Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

Resumen

Hemos desarrollado un programa de computadora para analizar la morfología neuronal. En combinación con dos herramientas existentes de código abierto de análisis, nuestro programa realiza análisis de Sholl y determina el número de neuritas, los puntos de ramificación, y consejos de las neuritas. Los análisis se realizan para que los cambios locales en la morfología de las neuritas se puede observar.

Resumen

Morfología neuronal desempeña un papel importante en la determinación de cómo las neuronas funcionar y comunicarse ^1-3. En concreto, afecta a la capacidad de las neuronas para recibir aportes de otras células ² y contribuye a la propagación de potenciales de acción ^4,5. La morfología de las neuritas también afecta a la información es procesada. La diversidad de morfologías dendríticas facilitar la señalización de rango local y de larga y permitir que las neuronas individuales o grupos de neuronas para llevar a cabo funciones especializadas dentro de la red neuronal ^6,7. Alteraciones en la morfología dendrítica, incluyendo la fragmentación de las dendritas y los cambios en los patrones de ramificación, se han observado en varios estados de la enfermedad, incluyendo la enfermedad de Alzheimer ^{8, 9,10} esquizofrenia y retraso mental ^11. La capacidad tanto de entender los factores que determinan morfologías dendríticas e identificar los cambios en la morfología de las dendritas es esencial en la comprensión de la función del sistema nervioso y la disfunción.

Morfología de las neuritas se analiza a menudo por el análisis de Sholl y contando el número de neuritas y el número de puntas de las ramas. Este análisis se aplica generalmente a las dendritas, pero también se puede aplicar a los axones. Realizar este análisis con la mano es a la vez mucho tiempo e inevitablemente introduce la variabilidad debida a la predisposición del experimentador y la incoherencia. El programa de la hoguera es un método semi-automatizado para el análisis de la dendrita y axón morfología que se basa en código abierto disponibles herramientas de análisis morfológico. Nuestro programa permite la detección de cambios locales en la dendrita y axón ramificaciones comportamientos mediante la realización de análisis de Sholl en las subregiones de la glorieta neuríticas. Por ejemplo, el análisis de Sholl se realiza en tanto la neurona en su conjunto, así como en cada subconjunto de procesos (primaria, secundaria, terminal, raíces, etc) y los patrones Dendrite axón está influenciada por una serie de factores intracelulares y extracelulares, muchos actuar localmente. Por lo tanto, la morfología cenador resultante es el resultado de procesos específicos que actúan sobre las neuritas específicos, por lo que es necesario realizar el análisis morfológico en una escala menor a fin de observar estas variaciones locales ^12.

El programa de Bonfire requiere el uso de dos herramientas de análisis de código abierto, el plug-in para ImageJ NeuronJ y NeuronStudio. Las neuronas son trazadas en ImageJ y NeuronStudio se utiliza para definir la conectividad entre las neuritas. Hoguera contiene una serie de scripts escritos en MATLAB (The Mathworks) que se utilizan para convertir los datos en el formato adecuado para su posterior análisis, comprobación de errores de usuario, y en última instancia, el análisis Sholl. Finalmente, los datos son exportados a Excel para su análisis estadístico. Un diagrama de flujo del programa de la hoguera se muestra en la Figura 1.

Protocolo

1. Antes de empezar:

1) E18 disección de la rata:

Los métodos estándar de la disección de las neuronas del hipocampo E18 han sido descritos previamente ^13. Con el fin de utilizar el programa hoguera para analizar las características morfológicas de las neuritas, de 8 bits. TIF de las neuronas individuales deben ser obtenidos. Esto se puede lograr de varias maneras, según el protocolo experimental que se está siguiendo. Las neuronas pueden ser chapada a una densidad suficientemente baja para que las neuronas individuales aparecen en el campo del microscopio. Por otra parte, a las neuronas individuales de la imagen que se cultivan en un cultivo denso, las neuronas pueden ser transfectadas utilizando una variedad de métodos de transfección con un plásmido que codifica una proteína fluorescente.

2) Requisitos de software y la instalación:

1. El plug-in para el software NeuronJ ImageJ de NIH y NeuronStudio deben estar instalados para poder ejecutar el programa de la hoguera. Los paquetes de software se puede encontrar en las siguientes páginas web:
   ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
   NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
   NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
2. El programa de la hoguera se puede encontrar en http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein. El manual del usuario hoguera también está disponible en este sitio web. Además, la descripción inicial de la hoguera se pueden encontrar en Langhammer et al, Citometría de 2010. Todos los datos han sido analizados mediante un sistema operativo Windows.

3) Ajuste de imagen Resolución:

Usted tendrá que ajustar el programa de la hoguera sobre la base de la resolución de imagen de las imágenes que se desea analizar. En la parte bonfire_parameters del programa de Bonfire, sustituya el valor actual de la pix_conv variable con el valor de la resolución de la imagen (m / pixel) de las imágenes.

2. Estructura del archivo:

Con el fin de la hoguera para analizar los datos, los archivos deben estar organizados de esta estructura específica (Figura 2). Usted tendrá que:

• Una carpeta principal
• Sub-carpetas (que contienen cada uno de sus diferentes condiciones)
• Archivos de celda de la imagen (archivos filename.tif) contenidos en las carpetas de diferentes condiciones
• Una carpeta que contiene la hoguera hoguera Matlab mfiles (también se encuentra en la carpeta principal)

3. Las neuronas de búsqueda en NeuronJ:

1. Preparar la imagen para el rastreo
   1. Abra la imagen, seleccionando el botón "Abrir" en la barra de herramientas y NeuronJ seleccionar la imagen que le gustaría dejar rastro.
   2. Cambiar el tamaño de la imagen mediante la selección de la 'maximizar' botón.
   3. Ajustar el brillo y el contraste de la imagen para que pueda visualizar todas las neuritas mediante la selección de 'Imagen' en la barra de herramientas NeuronJ luego seleccionar "Ajuste de brillo / contraste.
2. Rastrear el cuerpo de la célula en NeuronJ e identificar la huella como "Tipo 06"
   1. Seleccione el botón "Añadir Rastros" en la barra de herramientas NeuronJ.
   2. Trace una línea alrededor del perímetro del cuerpo celular.
   3. Seleccione el botón 'Trazos de etiquetas "en la barra de herramientas NeuronJ.
   4. Seleccione 'N1' de la 'Tracing ID "del menú desplegable.
   5. "Tipo 06", seleccione en el NeuronJ: Atributos de la ventana y seleccione "Aceptar".
3. Traza las neuritas en NeuronJ
   1. Seleccione el botón "Añadir Rastros" en la barra de herramientas NeuronJ.
   2. Añadir un recorrido a lo largo de cada rama de las neuritas. Sólo puede seleccionar las dendritas o axones, en función de su experimento.
   3. Le sugerimos que los segmentos de dibujar parar en cada punto de ramificación, con cada punto de ramificación hija a partir de ese momento como una nueva traza.
   4. Seleccione el botón "Guardar trazados" en la barra de herramientas NeuronJ.
   5. Guardar el trazado que acaba de crear en la misma carpeta que el archivo de imagen original.
4. Exportar los archivos de rastreo y el archivo de seguimiento identificador de NeuronJ
   Dos tipos de archivos deben ser exportados de NeuronJ y se guardan en las carpetas de las condiciones adecuadas, junto con el. Tif y archivos. NDF.
   1. Seleccione el botón "Seguimiento de exportación" en la barra de herramientas NeuronJ.
   2. Seleccione la pestaña "-deliminated archivos de texto: archivo separado para" opción en el 'cada trazado NeuronJ: Exportar' cuadro de diálogo y seleccione "Aceptar".
   3. Permitir NeuronJ para elegir los nombres de los archivos y la ubicación de almacenamiento.
   4. Seleccione el botón 'Trazos medida' en la barra de herramientas NeuronJ.
   5. Selecciona la opción "Mostrar las mediciones de seguimiento 'en el' NeuronJ: Medidas 'ventana y seleccione" Ejecutar ".
   6. 'Archivo' seleccione el 'NeuronJ: Trazos "de la ventana.
   7. Seleccione "Guardar como" y guarde el archivo como Filename_info. 'Archivo' debe coincidir exactamente con el nombre del archivo de imagen original (incluyendo la capitalización), seguido por _info y no debe contener una carta de 3 de extensiones de archivos. Por ejemplo, para Cell20.tif nombre original de la imagen, este archivo se llamaría 'Cell20_info. Verifique que su equipo no agrega automáticamente una extensión de archivo. Xls. Si lo hace, la extensión de archivo se deben eliminar manualmente.

4. Use la hoguera para construir archivos SWC preliminares de los datos NeuronJ.:

1. Reorganizar las carpetas con "bonfire_load '
   1. Abra Matlab haciendo doble clic sobre el icono.
   2. Haga clic en el botón 'en la parte superior derecha de la ventana de comandos.
   3. Seleccione la 'hoguera' carpeta en la carpeta principal en el "Buscar carpeta" ventana.
   4. Tipo 'bonfire_load' en la ventana de comandos del Matlab y pulse enter.
   5. Seleccione la carpeta condición de que usted desea analizar en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar".
   6. Esto se reorganizará la estructura de carpetas mediante la creación de células sub-carpetas que contienen todos los datos de cada celda individual.
2. Crear archivos filename_prelim.swc con 'bonfire_ndf2swc'
   1. "Bonfire_ndf2swc" escribir en la ventana de comandos y pulse Intro.
   2. Seleccione la carpeta mismas condiciones que le acaba de reorganizar con 'bonfire_load "en el" Buscar carpeta "ventana y seleccione" Aceptar ".
   3. Esto creará un archivo. Swc en cada carpeta de células de la condición de elegido. Cada carpeta celular ahora tendrá 5 ficheros,. Tif la imagen original, el archivo de NDF, el archivo de identificador de traza _info, un archivo txt y un archivo SWC....

5. Use NeuronStudio para Finalizar archivos SWC.:

1. Abrir y calibrar las imágenes de neuronas en NeuronStudio
   1. Abra el programa NeuronStudio.
   2. Seleccione Archivo → Abrir en la barra de herramientas NeuronStudio.
   3. Encontrar la imagen. Tif de la neurona que desea modificar y abrirlo.
   4. Seleccione Ejecutar → Configuración e introduzca '1 'en cada uno de los 3 (X, Y, Z) cajas en la "ventana de tamaño de vóxel.
   5. Seleccione Archivo → Importar SWC. Seleccione el archivo correspondiente. SWC. El archivo de imagen ahora se superpone con una imagen de rastreo. El soma celular debe ser cubierta con un círculo rojo.
2. Use NeuronStudio de neuritas enlace
   1. Utilice las herramientas en NeuronStudio para identificar correctamente los puntos de ramificación y el punto final (le recomendamos que se familiaricen con las características NeuronStudio y accesos directos antes de analizar los datos).
   2. En concreto, el uso de la "herramienta de neuritas para unirse a los nodos de modo que:
      • Cada punto de ramificación (nodos amarillos) sólo se pueden crear dos ramas
      • Todos los rastros se continua con el soma (sólo un nodo rojo)
3. Exportar datos de NeuronStudio
   1. Seleccione Archivo → Guardar neuritas (salvo que el nombre por defecto).
4. Compruebe si hay errores en el. Swc archivos utilizando "bonfire_trace_check '
   1. "Bonfire_trace_check" escribir en la ventana de comandos MathLab y pulse enter.
   2. Seleccione la carpeta que contiene el estado de los datos que acaba de procesar en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar".
   3. Si hay algún error en alguna de las imágenes de la carpeta el programa mostrará las imágenes que muestran que el error se encuentra.
   4. Corrección de errores en NeuronStudio
      1. Abra el archivo de imagen que guardó en el paso de la exportación.
      2. Localizar y solucionar el problema (s).
      3. Haga clic en Archivo → Guardar neuritas.
      4. Repita para otras imágenes que necesitan ser corregidos.
      5. Vuelva a ejecutar 'bonfire_trace_check' (5,4).

6. Use 'hoguera' para extraer datos morfológicos de los archivos SWC.:

1. 'Hoguera' escribe en la ventana de comandos y pulse Intro.
2. Seleccione la carpeta que contiene el estado de los datos que desea analizar en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar".
3. El análisis de la hoguera se generará una ventana para cada una de las neuronas que se analiza, en la que los gráficos de la morfología neuronal junto con los anillos Sholl utilizados en el análisis. Además, el comando 'hoguera' va a generar el archivo. Estera que contiene toda la información morfológica que se ha tomado del análisis.

7. Use 'bonfire_results' para ver los datos:

1. Tipo 'bonfire_results' en la ventana de comandos del Matlab.
2. Seleccione la carpeta de condiciones para la condición que le gustaría ver en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar".
3. El "Buscar carpeta" ventana se cerrará temporalmente y volver a abrir, lo que le permite seleccionar las condiciones adicionales que le gustaría ver.
4. Cuando haya terminado de seleccionar las carpetas condición, seleccione "Cancelar" para salir del proceso de selección.
5. "Bonfire_results 'volverá tablas resumen que incluya ªlos datos de las carpetas de correo condición de que haya seleccionado.

8. Use 'bonfire_export "para exportar datos a Excel:

1. Tipo 'bonfire_export' en la ventana de comandos.
2. Seleccione la carpeta que contiene el estado de los datos que desea exportar en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar". Bonfire_export creará archivos de Excel de los datos morfológicos y los colocará en la carpeta condición de que fue seleccionado.

9. Los resultados representativos:

Un ejemplo de los datos generados por el programa de la hoguera en un conjunto de datos que contiene dos condiciones se muestra en la Figura 3. En este ejemplo, un Estado de las neuronas contienen más neuritas distal al cuerpo celular. Este fenómeno se puede observar en las imágenes de ejemplo (Figura 3 B), así como en la curva de Sholl de la dendríticas total de árbol (Figura 3) y en la gráfica de la cantidad de puntos terminales (Figura 3C). Además, debido a que el programa de la hoguera también realiza análisis de Sholl en las subregiones de las imágenes, que son capaces de identificar más específicamente la identidad de las neuritas que se han incrementado. Tanto el número total de intersecciones de orden 3 ^º o más neuritas (Figura 3F) y el número total de los intermediarios y neuritas terminal (Figura 3G) aumentan distal al cuerpo celular. Estas tendencias también se pueden observar en las figuras 3D y 3E.

Figura 1:. Diagrama de flujo del programa de Bonfire Las neuronas son trazados con ImageJ. Los datos se exportan y se convirtió en el programa hoguera en archivos SWC preliminar.. NeuronStudio se utiliza para definir la conectividad de las neuritas. Cheques hoguera de los errores y luego calcula las curvas de Sholl, el número de neuritas primaria, para secundaria y superior, y el número de puntos de ramificación y consejos de las neuritas. Finalmente, los datos son exportados a Excel para su análisis estadístico.

Figura 2: Estructura de los archivos necesarios para el análisis Hoguera La estructura del archivo debe coincidir con este o el programa no funcionará correctamente.. Los nombres de las carpetas y los archivos y la cantidad de las carpetas y los archivos se puede cambiar.

Figura 3: Ejemplo de datos de salida del programa de una fogata curvas) Total Sholl.. B) Ejemplo invertida imágenes de ambas condiciones. C) Número promedio de puntos de ramificación y en los extremos / celular. D) Número medio de procesos / celular de primaria, secundaria y terciaria o superior neuritas. E) Promedio de procesos / celular de la raíz, intermedio y neuritas terminal. F) Segmento de la identidad específica de las curvas de análisis Sholl. Los segmentos se agrupan en primaria, secundaria o terciaria o superior. G) Segmento de la identidad específica de las curvas de análisis Sholl. Los segmentos se agrupan en los segmentos de raíz, los segmentos intermedios, o segmentos de la terminal.

Discusión

El programa de la hoguera es un programa semi-automático para el análisis de la dendrita y axón morfología. Se aumenta la eficiencia y la exactitud del análisis de Sholl sobre la realización del análisis de forma manual. Además, el programa guarda los datos de la hoguera en cada paso del proceso, por lo que es posible auditar los datos y verificar la exactitud de los análisis. Por lo tanto, la tarea de análisis de datos se pueden distribuir a numerosas personas sin comprometer la precisión. Por último, media...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NeuronJ plugin			http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
ImageJ software			http://rsbweb.nih.gov/ij/
Bonfire program			http://lifesci.rutgers.edu/~firestein
NeuronStudio			http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
MatLab Program	Mathworks