정사)의 권리, 대표 이미지, 있습니다. 규아 샤 후, 하나는 위장관, 성기 트랙트, 간, 신장 (뒷면보기에서 표시되지 않습니다), 그리고 다른 사람의 영역을 포괄 여러 장기에 상당한 신호 강도 증가의 진행 상황을 관찰. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 위해.

그림 2. 그림 1 같은 마우스 규아 샤에 따라 120시간 이상 추적 몸 전체에서 자속의 양적 변화 (광자 / 초). 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

토론

HO - 1, 헴 oxygenase의 inducible 양식의 전사는 헴, 과산화수소, UV 조사, hypoxia, 물리적 스트레스 등 많은 요인에 의해 upregulated 있습니다. 이러한 보고된 HO - 1 bioluminescence 프로토콜로 온몸의 화상은 여러 장기에서 체계적 HO - 1 표현의 빠른 스냅샷을 제공합니다. 작은 동물에서, bioluminescence 이미징은 높은 감도에 - 생체내 유전자 발현 체계의 변경을 실시간으로 양적 세로 광학 평가, 그림과 같이 있습니?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luciferin	Caliper Life Sciences	P/N 122796	Previously Xenogen
IVIS 100	Caliper Life Sciences		Previously Xenogen