LAD-קשירת: מודל Murine של אוטם שריר הלב

Summary

וידאו זה מדגים כיצד להשתמש במודל מהיר ואמין ללמוד תהליכים pathobiological ו pathophysiological של שריר הלב.

Abstract

מודלים מחקר של אוטם שריר הלב ואת חיוניים כדי לחקור את התהליכים pathobiological ו pathophysiological אקוטי וכרוני איסכמיה של שריר הלב כדי לפתח לייעל את הטיפול בעתיד.

שתי שיטות שונות של יצירת איסכמיה בשריר הלב מבוצעות מכרסמים במעבדה. השיטה הראשונה היא ליצור cryo אוטם, טכניקה מהיר אבל לא מדויק, שם cryo-עט מוחל על פני השטח של הלב (1-3). באמצעות שיטה זו המדען אינו יכול להבטיח כי cryo-צלקת מוביל איסכמיה, גם פגיעה בשריר הלב העצום שנוצר המציג תופעות לוואי pathophysiological כי אינם קשורים לאוטם שריר הלב. השיטה השנייה היא קשירת קבועה של העורק השמאלי הקדמי היורד (LAD). כאן הנער הוא ligated עם תפר אחד, להרכיב איסכמיה כי ניתן לראות באופן כמעט מיידי. על ידי סגירת LAD, אין זרימת דם נוספת מותרת באזור זה, תוך רקמת שריר הלב שמסביב הוא כמעט לא השפיע. זה הליך כירורגי מחקה את ההיבטים pathobiological ו pathophysiological המתרחשים איסכמיה, אוטם שריר הלב קשור.

השיטה הציג סרטון זה מדגים את הליך כירורגי של מודל אוטם העכבר על ידי ligating LAD. דגם זה נוח ללימודי pathobiological ו pathophysiological וכן immunobiological על אוטם לבבי. הטכניקה המוצגת מספקת דיוק גבוהה וקושרת היטב עם סעיפים היסטולוגית.

Protocol

Balb / C עכברים במשקל מינימום של 20 גרם בגיל של 8 עד 12 שבועות נרכשים מ צ'ארלס ריבר (Sandhofer מאייתים 7, D-97633 Sulzfeld).
עכברים הם שוכנו בתנאים רגילים, נמאס כדורי תקן העכבר כרצונך מים. הרדימי עכבר עם isoflurane (2%) באמצעות תא אינדוקציה.

1. לגלח את אזור הצוואר בצד השמאלי של בית החזה ולחטא באמצעות אתנול 80%.
2. מניחים את העכבר על הגב שלה במקום facemask על האף והפה שלה כדי לשמור על הרדמה.
3. בדוק את הרפלקסים צובט את הזנב והרגליים האחוריות כדי להיות בטוח כי העכבר הוא anesthesized מספיק.
4. תחת נוף מיקרוסקופי לבצע חתך קו האמצע המפריד בין צוואר הרחם, עור, שרירים ורקמות מכסה את קנה הנשימה.
5. כאשר קנה הנשימה חשוף לחתוך חור קטן לתוך הרקמה בין שתי טבעות מחסנית מתחת מיתרי הקול להכניס את הצינור endotracheal (איור 1). הכנס את הצינור endotracheal מחזיק את החלק גולגולתי של קנה הנשימה באמצעות forecepts מיקרו כירורגי. בדוק את תנועת החזה כדי להיות בטוח כי הן הריאות הן מאוורר היטב.
6. קצב הנשימה (RR) צריך להיות כ 110 לדקה, עם לחץ inspiratory של 17 עד 18cm H ₂ O. הפעל את העכבר בזהירות, שוכב על צדו הימני, מול הצד השמאלי שלה. ביצוע פתיחת בית החזה leftsided בין ^ה -3 לבין צלע 4 ^ה, ו לנתח את רקמות השריר בקפידה, תוך שימוש cauter כדי למנוע דימום.
7. פתח את בית החזה בזהירות, פעם בית החזה נפתח, למצוא את הלב, בלי לגעת ריאות עם כל חפץ חד. עכשיו להסיר את החלק של שק קרום הלב כי הוא מכסה את הלב.
8. הנער נמצא בין עורק הריאה לבין אפרכסת שמאל. השתמש 8-0 Prolene תפר (Ethicon, Norderstedt, גרמניה) ולקשור LAD הפרוקסימלי עם תפר אחד (איור 2).
9. המקום צינור החזה (קטטר 28G, מושחתים), בין ^ה 4 ו 5 הצלעות ^ה.
10. סגירת החתך החזי בשכבות, באמצעות 6-0 תפרים ריצה Prolene (Ethicon, Norderstedt, גרמניה) על מנת להתאים את צלעות התפרים Prolene 4-0 ריצה (Ethicon, Norderstedt, גרמניה) כדי לסגור את העור.
11. מסננים את החזה בעזרת מזרק 2ml בקפידה (איור 3). הנח את העכבר על גבו. עכשיו לקחת את הצינור endotracheal החוצה להתאים את טבעות מחסנית קנה הנשימה עם תפר אחד באמצעות 7-0 תפרים Prolene (Ethicon, Norderstedt, גרמניה).
12. מניחים את המסכה על הפנים העכבר ולסגור את העור באמצעות Prolene 4-0 ריצה התפרים (Ethicon, Norderstedt, גרמניה).

תוקף

ישנן אפשרויות שונות כדי לאשר את ההצלחה של קשירת-LAD.

בדיקת טרופונין ניתן לבצע 6-18 שעות לאחר הניתוח, תוך שימוש רק 150 בדם אני ללא צורך להרדימו. הדם מוחל על ערכת בדיקה אישית טרופונין (TROP T רגיש, רוש, מנהיים) (איור 4). טרופונין הוא חלבון הוויסות של סיבי אקטין של תא השריר, יש isotypes שונות שלושה סוגים של שרירים. Isotypes cTnI ו cTnT נמצאים הלב משתחררים לפגיעה ברקמות. מבחן סטנדרטי עבור טרופונין T (cTnT) מבוססת על שני נוגדנים חד שבטיים לב ספציפית, אחת המלכודות טרופונין במדגם דם, והשני הוא סמן.

אזור infarcted ניתן לזהות macroscopically לאחר 3 ימים (איור 5).

TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium כלוריד) מודד מכתים הכדאיות רקמות השתמשו כדי להעריך גודל האוטם. אוונס צבע כחול (1.5%, 1.0mL) ב פוספט בופר סליין (PBS) מוזרק לתוך חלל החדר השמאלי כדי למדוד את שטח איסכמי לבבי. העכבר הוא מורדמים והלב הוא לקצור מחולק לפרוסות. פרוסות הרקמה מודגרת בתמיסה של 1% PBS TTC, pH 7.4 ב 37 מעלות 20min. רקמות שתוקנו ב 10% PBS שנאגרו פורמלין לילה בשעה 2-8 ° C. TTC מנוהל vivo לשעבר לצבוע אוונס כחול שלילי אזורים (איור 6).

עבור היסטולוגיה העכבר צריך להיות מורדמים והלב חייב להיות מוטבע לעיבוד נוסף. לאחר ביצוע סעיפים פרפין, מגלשות מגואלות H & E (hematoxylin ו eosin) או trichrome לדמיין רקמות fibrotic (איור 7).

איור 1: צינור לקנה הנשימה.
1A: חשופים קנה הנשימה, לאחר חתך צוואר הרחם הגחון.
1B: קנה הנשימה נפתח שתי טבעות סחוס הזנב אל הגרון.
1C: צינור לקנה הנשימה מוכנס לתוך קנה הנשימה.

איור 2: לב חשוף באמצעות פתיחת בית החזה השמאלי צדדית, הבחור הוא ligated.

t ">
איור 3: לאחר החזה סגור, ניקוז הצדר מבוצע. העכבר הוא עדיין מורדם.

איור 4: שני קווים להופיע אחרי כמה דקות כאשר הבדיקה טרופונין חיובית.

איור 5: מציג את הלב explanted.
5 א: לצפות מקרוסקופית של הלב עם אזור איסכמי עם צבע לבנבן דהוי.
5B: חתך של הלב infarcted, אזור איסכמי מראה בפינה הימנית העליונה.

Discussion

לסיכום, וידאו זה visualizes המודל LAD-קשירת צעד אחר צעד ומזהה LAD-ligations בעכברים כמו ניתוחים אפשרי בקלות.