Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un programma per computer per analizzare la morfologia neuronale. In combinazione con due strumenti source aperta esistente analisi, il nostro programma esegue l'analisi Sholl e determina il numero di neuriti, punti di ramificazione, e suggerimenti dei neuriti. Le analisi vengono eseguite in modo che i cambiamenti nella morfologia locale neurite può essere osservato.

Abstract

Morfologia neuronale svolge un ruolo significativo nel determinare come i neuroni e la funzione di comunicare ^1-3. In particolare, colpisce la capacità dei neuroni di ricevere input da altre cellule ² e contribuisce alla propagazione dei potenziali d'azione ^4,5. La morfologia dei neuriti influisce anche come l'informazione viene elaborata. La diversità di morfologie dendrite facilitare segnalazione locale e lungo raggio e consentire neuroni singoli o gruppi di neuroni per svolgere funzioni specializzate all'interno della rete neuronale ^6,7. Alterazioni nella morfologia dendrite, anche la frammentazione dei dendriti e cambiamenti ramificazione modelli, sono stati osservati in un certo numero di stati patologici, tra cui il morbo di Alzheimer ^{8, 9,10} schizofrenia e ritardo mentale ^11. La capacità di comprendere sia i fattori che determinano morfologie dendrite e per identificare i cambiamenti nella morfologia dendrite è essenziale per la comprensione della funzione del sistema nervoso e disfunzioni.

Morfologia dei neuriti è spesso analizzata mediante l'analisi Sholl e contando il numero di neuriti e il numero di punte ramo. Questa analisi è generalmente applicata a dendriti, ma può anche essere applicato a assoni. L'esecuzione di questa analisi a mano sia in termini di tempo e introduce inevitabilmente variabilità a causa di pregiudizi sperimentatore e incoerenza. Il programma Falò è un approccio semi-automatico per l'analisi dei dendriti e degli assoni morfologia che si basa su disposizione strumenti open-source l'analisi morfologica. Il nostro programma permette il rilevamento di cambiamenti locali in dendriti e degli assoni ramificazione comportamenti effettuando analisi Sholl in subregioni del pergolato neuritiche. Per esempio, l'analisi Sholl viene eseguita su entrambi i neuroni nel suo complesso così come su ogni sottoinsieme di processi (primari, secondari, terminale, radice, ecc) Dendrite e patterning assone è influenzato da una serie di fattori intracellulari ed extracellulari, molti agire localmente. Così, la morfologia pergolato risultante è il risultato di processi specifici che agiscono per neuriti specifici, rendendo necessario effettuare analisi morfologica su scala minore, allo scopo di osservare queste variazioni locali ^12.

Il programma Falò richiede l'utilizzo di due strumenti open-source di analisi, il plugin di ImageJ NeuronJ e NeuronStudio. I neuroni sono tracciati in ImageJ, e NeuronStudio viene utilizzato per definire la connettività tra neuriti. Falò contiene una serie di script personalizzati scritti in Matlab (MathWorks) che vengono utilizzati per convertire i dati nel formato appropriato per ulteriori analisi, controllare gli errori degli utenti e, infine, effettuare analisi Sholl. Infine, i dati vengono esportati in Excel per l'analisi statistica. Un diagramma di flusso del programma Falò è mostrata in Figura 1.

Protocollo

1. Prima di iniziare:

1) E18 dissezione ratto:

Metodi dissezione standard di E18 neuroni dell'ippocampo sono state precedentemente descritte ^13. Per poter utilizzare il programma Falò di analizzare le caratteristiche morfologiche dei neuriti, 8 bit. Immagini tif dei singoli neuroni deve essere ottenuto. Questo può essere ottenuto in vari modi a seconda del protocollo sperimentale che si stanno seguendo. I neuroni possono essere placcati con una densità abbastanza basso in modo che singoli neuroni appaiono nel campo ottico. In alternativa, per i neuroni singola immagine che sono cresciuti in una cultura denso, i neuroni possono essere transfettate con una varietà di metodi di trasfezione con un plasmide codifica una proteina fluorescente.

2) Requisiti e installazione del software:

1. Il plugin NeuronJ per il software ImageJ dal NIH e NeuronStudio devono essere entrambi installati in modo da eseguire il programma Falò. I pacchetti software possono essere trovati attraverso i seguenti siti:
   ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
   NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
   NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
2. Il programma Falò è disponibile all'indirizzo http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein. Il manuale utente falò è disponibile anche su questo sito. Inoltre, la descrizione iniziale del falò si trovano in Langhammer et al, Citometria 2010. Tutti i nostri dati sono stati analizzati utilizzando un sistema operativo Windows.

3) Regolazione immagine Risoluzione:

Avrete bisogno di modificare il programma Falò in base alla risoluzione delle immagini che si desidera analizzare. Nella parte bonfire_parameters del programma Falò, sostituire il valore corrente per la pix_conv variabile con il valore della risoluzione dell'immagine (micron / pixel) delle immagini.

2. Struttura del file:

Al fine di falò per analizzare i dati, i file devono essere organizzati in questa struttura specifica (Figura 2). Si avrà:

• Un maestro cartella
• Sotto-cartelle (contenenti ciascuna delle vostre condizioni diverse)
• File di immagine delle cellule (file filename.tif) contenuti nelle cartelle condizioni diverse
• Una cartella contenente i falò falò Matlab mfiles (anche contenuti nella cartella principale)

3. I neuroni Tracing in NeuronJ:

1. Preparare l'immagine per il tracciamento
   1. Aprire l'immagine selezionando il pulsante 'Apri' sulla barra degli strumenti NeuronJ e selezionando l'immagine che si desidera tracciare.
   2. Ridimensionare l'immagine selezionando il pulsante 'massimizzare'.
   3. Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine in modo da poter visualizzare tutti i neuriti, selezionando 'Immagine' sulla barra degli strumenti NeuronJ quindi selezionando 'Regolare la luminosità / contrasto'.
2. Traccia il corpo cellulare in NeuronJ e identificare la traccia come 'Tipo 06'
   1. Selezionare il pulsante 'Aggiungi Tracce' sulla barra degli strumenti NeuronJ.
   2. Tracciare il perimetro del corpo cellulare.
   3. Selezionare il pulsante 'tracciati etichetta' sulla barra degli strumenti NeuronJ.
   4. Selezionare 'N1' dal 'Tracing ID' menu a discesa.
   5. 'Tipo 06' Seleziona nella NeuronJ: Attributi finestra e selezionare 'OK'.
3. Tracciare la neuriti in NeuronJ
   1. Selezionare il pulsante 'Aggiungi Tracce' sulla barra degli strumenti NeuronJ.
   2. Aggiungere una traccia lungo ogni ramo dei neuriti. È possibile selezionare solo i dendriti o l'assone, a seconda del vostro esperimento.
   3. Suggeriamo che i segmenti di disegnare fermarsi in ogni punto di diramazione, con ogni punto di diramazione figlia a partire da quel punto come una nuova traccia.
   4. Selezionare il pulsante 'Salva tracciati' sulla barra degli strumenti NeuronJ.
   5. Salva il tracciato che avete appena creato nella stessa cartella del file immagine originale.
4. Esportare il file di traccia e il file identificativo da traccia NeuronJ
   Due tipi di file devono essere esportati da NeuronJ e salvati nelle cartelle appropriate condizioni insieme al. Tif e file. Ndf.
   1. Selezionare il pulsante 'Trace Export' sulla barra degli strumenti NeuronJ.
   2. Selezionare la "Scheda-deliminated file di testo: file separato per 'opzione sul' ogni tracciamento NeuronJ: Export 'finestra di dialogo e selezionare' OK '.
   3. Lasciare NeuronJ di scegliere i nomi dei file e la posizione di salvataggio.
   4. Selezionare il pulsante 'tracciati misura' sulla barra degli strumenti NeuronJ.
   5. Selezionate l'opzione 'misure di visualizzazione tracing' sul 'NeuronJ: Misure' finestra e selezionare 'Esegui'.
   6. 'File' selezionare nel 'NeuronJ: tracciati' finestra.
   7. Selezionare 'Save As' e salvare il file come Filename_info. 'Filename' deve corrispondere esattamente al nome del file immagine originale (tra cui capitalizzazione), seguita da _info e non devono contenere un 3-lettera di file-extension. Ad esempio, per Cell20.tif nome originale dell'immagine, questo file dovrebbe essere chiamato 'Cell20_info'. Controllare che il computer non aggiunge automaticamente un file. Xls file con estensione. In caso affermativo, l'estensione del file deve essere cancellata manualmente.

4. Usa falò per costruire file SWC preliminari di dati NeuronJ.:

1. Riorganizzare le cartelle utilizzando 'bonfire_load'
   1. Matlab aperto con un doppio clic sull'icona.
   2. Fare clic sul pulsante '' in alto a destra della finestra di comando.
   3. Selezionare la cartella 'Falò' nella cartella principale del 'Sfoglia per cartelle' finestra.
   4. Tipo 'bonfire_load' nella finestra di comando Matlab e premere invio.
   5. Selezionare la cartella condizione che si desidera analizzare nel 'Sfoglia per cartelle' finestra e selezionare 'OK'.
   6. Questo riorganizzare la struttura delle cartelle con la creazione di cellule sotto-cartelle contenenti tutti i dati per ogni singola cellula.
2. Creare file filename_prelim.swc usando 'bonfire_ndf2swc'
   1. Tipo 'bonfire_ndf2swc' nella finestra di comando e premere invio.
   2. Selezionare la cartella stessa condizione che hai appena riorganizzato con 'bonfire_load' nel 'Sfoglia per cartelle' finestra e selezionare 'OK'.
   3. Questo creerà un file. SWC in ogni cartella cella per la condizione scelta. Ogni cartella cellula ora contiene 5 file;. All'originale immagine tif, il file NDF, il _info file di identificatore di traccia, un file txt e un file SWC....

5. Usa NeuronStudio per finalizzare file SWC.:

1. Aprire e calibrare le immagini neurone in NeuronStudio
   1. Aprire il programma NeuronStudio.
   2. Selezionare File → Apri sulla barra degli strumenti NeuronStudio.
   3. Trova l'. Immagine tif del neurone che si desidera modificare e aprirlo.
   4. Selezionare Impostazioni → Esegui e digitare '1 'in ciascuno dei 3 (X, Y, Z) caselle nella' finestra Dimensione Voxel '.
   5. Selezionare File → Importa SWC. Selezionare il file. SWC. Il file immagine sarà ora sovrapposti con un'immagine traccia. Il soma cellulare dovrebbe essere ricoperto con un cerchio rosso.
2. Usa NeuronStudio per neuriti collegamento
   1. Utilizzare gli strumenti in NeuronStudio di identificare correttamente i punti filiali e punti finali (si consiglia di familiarizzare con le caratteristiche NeuronStudio e scorciatoie prima di analizzare i dati).
   2. In particolare, utilizzare lo 'strumento neurite' di unirsi nodi in modo che:
      • Ogni punto di diramazione (nodi giallo) non può che creare due rami
      • Tutte le tracce sono in continuità con il soma (un solo nodo rosso)
3. Esportare dati da NeuronStudio
   1. Selezionare File → Salva neuriti (salvo il nome predefinito).
4. Verificare la presenza di errori nei file. SWC usando 'bonfire_trace_check'
   1. 'Bonfire_trace_check' digita nella finestra di comando Mathlab e premere invio.
   2. Selezionare la cartella condizione che contiene i dati che avete appena trattati nel 'Sfoglia per cartelle' finestra e selezionare 'OK'.
   3. Se ci sono errori in una delle immagini presenti nella cartella del programma di uscita visualizzare immagini in cui l'errore si trova.
   4. Correzione degli errori in NeuronStudio
      1. Aprire il file immagine salvato nel passaggio di esportazione.
      2. Individuare e risolvere il problema (s).
      3. Fare clic su File → Salva neuriti.
      4. Ripetere l'operazione per altre immagini che devono essere corretti.
      5. Rieseguire 'bonfire_trace_check' (5,4).

6. Usare 'falò' per estrarre i dati morfologici da file SWC.:

1. 'Falò' digita nella finestra di comando e premere invio.
2. Selezionare la cartella condizione che contiene i dati da analizzare nel 'Sfoglia per cartelle' finestra e selezionare 'OK'.
3. L'analisi falò genererà una finestra per ogni dei neuroni in fase di analisi, i grafici in cui la morfologia neuronale insieme con gli anelli Sholl utilizzati nell'analisi. Inoltre, il comando 'falò' genera il. Tappeto file che contiene tutte le informazioni morfologiche che è stato tolto l'analisi.

7. Usare 'bonfire_results' per visualizzare i dati:

1. Tipo 'bonfire_results' nella finestra di comando Matlab.
2. Selezionare la cartella condizione per la condizione che si desidera visualizzare nella 'Sfoglia per cartelle' finestra e selezionare 'OK'.
3. Il 'Sfoglia per cartelle' finestra si chiude temporaneamente e riaprire, che consente di selezionare le condizioni aggiuntive che si desidera visualizzare.
4. Quando si è terminata la selezione delle cartelle condizione, selezionare 'Annulla' per uscire dal processo di selezione.
5. 'Bonfire_results' restituirà grafici sintesi tra °dati e dalle cartelle condizione selezionata.

8. Usare 'bonfire_export' esportare i dati in Excel:

1. Tipo 'bonfire_export' nella finestra di comando.
2. Selezionare la cartella condizione che contiene i dati che si desidera esportare nella 'Sfoglia per cartelle' finestra e selezionare 'OK'. Bonfire_export creerà i file di Excel dei dati morfologici e li collocherà nella cartella condizione che è stata selezionata.

9. Rappresentante dei risultati:

Un esempio di dati generati dal programma Falò su un set di dati contenente due condizioni è mostrata in Figura 3. In questo esempio, condizione 1 neuroni contengono più neuriti distale al corpo cellulare. Questo fenomeno può essere osservato nelle immagini di esempio (Figura 3B), così come nella curva Sholl del dendritiche pergolato totale (Figura 3A) e nel grafico del numero di punti terminali (Figura 3C). Inoltre, poiché il programma Falò esegue anche l'analisi Sholl in subregioni delle immagini, siamo in grado di identificare più precisamente l'identità dei neuriti, che sono aumentati. Sia il numero totale delle intersezioni di 3 ^° ordine o superiore neuriti (Fig. 3F) e il numero totale di entrambi intermediario e neuriti terminale (Figura 3G) sono aumentati distale al corpo cellulare. Queste tendenze possono anche essere osservati nelle figure 3D e 3E.

Figura 1:. Diagramma di flusso del programma Falò neuroni sono tracciate con ImageJ. I dati vengono poi esportati e convertiti dal programma Falò in file SWC preliminari.. NeuronStudio viene utilizzato per definire la connettività dei neuriti. Controlli falò per gli errori e poi calcola le curve Sholl, il numero dei primari, neuriti ordine secondario e superiore, e il numero di punti di ramificazione e suggerimenti dei neuriti. Infine, i dati vengono esportati in Excel per l'analisi statistica.

Figura 2: Struttura dei file necessari per l'analisi dei falò La struttura del file deve corrispondere a questo o il programma non funzionerà correttamente.. I nomi delle cartelle e dei file e la quantità delle cartelle e dei file possono essere cambiati.

Figura 3: Esempio di dati in uscita dal programma Falò A) curve Sholl Totale.. B) Esempio invertita immagini di entrambe le condizioni. C) Numero medio di punti di ramificazione e delle estremità / cell. D) Numero medio di processi / cella per primaria, secondaria e terziaria o superiore neuriti. E) Numero medio di processi / cella per root, intermedio e neuriti terminale. F) l'identità specifica del segmento curve di analisi Sholl. Segmenti sono raggruppati come primario, secondario o terziario o superiore. G) l'identità specifica del segmento curve di analisi Sholl. Segmenti sono raggruppati come segmenti di root, segmenti intermedi, o segmenti terminali.

Discussione

Il programma Falò è un programma semi-automatico per l'analisi dei dendriti e degli assoni morfologia. Aumenta notevolmente l'efficienza e l'accuratezza delle analisi Sholl oltre eseguendo l'analisi manualmente. Inoltre, il programma Falò salva i dati in ogni fase del processo, permettendo di controllare i dati e di verificare l'accuratezza dell'analisi. Pertanto, il compito di analisi dei dati possono essere distribuiti a numerosi individui senza compromettere la precisione. Infine, effettuan...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NeuronJ plugin			http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
ImageJ software			http://rsbweb.nih.gov/ij/
Bonfire program			http://lifesci.rutgers.edu/~firestein
NeuronStudio			http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
MatLab Program	Mathworks