LAD-Ligadura: un modelo murino de infarto de miocardio

Resumen

Este video muestra cómo utilizar un modelo rápido y fiable para estudiar los procesos patobiológicas y fisiopatológicos de la isquemia miocárdica.

Resumen

Modelos de investigación de infarto e isquemia miocárdica son esenciales para investigar los procesos agudos y crónicos patobiológicas y fisiopatológicas de la isquemia miocárdica y para desarrollar y optimizar el tratamiento futuro.

Dos métodos diferentes de la creación de la isquemia miocárdica se llevan a cabo en roedores de laboratorio. El primer método es la creación de crio infarto, una técnica rápida pero inexacta, y un crio-pluma se aplica en la superficie del corazón (1-3). Usando este método, el científico no puede garantizar que la crio-cicatriz lleva a la isquemia, también un gran daño miocárdico se crea que muestra los efectos fisiopatológicos secundarios que no están relacionadas con el infarto de miocardio. El segundo método es la ligadura permanente de la arteria descendente anterior izquierda (LAD). Aquí la DA se liga con un solo punto, formando una isquemia que se puede ver casi de inmediato. Al cierre de la DA, no hay flujo de sangre adicional es permitida en esa zona, mientras que el tejido circundante de miocardio no es casi afectada. Este procedimiento quirúrgico imita los aspectos fisiopatológicos y patobiológicas ocurre en el infarto relacionado con la isquemia miocárdica.

El método presentado en este vídeo se muestra el procedimiento quirúrgico de un modelo de infarto de ratón por la ligadura de la DA. Este modelo es conveniente para los estudios de patobiológicas y fisiopatológicos, así como inmunobiológicos en el infarto de miocardio. La técnica que se muestra ofrece una alta precisión y se correlaciona bien con los cortes histológicos.

Protocolo

Ratones Balb / c con un peso mínimo de 20g a la edad de 8 a 12 semanas son adquiridos de Charles River (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld).
Los ratones se encuentran en condiciones convencionales, alimentados pellets ratón estándar y agua ad libitum. Anestesiar a ratones con isoflurano (2%) con una cámara de inducción.

1. Afeitarse el área del cuello y la parte izquierda de la caja torácica y desinfectar con etanol al 80%.
2. Coloque el ratón sobre la espalda y colocar una máscara sobre su nariz y la boca para mantener la anestesia.
3. Comprobar los reflejos pellizcar la cola y las patas traseras para asegurarse de que el ratón es suficiente anestesiado.
4. Bajo visión microscópica realizar una incisión cervical que separa la piel, músculo y tejido que cubre la tráquea.
5. Cuando la tráquea se expone un agujero pequeño en el tejido entre los dos anillos de cartucho debajo de la glotis para insertar el tubo endotraqueal (Figura 1). Inserte el tubo endotraqueal la celebración de la parte craneal de la tráquea utilizando micro forecepts quirúrgica. Comprobar el movimiento torácico para asegurarse de que ambos pulmones están bien ventiladas.
6. La frecuencia respiratoria (RR) debe ser de aproximadamente 110 por minuto, con una presión inspiratoria de 17 a 18 cm H ₂ O. Ponga el ratón con cuidado, sobre su lado derecho, frente a su lado izquierdo. Realizar una toracotomía leftsided entre la 3 ^ª y la 4 ^ª costilla, y disecar el tejido y el músculo con cuidado, usando una Cauter para prevenir el sangrado.
7. Abrir el tórax con cuidado, una vez que el tórax se abre, busca el corazón, sin tocar el pulmón con un objeto afilado. Ahora quite la parte del saco pericárdico, que cubre el corazón.
8. La DA se encuentra entre la arteria pulmonar y la aurícula izquierda. Utilice una sutura de prolene 8-0 (Ethicon, Norderstedt, Alemania) para ligar la DA proximal con una sutura simple (Figura 2).
9. Colocar un tubo torácico (catéter 28G, venal), entre ^los días 4 y ⁵ de la costilla.
10. Cerrar la incisión torácica en capas, con 6-0 suturas de Prolene en ejecución (Ethicon, Norderstedt, Alemania) para adaptar las costillas y las suturas de Prolene 4-0 en ejecución (Ethicon, Norderstedt, Alemania) para cerrar la piel.
11. De drenaje en el tórax con la ayuda de una jeringa de 2 ml con cuidado (Figura 3). Coloque el ratón sobre la espalda. Ahora toma el tubo endotraqueal y adaptar los anillos traqueales cartucho con un solo punto con 7-0 suturas de prolene (Ethicon, Norderstedt, Alemania).
12. Coloque la mascarilla sobre el ratón y cerca de la piel con Prolene 4-0 sutura continua (Ethicon, Norderstedt, Alemania).

Validación

Existen diferentes posibilidades para confirmar el éxito de la DA-ligadura.

La prueba de troponina se puede realizar 6 a 18 horas después de la cirugía, con sólo 150 litros de sangre sin necesidad de sacrificar al animal. La sangre se aplica a un kit de prueba de troponina personalizado (TROP T sensibles, Roche, Mannheim) (Figura 4). La troponina es una proteína reguladora de los filamentos de actina de las células musculares, hay diferentes isotipos de los tres tipos de músculos. La cTnI y cTnT isotipos se encuentran en el corazón y se liberan en la lesión tisular. La prueba estándar para la troponina T (cTnT) se basa en dos el corazón de anticuerpos monoclonales específicos, una trampa de la troponina en la muestra de sangre, el segundo es un marcador.

El área infartada se pueden identificar macroscópicamente después de 3 días (Figura 5).

TTC (2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro) tinción de la viabilidad del tejido medidas utilizadas para evaluar el tamaño del infarto. Colorante azul de Evans (1,5%, 1,0 ml) en tampón fosfato salino (PBS) se inyecta en la cavidad del ventrículo izquierdo para medir el área de isquemia miocárdica. El ratón es la eutanasia y el corazón se cosecha y se seccionaron en rodajas. Los cortes de tejido se incuban en el TTC 1% solución de PBS, pH 7,4 a 37 ° C durante 20 minutos. Los tejidos se fijan en el 10% PBS-formalina tamponada noche a la mañana a 2-8 º C. TTC se administra ex vivo para teñir de azul de Evans-negativos áreas (Figura 6).

Para el estudio histológico del ratón tiene que ser sacrificado, y el corazón tiene que ser incorporados para su posterior procesamiento. Después de realizar los cortes de parafina, los portaobjetos se tiñeron con H & E (hematoxilina y eosina) o tricrómica para visualizar el tejido fibroso (Figura 7).

Figura 1: tubo traqueal.
1A: Expuesta la traquea, después de la incisión cervical ventral.
1B: tráquea se abre dos anillos cartilaginosos caudal de la laringe.
1C: tubo traqueal se inserta en la tráquea.

Figura 2: El corazón se expone a través de una toracotomía izquierda lado, la DA se liga.

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Figura 3: Después de que el tórax se cierra, un drenaje pleural se realiza. El ratón está todavía bajo la anestesia.

Figura 4: Aparecen dos líneas después de unos minutos cuando el test de troponina es positiva.

Figura 5: Muestra el corazón explantado.
5A: Vista macroscópica del corazón con la zona isquémica con un color más pálido blanquecino.
5B: La sección transversal del corazón infartado, el área isquémica se muestra en la esquina superior derecha.

Discusión

En resumen, este video visualiza el modelo LAD-ligadura de paso a paso e identifica LAD-ligaduras en los ratones como los procedimientos quirúrgicos fácilmente factible.