Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Resumo

Nós desenvolvemos um programa de computador para analisar a morfologia neuronal. Em combinação com dois existentes ferramentas de análise de código aberto, o nosso programa realiza análise de Sholl e determina o número de neurites, pontos de ramificação, e dicas de neurite. As análises são realizadas para que as mudanças locais na morfologia neurite pode ser observado.

Resumo

Morfologia neuronal desempenha um papel significativo na determinação de como os neurônios de função e comunicar ^1-3. Especificamente, ele afeta a capacidade dos neurônios para receber insumos de outras células ² e contribui para a propagação de potenciais de ação ^4,5. A morfologia das neurites também afeta a forma como a informação é processada. A diversidade de morfologias dendrite facilitar a sinalização de faixa de locais e de longa e permitir que os neurônios individuais ou grupos de neurônios para realizar funções especializadas dentro da rede neuronal ^6,7. Alterações na morfologia dendrite, incluindo a fragmentação dos dendritos e mudanças nos padrões de ramificação, foram observados em um número de estados de doença, incluindo a doença de Alzheimer ^{8, 9,10} esquizofrenia e retardo mental ^11. A capacidade de entender os fatores que moldam morfologias dendrite e para identificar alterações nas morfologias dendrite é essencial na compreensão da função do sistema nervoso e disfunção.

Morfologia neuritos muitas vezes é analisado por análise de Sholl e contando o número de neurites e do número de pontas de galhos. Esta análise é geralmente aplicado a dendritos, mas também pode ser aplicado para os axônios. Fazer esta análise com a mão é tanto demorado e inevitavelmente introduz variabilidade devido ao preconceito de experimentador e inconsistência. O programa da fogueira é uma abordagem semi-automática para a análise da dendrite e morfologia axônio que se baseia em open-source disponíveis ferramentas de análise morfológica. Nosso programa permite a detecção de mudanças locais no dendrito e axônio ramificação comportamentos através da realização de análise de Sholl na sub-regiões do arbor neuríticas. Por exemplo, a análise de Sholl é realizado em ambos os neurônio como um todo, bem como sobre cada subconjunto de processos (primário, secundário, terminal root, etc) Dendrite e padronização axônio é influenciado por uma série de fatores intra e extracelulares, muitos agir localmente. Assim, a morfologia arbor resultante é um resultado de processos específicos agindo em neurites específicos, tornando-se necessário realizar uma análise morfológica em uma escala menor, a fim de observar estas variações locais ^12.

O programa da fogueira requer o uso de duas ferramentas open-source de análise, o plugin para NeuronJ ImageJ e NeuronStudio. Neurônios são traçados no ImageJ e NeuronStudio é usado para definir a conectividade entre neurites. Bonfire contém uma série de scripts personalizados escritos em MATLAB (MathWorks) que são usados ​​para converter os dados para o formato apropriado para posterior análise, verificar os erros do usuário, e, finalmente, realizar a análise Sholl. Finalmente, os dados são exportados para Excel para análise estatística. Um fluxograma do programa Bonfire é mostrado na Figura 1.

Protocolo

1. Antes de começar:

1) E18 dissecção de ratos:

Métodos de dissecção padrão de E18 neurônios do hipocampo tenham sido previamente descrito ^13. , A fim de usar o programa da fogueira para analisar as características morfológicas das neurites, imagens de 8 bits. Tif de neurônios individuais devem ser obtidos. Isso pode ser feito em uma série de maneiras dependendo do protocolo experimental que está a seguir. Neurônios podem ser banhado com uma densidade suficientemente baixa para que os neurônios individuais aparecem no campo do microscópio. Como alternativa, para os neurônios individuais de imagem que são cultivadas em uma cultura densa, os neurônios podem ser transfectadas usando uma variedade de métodos de transfecção com um plasmídeo uma proteína fluorescente.

2) Requisitos de Software e Instalação:

1. O plugin NeuronJ para o software ImageJ do NIH e NeuronStudio devem estar instalados para executar o programa da fogueira. Os pacotes de software podem ser encontradas nos seguintes sites:
   ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
   NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
   NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
2. O programa Bonfire podem ser encontradas em http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein. O manual do usuário Bonfire também está disponível neste site. Além disso, a descrição inicial de Bonfire pode ser encontrado em Langhammer et al, Citometria de 2010. Todos os nossos dados foram analisados ​​usando um sistema operacional Windows.

3) Ajuste de Resolução de Imagem:

Você precisará ajustar o programa Bonfire baseado na resolução de imagem das imagens que você deseja analisar. Na parte bonfire_parameters do programa Bonfire, substitua o valor atual para o pix_conv variável com o valor da resolução de imagem (M / pixel) de suas imagens.

2. Estrutura do arquivo:

Para que Bonfire para analisar os dados, os arquivos devem ser organizados nesta estrutura específica (Figura 2). Você terá:

• A pasta principal
• Sub-pastas (contendo cada uma de suas diferentes condições)
• Arquivos de célula de imagem (arquivos filename.tif) contidos nas pastas condição diferente
• A pasta contendo o Bonfire Bonfire Matlab mfiles (também contida na pasta master)

3. Neurônios rastreamento em NeuronJ:

1. Preparar a imagem para rastreamento
   1. Abra a imagem, selecionando o botão "Abrir" na barra de ferramentas NeuronJ e selecionando a imagem que você gostaria de rastrear.
   2. Redimensionar a imagem, selecionando o botão 'maximizar'.
   3. Ajustar o brilho eo contraste da imagem para que você possa visualizar todas as neurites, selecionando 'Image' na barra de ferramentas NeuronJ então selecionar 'Ajuste de brilho / contraste ".
2. Traçar o corpo celular no NeuronJ e identificar o traço como sendo "Tipo 06"
   1. Clique no botão "Add Traces 'na barra de ferramentas NeuronJ.
   2. Traço em torno do perímetro do corpo celular.
   3. Clique no botão "Traçados Label 'na barra de ferramentas NeuronJ.
   4. Selecione 'N1' do 'Tracing ID' menu dropdown.
   5. "Tipo 06" selecionar no NeuronJ: Atributos janela e selecione 'OK'.
3. Traçar o neurites em NeuronJ
   1. Clique no botão "Add Traces 'na barra de ferramentas NeuronJ.
   2. Adicionar um traço ao longo de cada ramo de neurite. Você pode selecionar apenas os dendritos ou o axônio, dependendo da sua experiência.
   3. Sugerimos que os segmentos de desenhar parar em cada ponto de ramificação, com cada ponto de ramificação filha a partir de que ponto como um novo rastreamento.
   4. Clique no botão "Salvar Traçados 'na barra de ferramentas NeuronJ.
   5. Salve o traçado que acabou de criar na mesma pasta que o arquivo de imagem original.
4. Exportar os arquivos de rastreamento eo arquivo identificador de rastreamento a partir de NeuronJ
   Dois tipos de arquivos devem ser exportados do NeuronJ e salvos nas pastas condição apropriada junto com o. Tif e arquivos. Ndf.
   1. Selecione o botão 'Trace Export' na barra de ferramentas NeuronJ.
   2. Selecione a opção "Tab-deliminated arquivos-texto: arquivo separado para" opção no "cada traçado NeuronJ: Export" caixa de diálogo e selecione 'OK'.
   3. Permitir NeuronJ para escolher os nomes dos arquivos e guardar o local.
   4. Clique no botão "Traçados Medida 'na barra de ferramentas NeuronJ.
   5. Selecione a opção "Mostrar medidas rastreamento 'no' NeuronJ: Medições" janela e selecione "Executar".
   6. 'File' Selecione na "NeuronJ: Traçados 'janela.
   7. Selecione 'Salvar Como' e salve o arquivo como filename_info. 'Filename' deve corresponder exatamente ao nome do arquivo de imagem original (incluindo capitalização), seguido por _info e não devem conter de 3 letras extensão do arquivo. Por exemplo, para Cell20.tif imagem original nome, este arquivo seria chamado 'Cell20_info'. Verifique se o computador não adiciona automaticamente uma extensão de arquivo. Xls. Se isso acontecer, a extensão do arquivo deve ser excluído manualmente.

4. Use Bonfire preliminares para construir arquivos de dados swc NeuronJ.:

1. Reorganize as pastas usando 'bonfire_load'
   1. Abra Matlab clicando duas vezes sobre o ícone.
   2. Clique no botão '' no canto superior direito da janela de comando.
   3. Selecione o "Bonfire" pasta na sua pasta de mestre no "Procurar Pasta" janela.
   4. Tipo 'bonfire_load' na janela de comandos Matlab e pressione enter.
   5. Selecione a pasta condição que você deseja analisar no "Procurar Pasta" janela e selecione 'OK'.
   6. Isto irá reorganizar a estrutura de pastas, criando células sub-pastas que contêm todos os dados para cada célula individual.
2. Criar arquivos filename_prelim.swc usando 'bonfire_ndf2swc'
   1. "Bonfire_ndf2swc 'digitar na janela de comando e pressione enter.
   2. Selecione a pasta mesma condição que você acabou de reorganizada com 'bonfire_load' no campo 'Procurar Pasta "janela e selecione' OK '.
   3. Isso irá criar um arquivo. Swc em cada pasta de células para a condição de escolhido. Cada pasta celular agora irá conter cinco arquivos;. Tif a imagem original, o arquivo ndf, o arquivo identificador _info traço, um arquivo txt e um arquivo swc....

5. Use a NeuronStudio Finalize arquivos SWC.:

1. Abrir e calibrar imagens neurônio em NeuronStudio
   1. Abra o programa NeuronStudio.
   2. Selecione Arquivo → Abrir na barra de ferramentas NeuronStudio.
   3. Encontrar a imagem. Tif do neurônio que você deseja editar e abri-lo.
   4. Selecione Executar → Configurações e digite '1 'em cada um dos 3 (X, Y, Z) caixas na "janela Tamanho Voxel".
   5. Selecione Arquivo → SWC Import. Selecione o arquivo apropriado. Swc. O arquivo de imagem agora será revestida com uma imagem de rastreamento. A soma das células deve ser coberta com um círculo vermelho.
2. Use NeuronStudio para neurites ligação
   1. Use as ferramentas no NeuronStudio para identificar corretamente pontos de ramificação e pontos finais (recomendamos que você se familiarizar com as características NeuronStudio e atalhos antes de analisar seus dados).
   2. Especificamente, use a "ferramenta de neurite" para juntar os nós de modo que:
      • Cada ponto de ramificação (nós amarelo) só pode criar dois ramos
      • Todos os traços são contínuos com a soma (apenas um nó vermelho)
3. Exportar dados do NeuronStudio
   1. Selecione Neuritos File → Save (salvar como o nome padrão).
4. Verificar se há erros em arquivos. Swc usando 'bonfire_trace_check'
   1. "Bonfire_trace_check 'digitar na janela de comando Mathlab e pressione enter.
   2. Selecione a pasta condição contendo os dados que você acabou processado no "Procurar Pasta" janela e selecione 'OK'.
   3. Se houver algum erro em qualquer uma das imagens na pasta o programa vai exibir imagens de saída, onde está localizado o erro.
   4. Correção de erros em NeuronStudio
      1. Abra o arquivo de imagem que você salvou na etapa de exportação.
      2. Localizar e corrigir o problema (s).
      3. Clique em Arquivo → Salvar Neuritos.
      4. Repita a operação para outras imagens que precisam ser corrigidos.
      5. Execute novamente "bonfire_trace_check '(5.4).

6. Use 'fogueira' para extrair dados morfológicos de arquivos swc.:

1. 'Fogueira' digitar na janela de comando e pressione enter.
2. Selecione a pasta condição que contém os dados que deseja analisar no "Procurar Pasta" janela e selecione 'OK'.
3. A análise da fogueira irá gerar uma janela para cada um dos neurônios em análise, em que a morfologia neuronal gráficos juntamente com os anéis Sholl utilizados na análise. Além disso, o comando 'fogueira' irá gerar o arquivo. Mat que contém todas as informações morfológicas que foi tomada a partir da análise.

7. Use 'bonfire_results' para visualizar os dados:

1. Tipo 'bonfire_results' na janela de comandos Matlab.
2. Selecione a pasta condição para a condição que você gostaria de ver no "Procurar Pasta" janela e selecione 'OK'.
3. O "Procurar Pasta" janela será fechada temporariamente e re-aberto, permitindo que você selecione condições adicionais que você gostaria de ver.
4. Quando você terminar de selecionar pastas condição, selecione 'Cancelar' para sair do processo de seleção.
5. "Bonfire_results 'retornará gráficos sumário, incluindo ªdados e das pastas condição que você selecionou.

8. Use 'bonfire_export' para exportar dados para o Excel:

1. Tipo 'bonfire_export' na janela de comando.
2. Selecione a pasta condição contendo os dados que você gostaria de exportação no "Procurar Pasta" janela e selecione 'OK'. Bonfire_export irá criar arquivos de Excel dos dados morfológicos e irá colocá-los na pasta condição que foi selecionado.

9. Resultados representativos:

Um exemplo dos dados gerados pelo programa Bonfire em um conjunto de dados contendo duas condições é mostrado na Figura 3. Neste exemplo, Condição 1 neurônios que contêm neurites mais distal para o corpo celular. Este fenômeno pode ser observado nas imagens de exemplo (Figura 3B), bem como na curva Sholl do total dendríticas arbor (Figura 3A) e no gráfico do número de pontos terminais (Figura 3C). Além disso, porque o programa também realiza a análise Bonfire Sholl em sub-regiões das imagens, que são capazes de identificar mais especificamente a identidade do neurites que têm aumentado. Tanto o número total de interseções de 3 ^ª ordem ou neurites maior (Figura 3F) eo número total de ambos os intermediários e neurites terminal (Figura 3G) são aumentadas distal para o corpo celular. Essas tendências também podem ser observados nas Figuras 3D e 3E.

Figura 1:. Fluxograma do programa Bonfire Neurônios são rastreados usando ImageJ. Os dados são então exportados e convertidos pelo programa Bonfire em preliminar. Swc arquivos. NeuronStudio é usado para definir a conectividade do neurites. Verifica fogueira para erros e, em seguida, calcula as curvas de Sholl, o número de primário, neurites ordem secundária e superior, eo número de pontos de ramificação e dicas neurite. Finalmente, os dados são exportados para Excel para análise estatística.

Figura 2: Estrutura de arquivos necessários para a análise da fogueira A estrutura do arquivo deve corresponder a este ou o programa não será executado corretamente.. Os nomes das pastas e arquivos e da quantidade de pastas e arquivos podem ser alterados.

Figura 3: Exemplo de dados de saída do programa Bonfire A) curvas Sholl Total.. B) Exemplo invertida imagens de ambas as condições. C) Número médio de pontos de ramificação e pontos terminais / célula. D) O número médio de processos / celular para primário, secundário e terciário ou superior neurites. E) Número médio de processos / celular para o root, intermediário e neurites terminal. F) identidades específicas Segmento curvas de análise de Sholl. Segmentos são agrupados como primário, secundário ou terciário ou superior. G) a identidade específica do segmento curvas de análise de Sholl. Segmentos são agrupados em segmentos radiculares, segmentos intermediários, ou segmentos terminal.

Discussão

O programa Bonfire é um programa semi-automático para a análise de dendrite e morfologia axônio. Ela aumenta muito a eficiência ea precisão da análise de Sholl mais de realizar a análise manualmente. Além disso, o programa Bonfire salva os dados em cada etapa do processo, tornando possível a auditar os dados e verificar a precisão da análise. Portanto, a tarefa de análise de dados podem ser distribuídos para inúmeras pessoas sem comprometer a precisão. Por último, realizando a análise em sub-regiões d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NeuronJ plugin			http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
ImageJ software			http://rsbweb.nih.gov/ij/
Bonfire program			http://lifesci.rutgers.edu/~firestein
NeuronStudio			http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
MatLab Program	Mathworks