複数のスケールでデジタル化された神経形態の自動化されたショールの分析

要約

我々は、神経形態を分析するためにコンピュータプログラムを開発しました。つの既存のオープンソースの解析ツールと組み合わせることで、私たちのプログラムは、ショール分析を実行し、神経突起、分岐点、および神経突起の先端の数が決まります。分析は、神経突起の形態で局所的な変化が観察できるように実行されます。

要約

神経形態では、神経細胞が機能すると^1-3通信方法を決定する上で重要な役割を果たしている。具体的には、他のセルからの入力を受け取るために神経細胞の能力に影響を与える²と^4,5活動電位の伝播に貢献しています。神経突起の形態はまた、情報が処理される方法に影響します。樹状突起形態の多様性は、ローカルおよび長距離のシグナル伝達を促進し、個々の神経細胞や神経細胞のグループが神経ネットワーク^6,7内の特殊な機能を遂行することができます。分岐パターンの樹状突起と変化の断片化を含む、樹状突起形態の変化は、アルツハイマー病^8、統合失調症^9,10、および精神遅滞^11を含む病気の状態、の数で観察されている。両方の樹状突起形態を形成する要因を理解し、樹状突起形態の変化を識別する機能は、神経系の機能と機能障害の理解に不可欠である。

神経突起の形態は、多くの場合、ショール分析および神経突起と枝の先端の数の数をカウントすることにより分析されます。この分析は、一般的に樹状突起に適用されますが、それは軸索にも適用することができます。手でこの分析を実行すると、両方の時間がかかり、必然的に実験者のバイアスと矛盾に起因する変動をもたらしている。かがり火のプログラムが利用できるオープンソースの形態素解析ツールに基づいて構築された樹状突起と軸索形態の分析に半自動化されたアプローチです。私たちのプログラムは、神経突起アーバーのサブ領域にショール分析を実行することによって動作を分岐樹状突起と軸索における局所的な変化の検出を行うことができます。例えば、ショールの分析は、全​​体としてのニューロンだけでなく、プロセスの各部分（プライマリ、セカンダリ、ターミナル、ルート、等）デンドライトと軸索のパターン形成が細胞内と細胞外の多くの要因によって影響されるの両方で実行されている多くの局所的に作用する。したがって、結果として得られるアーバーの形態は、これらのローカルバリエーション^12を観察するために小規模で形態素解析を行うため必要があること、特定の神経突起に作用する特定のプロセスの結果です。

かがり火のプログラムは2つのオープンソースの解析ツール、ImageJとNeuronStudioへNeuronJプラグインを使用する必要があります。ニューロンは、ImageJのでトレースされている、とNeuronStudioは神経突起の間の接続を定義するために使用されます。たき火はさらなる分析のために適切な形式にデータを変換するために使用されているMATLAB（MathWorks社）で記述されたカスタムスクリプトの数を含む、ユーザのエラーをチェック、そして最終的にショール分析を行います。最後に、データは統計分析のためにExcelにエクスポートされます。かがり火のプログラムのフローチャートを図1に示されています。

プロトコル

1。始める前に：

1）E18ラットの解剖：

E18海馬ニューロンの標準的な解剖の方法は以前に^13を記載されている。神経突起の形態的特徴を分析するためにたき火のプログラムを使用するためには、個々のニューロンの8ビット。tifイメージを取得する必要があります。これは、あなたが従っている実験的なプロトコルに応じていくつかの方法で行うことができます。単一の神経細胞が顕微鏡のフィールドに表示されるように神経細胞が十分に低い密度でめっきすることができる。また、高密度培養で増殖されている画像の個々の神経細胞に、ニューロンがコードするプラスミド蛍光タンパク質でトランスフェクションの様々な方法を用いてトランスフェクトすることができます。

2）ソフトウェア要件とインストール：

1. NIHとNeuronStudioからImageJのソフトウェアのためのNeuronJプラグインは、両方のかがり火のプログラムを実行するためにインストールする必要があります。ソフトウェアパックは、以下のWebサイトで見つけることができます。
   ImageJの- http://rsbweb.nih.gov/ij/
   NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
   NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
2. かがり火のプログラムはhttp://lifesci.rutgers.edu/〜firesteinで見つけることができます。かがり火のユーザマニュアルは、本ウェブサイトでも利用可能です。また、焚き火の最初の記述は、 ラングハマーら、サイトメトリー、2010年に見つけることができます。私たちのすべてのデータは、Windowsオペレーティングシステムを用いて分析されています。

3）画像解像度の調整：

あなたが分析したい画像の画像解像度に基づいて、かがり火のプログラムを調整する必要があります。かがり火のプログラムのbonfire_parametersの部分では、あなたの画像の画像解像度（μm/ピクセル）の値を持つ変数pix_convの現在の値を置き換えます。

2。ファイルの構造：

あなたのデータを分析するかがり火ためには、ファイルはこの特定の構造（ 図2）で構成されている必要があります。以下のようになります。

• マスターフォルダ
• サブフォルダ（あなたの様々な条件のそれぞれを含む）
• 異なる条件のフォルダに含まれるセルのイメージファイル（filename.tifファイル）
• たき火Matlabのmfiles（マスターフォルダに含まれる）を含むかがり火のフォルダ

3。 NeuronJのトレースニューロン：

1. トレース用イメージを準備
   1. NeuronJツールバーの"開く"ボタンを選択し、トレースしたい画像を選択して画像を開きます。
   2. "最大化"ボタンを選択することで画像のサイズを変更します。
   3. あなたが"調整明るさ/コントラスト"を選択しNeuronJのツールバーの"イメージ"を選択することで神経突起のすべてを可視化できるように、画像の明るさとコントラストを調整します。
2. NeuronJの細胞体をトレースし、"タイプ06"としてトレースを識別する
   1. NeuronJツールバーの"追加のトレース"ボタンを選択します。
   2. 細胞体の周囲にトレース。
   3. NeuronJツールバーの"ラベルのトレーシング"ボタンを選択します。
   4. "トレースID'ドロップダウンメニューから"N1"を選択してください。
   5. [属性]ウィンドウと[OK]を選択します："タイプ06"NeuronJで]を選択します。
3. NeuronJの神経突起をトレースする
   1. NeuronJツールバーの"追加のトレース"ボタンを選択します。
   2. それぞれの神経突起分岐に沿ってトレースを追加します。あなたの実験に応じて、樹状突起や軸索のみを選択することができます。
   3. 私たちは、それぞれの娘の分岐点は、新しいトレースとして、その時点で始まると、あなたが描画セグメントが各分岐点で停止することを示唆している。
   4. NeuronJツールバーの[保存トレーシング"ボタンを選択します。
   5. あなただけのオリジナルの画像ファイルと同じフォルダに作成したトレースを保存します。
4. NeuronJからトレースファイルとトレース識別子のファイルをエクスポートする
   の2種類のファイルはNeuronJからエクスポートして。tifファイルと。NDFファイルとともに適切な条件のフォルダに保存する必要があります。
   1. NeuronJツールバーの"エクスポートのトレース"ボタンを選択します。
   2. "エクスポート"ダイアログボックスと選択し"OK：NeuronJ各トレースを'on'オプションのための別個のファイル："タブ区切りのテキストフ​​ァイルを選択します。
   3. NeuronJのファイルと保存場所の名前を選択することができます。
   4. NeuronJツールバーの"測定のトレーシング"ボタンを選択します。
   5. "NeuronJ：測定を'on'オプションの測定トレースを表示"を選択し、ウィンドウをして'実行'を選択します。
   6. '：トレーシングNeuronJ"ウィンドウで選択します"ファイル"。
   7. "名前を付けて保存"を選択し、filenとしてファイルを保存するame_info。 'fil​​ename'は正確に_INFO続いて元のイメージファイル（大文字小文字の区別も含めて）の名前と一致している必要がありますし、3文字のファイル拡張子を含めることはできません。例えば、オリジナルのイメージ名のCell20.tifのため、このファイルは"Cell20_info"という名前になります。コンピュータが自動的に。xlsファイルの拡張子を追加しないことを確認してください。その場合、ファイルの拡張子を手動で削除する必要があります。

4。 。NeuronJデータからの予備SWCファイルをビルドするためにかがり火を使用します。

1. "bonfire_load'を使用してフォルダを再編成
   1. アイコンをダブルクリックして、MATLABを開きます。
   2. コマンドウィンドウの右上の'A'ボタンをクリックします。
   3. ウィンドウ"フォルダの参照"で、マスターフォルダ内の"かがり火"フォルダを選択します。
   4. タイプMATLABコマンドウィンドウに"bonfire_load"を入力してENTERを押します。
   5. あなたがウィンドウ"フォルダの参照"で分析し、"OK"を選択するという条件のフォルダを選択します。
   6. これは、個々のセルのすべてのデータを含むセルのサブフォルダを作成することにより、フォルダ構造を再編成します。
2. "bonfire_ndf2swc'を使用してfilename_prelim.swcファイルを作成します。
   1. タイプのコマンドウィンドウに"bonfire_ndf2swc"を入力してENTERを押します。
   2. あなただけのウィンドウ"フォルダの参照"で"bonfire_load'で再編成と同じ条件のフォルダを選択し、"OK"を選択します。
   3. これは、選択された条件の各セルのフォルダに。SWCファイルを作成します。各セルのフォルダは、現在5つのファイルが含まれています。。オリジナルのtifイメージ、NDF​​ファイル、_INFOトレース識別子のファイル、txtファイルとSWCファイルを。。。。

5。 FinalizeにNeuronStudioを使用してSWCファイル。：

1. NeuronStudioでニューロンの画像を開いて、キャリブレーションを
   1. NeuronStudioプログラムを開きます。
   2. ファイルを選択→NeuronStudioツールバーの[開く。
   3. あなたがそれを編集して開こうとするニューロンの。tifイメージを見つける。
   4. 選択→[設定]を実行し、ボクセルサイズ"ウィンドウ"3のそれぞれの（X、Y、Z）のボックスに'1'を入力してください。
   5. ファイルを選択→インポートSWCを。適切な。SWCファイルを選択してください。イメージファイルは、現在のトレース画像にオーバーレイされます。細胞体は、赤い丸に重ねてください。
2. リンクの神経突起へのNeuronStudioを使用して、
   1. 正しく分岐点と終了点を識別するためNeuronStudio内のツールを使用する（私たちは、あなたがあなたのデータを分析する前にNeuronStudioの機能やショートカットを知り合うことをお勧めします）。
   2. 特に、そのようにノードを参加させる"神経突起ツール"を使用します。
      • 各分岐点（黄色のノード）は2つだけの分岐を作成できます。
      • すべてのトレースは、ソーマ（唯一の赤のノード）との連続です。
3. NeuronStudioからデータをエクスポートする
   1. ファイル→保存神経突起を（デフォルト名として保存）]を選択します。
4. "bonfire_trace_check'を使用する。SWCファイル内のエラーを確認してください
   1. Mathlabのコマンドウィンドウとプレスにタイプ"bonfire_trace_checkは"と入力します。
   2. あなただけのウィンドウ"フォルダの参照"で処理されているデータを含む状態のフォルダを選択し、"OK"を選択します。
   3. フォルダ内の画像のいずれかにエラーがある場合、プログラムはエラーがどこにあるか表示する画像を出力します。
   4. NeuronStudioのエラーを修正する
      1. あなたがエクスポートの手順で保存した画像ファイルを開きます。
      2. 問題（複数可）を見つけて修正。
      3. [ファイル]をクリック→神経突起を保存します。
      4. 修正が必要な他の画像について、この手順を繰り返します。
      5. "bonfire_trace_check"（5.4）を再実行します。

6。 。SWCファイルから形態学的データを抽出する"たき火"を使用します。

1. タイプのコマンドウィンドウに"たき火"を入力してENTERを押します。
2. あなたがウィンドウ"フォルダの参照"と"OK"を選択で分析するデータが格納されている状態のフォルダを選択します。
3. かがり火の分析は、分析で使用されているショールのリングと一緒に神経細胞の形態をグラフ化した分析されるニューロンのそれぞれのウィンドウを生成します。さらに、"たき火"コマンドは、分析から採取された形態学的情報のすべてが含まれている。matファイルを生成します。

7。データを表示する"bonfire_results'を使用します：

1. MATLABコマンドウィンドウにタイプ"bonfire_results"。
2. あなたがウィンドウ"フォルダの参照"で表示し、"OK"を選択したい条件の条件のフォルダを選択します。
3. ウィンドウ"フォルダの参照"は、一時的に閉じ、再度開いて、あなたが表示したい追加の条件を選択することができますされます。
4. あなたが条件のフォルダを選択したら、選択プロセスを終了するには、[キャンセル]を選択します。
5. "Bonfire_resultsは"目を含むサマリグラフを返します。選択した条件のフォルダからのEはデータ。

8。 Excelにデータをエクスポートする"bonfire_export'を使用します：

1. コマンドウィンドウにタイプ"bonfire_export"。
2. あなたがウィンドウ"フォルダの参照"と"OK"を選択でエクスポートしたいデータを格納している状態のフォルダを選択します。 Bonfire_exportは、形態学的データのExcelファイルを作成し、選択された状態のフォルダに配置します。

9。代表的な結果：

二つの条件を含むデータセット上でかがり火のプログラムによって生成されるデータの例を図3に示されています。この例では、条件1の神経細胞は、細胞体の遠位より多くの神経突起が含まれています。この現象は、全体の樹状アーバ（ 図3A）のショール曲線でとターミナルポイント（ 図3C）の数のグラフの例の画像（ 図3B）と同様に観察することができます。また、焚き火のプログラムはまた、画像の部分領域にショール分析を実行するため、我々はより具体的に増加している神経突起の身元を識別することができます。 ³次以上の神経突起（ 図3F）と中間及び端末の神経突起の両方の合計数の交点の総数は両方とも（ 図3G）細胞体から遠位に増加している。これらの傾向は、3Dと3E図で観察することができます。

図1：。かがり火のプログラムのフローチャートニューロンはImageJを使用してトレースされます。その後、データは予備。SWCファイルにかがり火プログラムによってエクスポートされ、変換されます。 NeuronStudioは、神経突起の接続性を定義するために使用されます。その後、焚き火のエラーのチェックとは、ショール曲線、プライマリ、セカンダリ、およびより高次の神経突起の数、および分岐点と神経突起先端の数を計算します。最後に、データは統計分析のためにExcelにエクスポートされます。

図2：かがり火の解析に必要なファイル構造ファイル構造は、これを一致させる必要がありますか、プログラムが正しく実行されません。フォルダとファイルおよびフォルダとファイルの量の名前を変更することができます。

図3：かがり火のプログラムからの出力例のデータ ）の合計ショール曲線。。 B）の例は、両方の条件の画像を反転。分岐点と端点/セルのC）の平均数。プライマリ、セカンダリ、および三次以上の神経突起のプロセス/セルのD）の平均数。 E）の平均rootのプロセス/セルの数、中間、および端末の神経突起。 F）セグメントのアイデンティティ固有のショールの分析曲線。セグメントはプライマリ、セカンダリ、またはターシャリ以上のように分類されています。 G）セグメントのアイデンティティ固有のショールの分析曲線。セグメントは、ルートセグメント、中間セグメント、または端末セグメントとしてグループ化されています。

ディスカッション

かがり火のプログラムは、樹状突起と軸索の形態の分析のための半自動化されたプログラムです。それは非常に手動で分析を行う上ショール解析の効率と精度を向上させます。さらに、かがり火のプログラムは、可能な限りデータを監査するために、分析の精度を検証すること、プロセスのあらゆる段階でデータを保存します。したがって、データ分析のタスクは、精度を損なうことなく、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NeuronJ plugin			http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
ImageJ software			http://rsbweb.nih.gov/ij/
Bonfire program			http://lifesci.rutgers.edu/~firestein
NeuronStudio			http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
MatLab Program	Mathworks