ניתוח אוטומטי של מורפולוגיה Sholl העצבית סרוקים בקני מידה מרובים

Summary

פיתחנו תוכנת מחשב לנתח מורפולוגיה עצביים. בשילוב עם שני כלים הקיימים ניתוח קוד פתוח, התוכנית שלנו מבצעת ניתוח Sholl וקובע את מספר neurites, נקודות הסניף, וטיפים neurite. הניתוחים מבוצעים כך שינויים מקומיים במורפולוגיה neurite ניתן לצפות.

Abstract

מורפולוגיה העצבית ממלאת תפקיד משמעותי בקביעת כיצד נוירונים לתפקד ולתקשר ^1-3. באופן ספציפי, זה משפיע על היכולת של נוירונים לקבל כניסות מ ² תאים אחרים ותורם להפצת הפוטנציאלים פעולה ^4,5. המורפולוגיה של neurites גם משפיע על אופן מידע מעובד. המגוון של מורפולוגיות דנדריט להקל איתות מגוון המקומי ארוכה ולאפשר נוירונים בודדים או קבוצות נוירונים לבצע פונקציות מיוחדות בתוך הרשת העצבית ^6,7. שינויים במורפולוגיה דנדריט, כולל פיצול של דנדריטים שינויים בדפוסי הסתעפות, נצפו כמה מדינות המחלה, כולל מחלת אלצהיימר ^8, סכיזופרניה ^9,10, ופיגור שכלי ^11. היכולת הן להבין את הגורמים המעצבים את מורפולוגיות דנדריט ולזהות שינויים מורפולוגיות דנדריט חיונית להבנת תפקוד מערכת העצבים בתפקוד.

מורפולוגיה Neurite מנותח לעתים קרובות על ידי ניתוח Sholl ועל ידי ספירת neurites ומספר טיפים הסניף. ניתוח זה מיושם בדרך כלל דנדריטים, אבל זה יכול להיות מיושם גם אקסונים. ביצוע הניתוח הזה ביד היא גם זמן רב ובסופו של דבר מציג השתנות עקב ההטיה הניסוי ואת חוסר העקביות. התוכנית מדורה היא גישה חצי אוטומטיות ניתוח של דנדריט ומורפולוגיה האקסון שבונה על קוד פתוח כלים זמינים ניתוח מורפולוגי. התוכנית שלנו מאפשרת זיהוי של שינויים מקומיים דנדריט ו האקסון הסתעפות התנהגויות על ידי ביצוע ניתוח Sholl על אזורי המשנה של סוכת מדלקת עצבים. לדוגמה, ניתוח Sholl מבוצע על הנוירון הן כולה, כמו גם על כל תת קבוצה של תהליכים (יסודי, תיכון, מסוף שורש וכו ') דנדריט ו דפוסים האקסון מושפעת ממספר גורמים תאיים תאית, רבים משחק מקומי. לפיכך, מורפולוגיה סוכת וכתוצאה מכך הוא תוצאה של תהליכים ספציפיים פועל neurites ספציפיים, מה שהופך אותו צורך לבצע ניתוח מורפולוגי בקנה מידה קטן יותר על מנת לבחון אלו וריאציות מקומיות ^12.

התוכנית מדורה מחייב שימוש של שני קוד פתוח כלי ניתוח, את התוסף NeuronJ כדי ImageJ ו NeuronStudio. נוירונים הם התחקה ImageJ ו NeuronStudio משמש כדי להגדיר את הקישוריות בין neurites. מדורה מכיל מספר סקריפטים מותאמים אישית נכתב MATLAB (MathWorks) המשמשים כדי להמיר את הנתונים לפורמט המתאים לניתוח נוסף, לבדוק שגיאות המשתמש, ובסופו של דבר לבצע ניתוח Sholl. לבסוף, נתונים מיוצאים לתוך Excel לניתוח סטטיסטי. תרשים זרימה של התוכנית מדורה מוצג באיור 1.

Protocol

1. לפני שתתחיל:

1) E18 לנתיחה חולדה:

שיטות לנתיחה האחיד של E18 נוירונים בהיפוקמפוס בעבר תיאר ^13. כדי להשתמש בתוכנית מדורה כדי לנתח את המאפיינים המורפולוגיים של neurites, 8 סיביות. Tif תמונות של נוירונים בודדים יש לקבל. ניתן להשיג זאת במספר דרכים בהתאם לפרוטוקול הניסוי אתה הבאים. נוירונים יכול להיות מצופה בצפיפות נמוכה מספיק כדי נוירונים בודדים מופיעים בתחום מיקרוסקופ. לחלופין, כדי נוירונים תמונה בנפרד, כי הם גדלו בתרבות צפופה, נוירונים ניתן transfected באמצעות מגוון של שיטות transfection בקידוד פלסמיד חלבון פלואורסצנטי.

2) תוכנה דרישות התקנה:

1. התוסף NeuronJ עבור התוכנה ImageJ מ NIH ו NeuronStudio חייב גם להיות מותקן על מנת להפעיל את התוכנית מדורה. חבילות התוכנה ניתן למצוא בכתובת האינטרנט הבאים:
   ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
   NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
   NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
2. התוכנית מדורה ניתן למצוא בכתובת http://lifesci.rutgers.edu/ ~ firestein. הוראות שימוש מדורה זמין גם באתר זה. בנוסף, התיאור הראשוני של מדורה ניתן למצוא Langhammer et al, 2010 cytometry. כל הנתונים שלנו כבר נותחו באמצעות מערכת ההפעלה Windows.

3) התאמת רזולוציית תמונה:

יהיה עליך להתאים את תוכנית מדורה על בסיס החלטה דמותו של התמונות שאתם רוצים לנתח. בחלק bonfire_parameters התוכנית מדורה, להחליף את הערך הנוכחי של pix_conv המשתנה עם הערך של ההחלטה התמונה (מיקרומטר / פיקסל) של התמונות שלך.

2. מבנה קובץ:

על מנת מדורה כדי לנתח את הנתונים, הקבצים חייב להיות מאורגן במבנה הספציפי הזה (איור 2). יהיה לך:

• תיקיית אב
• תת תיקיות (המכילות כל אחת בתנאים שונים שלך)
• תמונת תא קבצים (קבצים filename.tif) הנכלל התיקיות מצב שונה
• התיקייה המכילה את Matlab מדורה מדורה mfiles (הכלול גם בתיקיית אב)

3. נוירונים Tracing ב NeuronJ:

1. הכן את התמונה התחקות
   1. פתח את התמונה על ידי בחירת כפתור "פתח" בסרגל הכלים ובחירת NeuronJ את התמונה שאתה רוצה עקבות.
   2. לשנות את גודל התמונה על ידי בחירת "למקסם" כפתור.
   3. התאם את הבהירות והניגודיות של התמונה, כך שאתה יכול לדמיין את כל neurites על ידי בחירת "תמונה" בסרגל הכלים NeuronJ מכן בחירה "כוונן בהירות / ניגודיות".
2. עקוב אחר בגוף התא NeuronJ ולזהות את עקבות כמו להיות "סוג 06"
   1. בחר כפתור "הוסף עקבות" בסרגל הכלים NeuronJ.
   2. עקוב אחר מסביב לגוף התא.
   3. בחר כפתור 'העתקים לייבל' בסרגל הכלים NeuronJ.
   4. בחר "N1 'מן האיתור מזהה" התפריט הנפתח.
   5. "סוג 06" בחר את NeuronJ: תכונות החלון ובחר 'אישור'.
3. עקוב אחר neurites ב NeuronJ
   1. בחר כפתור "הוסף עקבות" בסרגל הכלים NeuronJ.
   2. הוסף עקבות לאורך כל ענף neurite. אתה יכול לבחור רק את דנדריטים או האקסון, תלוי בניסוי.
   3. אנו מציעים כי חלקים שאתה מצייר לעצור בכל נקודת הסתעפות, עם כל נקודה סניף בת החל בנקודה זו כמו זכר חדש.
   4. בחר הלחצן 'שמור העתקים "בסרגל הכלים NeuronJ.
   5. שמור את התחקות שיצרת רק באותה תיקייה כמו קובץ התמונה המקורי.
4. ייצוא קבצים עקבות ואת הקובץ מזהה עקבות מן NeuronJ
   שני סוגים של קבצים צריך להיות מיוצא מן NeuronJ והציל בתיקיות מצב המתאים יחד עם. טיף. קבצים NDF.
   1. בחר בלחצן 'ייצוא Trace "בסרגל הכלים NeuronJ.
   2. בחר את "Tab-deliminated טקסט קבצים: קובץ נפרד עבור 'אפשרות ב' כל התחקות NeuronJ: ייצוא" תיבת דיאלוג ובחר 'אישור'.
   3. אפשר NeuronJ לבחור את שמות הקבצים ואת המיקום לשמור.
   4. בחר כפתור 'העתקים מדוד "בסרגל הכלים NeuronJ.
   5. בחר באפשרות "תצוגה מדידות מעקב" על "NeuronJ: מדידות" חלון ובחר "הפעל".
   6. בחר 'קובץ' ב' NeuronJ: העתקים "חלון.
   7. בחר "שמירה בשם" ושמור את הקובץ כפי filename_info. "שם הקובץ" חייב להתאים בדיוק את שמו של קובץ התמונה המקורי (כולל היוון) ואחריו _info ולא להכיל 3 אותיות קובץ סיומת. לדוגמה, עבור Cell20.tif התמונה המקורית שם, זה יהיה קובץ בשם 'Cell20_info ". בדוק כי המחשב אינו אוטומטי להוסיף סיומת. Xls הקובץ. אם כן, סיומת הקובץ יש למחוק ידנית.

4. השתמש מדורה לבנות קבצים swc ראשוני של נתונים NeuronJ.:

1. ארגון מחדש של תיקיות באמצעות 'bonfire_load "
   1. פתח Matlab על ידי לחיצה כפולה על הסמל.
   2. לחץ על הכפתור 'בפינה הימנית העליונה של חלון הפקודה.
   3. בחר את "מדורה" בתיקיית המאסטר שלכם ב 'עיון עבור תיקייה "חלון.
   4. סוג "bonfire_load" לתוך חלון הפקודה Matlab ולחצו אנטר.
   5. בחר את תיקיית מצב שאתם רוצים לנתח "עיון עבור תיקייה" החלון ובחר 'אישור'.
   6. זה יהיה לארגן מחדש את מבנה התיקיות על ידי יצירת תא תיקיות משנה המכיל את כל הנתונים עבור כל תא יחיד.
2. יצירת קבצים filename_prelim.swc באמצעות "bonfire_ndf2swc"
   1. "Bonfire_ndf2swc 'סוג לתוך חלון הפקודה והקש ENTER.
   2. בחר את התיקייה מחדש את אותו מצב רק עם "bonfire_load 'ב' עיון עבור תיקייה" החלון ובחר 'אישור'.
   3. פעולה זו תיצור קובץ. Swc בכל תיקייה התא למצב הנבחר. כל תיקייה תא כעת מכילים 5 קבצים,. המקורית tif תמונה, קובץ NDF, קובץ _info מזהה עקבות, קובץ txt וקובץ swc....

5. השתמש NeuronStudio כדי לסיים קבצים swc.:

1. פתח לכייל תמונות נוירון NeuronStudio
   1. פתח את התוכנית NeuronStudio.
   2. בחר קובץ → פתח בסרגל הכלים NeuronStudio.
   3. מצא את. Tif תמונה של הנוירון שברצונך לערוך ולפתוח אותו.
   4. בחר הפעלה → הגדרות ולהיכנס '1 'לתוך כל אחד 3 (X, Y, Z) תיבות ב' גודל חלון "Voxel.
   5. בחר קובץ → SWC ייבוא. בחר את הקובץ המתאים. Swc. קובץ התמונה עכשיו יהיה ועליהן תמונת עקבות. סומה התא צריך להיות מעולף עם עיגול אדום.
2. השתמש NeuronStudio כדי neurites הקישור
   1. השתמש בכלים NeuronStudio לזהות נכונה נקודות הסניף נקודות קצה (מומלץ להכיר את התכונות של NeuronStudio וקיצורי לפני ניתוח הנתונים).
   2. באופן ספציפי, להשתמש "כלי neurite" להצטרף צמתים כך:
      • כל נקודת הסניף (בלוטות צהוב) יכול רק ליצור שני סניפים
      • עקבות כל רציף עם סומה (רק אחד הצומת באדום)
3. ייצוא נתונים NeuronStudio
   1. בחר → קובץ Neurites שמור (Save As שם ברירת המחדל).
4. בדוק שגיאות. Swc קבצים באמצעות "bonfire_trace_check"
   1. "Bonfire_trace_check 'סוג לתוך חלון הפקודה Mathlab ולחצו אנטר.
   2. בחר את התיקייה המכילה את נתוני מצב יש לך מעובד רק "עיון עבור תיקייה" החלון ובחר 'אישור'.
   3. אם יש טעויות כל התמונות בתיקייה פלט התוכנית יהיה הצגת תמונות איפה השגיאה נמצאת.
   4. תיקון שגיאות NeuronStudio
      1. פתח את קובץ התמונה ששמרת בשלב המייצאת.
      2. אתר לתקן את הבעיה (ים).
      3. לחץ על קובץ → שמור Neurites.
      4. חזור לתמונות אחרות, כי צריך להיות קבוע.
      5. הרצה חוזרת "bonfire_trace_check '(5.4).

6. השתמש "מדורה" כדי לחלץ נתונים מורפולוגי מקבצים swc.:

1. "מדורה" סוג לתוך חלון הפקודה והקש ENTER.
2. בחר את תיקיית מצב המכיל את הנתונים שברצונך לנתח ב 'עיון עבור תיקייה "החלון ובחר' אישור '.
3. ניתוח מדורה תיצור חלון עבור כל הנוירונים להיות מנותח, בו גרפים את המורפולוגיה העצבית יחד עם טבעות Sholl השתמשו בניתוח. בנוסף, הפקודה "מדורה" יפיק את הקובץ. מחצלת המכיל את כל המידע המורפולוגי אשר נלקח מן הניתוח.

7. השתמש ב 'bonfire_results "כדי להציג את הנתונים:

1. סוג "bonfire_results" לתוך חלון הפקודה Matlab.
2. בחר את התיקייה תנאי בתנאי שאתה רוצה לצפות ב 'עיון עבור תיקייה "החלון ובחר' אישור '.
3. "עיון עבור תיקייה" חלון ייסגר באופן זמני לפתוח מחדש, ומאפשר לך לבחור תנאים נוספים ברצונכם להציג.
4. כשתסיים לבחור תיקיות תנאי, בחר 'ביטול' כדי לצאת את תהליך הבחירה.
5. "Bonfire_results" יחזיר תרשימי סיכום כולל הנתונים אלקטרוני מתיקיות מצב שבחרת.

8. השתמש ב 'bonfire_export' כדי לייצא את הנתונים ל-Excel:

1. סוג "bonfire_export" לתוך חלון הפקודה.
2. בחר את התיקייה המכילה את נתוני מצב אתה רוצה לייצא "עיון עבור תיקייה" החלון ובחר 'אישור'. Bonfire_export תיצור קבצי Excel של נתונים מורפולוגיים יהיה למקם אותם בתיקייה בתנאי נבחר.

9. נציג תוצאות:

דוגמה של הנתונים המופקים על ידי התוכנית מדורה על ערכת נתונים המכיל שני תנאים מוצג באיור 3. בדוגמה זו, 1 מצב הנוירונים מכילים neurites יותר דיסטלי אל גוף התא. תופעה זו ניתן לראות את התמונות למשל (איור 3B) וכן עקומת Sholl של הדנדריטים סוכת הכולל (איור 3A) ו בגרף של מספר הנקודות מסוף (איור 3 ג). בנוסף, מאחר שהתוכנית מדורה גם מבצעת ניתוח Sholl על אזורי המשנה של התמונות, אנו מסוגלים לזהות באופן ספציפי יותר את זהותו של neurites כי גדלו. גם את המספר הכולל של צמתים של הסדר 3 ^rd neurites או יותר (איור 3F) ואת המספר הכולל של מתווך והן neurites מסוף (איור 3G) גדל דיסטלי אל גוף התא. מגמות אלו יכולים גם להיות שנצפתה דמויות 3D ו 3E.

איור 1:. תרשים זרימה של התוכנית מדורה נוירונים הם איתר באמצעות ImageJ. הנתונים מיוצאים אז המרה על ידי התוכנית מדורה לתוך קבצי swc ראשונית.. NeuronStudio משמש כדי להגדיר את הקישוריות של neurites. צ'קים מדורה שגיאות ולאחר מכן מחשב עקומות Sholl, מספר, neurites העיקרי סדר משני, גבוה יותר, מספר הנקודות הסניף טיפים neurite. לבסוף, הנתונים מיוצאים Excel לניתוח סטטיסטי.

איור 2: מבנה קובץ הנדרש לניתוח המדורה מבנה קובץ זה או חייבים להתאים את התוכנית לא תפעל כהלכה.. שמות התיקיות והקבצים ואת כמות התיקיות והקבצים ניתנים לשינוי.

איור 3: פלט דוגמה נתונים מתוכנית מדורה) עקומות Sholl סה"כ.. ב) דוגמה הפוכה תמונות של שני המצבים. ג) ממוצע נקודות הסניף נקודות מסוף / התא. ד) מספר ממוצע של תהליכים / התא הראשוני, משני, שלישוני או יותר neurites. E) ממוצע של תהליכים / תא עבור שורש, בינוני, neurites סופנית. F) זהות ספציפית במגזר ניתוח עקומות Sholl. מגזרי מקובצים כמו העיקרי, משנית או שלישונית או יותר. ז) זהות ספציפית במגזר ניתוח עקומות Sholl. מגזרי מקובצים כמו מגזרים שורש, קטעי ביניים, או קטעי סופנית.

Discussion

התוכנית היא תוכנית מדורה חצי אוטומטי לניתוח דנדריט ומורפולוגיה האקסון. זה מגדיל מאוד את היעילות ואת הדיוק של ניתוח Sholl על ביצוע ניתוח באופן ידני. בנוסף, התוכנית מדורה שומר את הנתונים בכל שלב של התהליך, כך שניתן הביקורת את הנתונים כדי לזהות את הדיוק של הניתוח. לכן, המשי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NeuronJ plugin			http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
ImageJ software			http://rsbweb.nih.gov/ij/
Bonfire program			http://lifesci.rutgers.edu/~firestein
NeuronStudio			http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
MatLab Program	Mathworks