Preparación y Cultura de rebanadas de pollo tronco cerebral auditivo

Resumen

El tronco cerebral auditivo pollo se compone de los núcleos responsables de procesamiento de sonido binaural. Una preparación simple corte coronal mantiene el circuito completo, mientras que el enfoque de cultivo proporciona una preparación única para estudiar el desarrollo de la estructura neuronal y la función auditiva en los niveles molecular, celular y de red.

Resumen

El tronco cerebral auditivo de pollo es un modelo de sistema bien establecido que ha sido ampliamente utilizado para estudiar la anatomía y la fisiología del procesamiento auditivo en los períodos discretos de desarrollo ^4.1, así como los mecanismos de codificación temporal en el sistema central nervioso ^7.5.

Aquí presentamos un método para preparar el pollo rodajas del tronco cerebral auditivo que puede ser utilizado para la aguda procedimientos experimentales o rodajas de cultivo organotípico a largo plazo de las manipulaciones experimentales.

El tronco cerebral auditivo pollo se compone de angularis núcleo magnocelular de oliva, laminaris y superior. Estos núcleos son los responsables de procesamiento de sonido binaural y solo los preparativos corte coronal preservar el circuito entero. En última instancia, cultivos organotípicos rebanada puede proporcionar la oportunidad de manipular varios parámetros de desarrollo, tales como la actividad sináptica, la expresión de los componentes de pre y post-sináptica, la expresión de la excitabilidad de los aspectos de control y la expresión diferencial de genes

Este enfoque puede ser utilizado para ampliar el conocimiento general sobre el desarrollo de circuitos neuronales, el refinamiento y la maduración.

Protocolo

1. Preparación de la zona de disección

1. Continuamente burbuja artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF) con una mezcla de 95% O ₂ / 5% de CO ₂ (pH entre 7.2-7.4, la osmolaridad 295-310 mOsm / l).
2. Mientras ACSF es burbujeante, limpia la zona de trabajo con un 70% EtOH. También limpiar el vibratome y la hoja de cortar. Enjuagar la cuchilla con agua destilada (dH ₂ O).
3. Lugar almohadilla limpia la absorción de líquidos en el área de disección con instrumentos adecuados de disección.
4. Pegamento de bloques de agar (40 mg de agarosa / ml, es decir, un 4%, en dH ₂ O) a la etapa de una cámara de vibratome-compartido *.
   * Sugerencia: preparar agar antes de la disección. Tienda de pre-hechos agar dentro de una caja de Petri en el refrigerador. Agarosa comprado a Merck Chemicals o Invitrogen.

2. Preparación de placas de 6 pocillos con medio de cultivo

1. Bajo una campana estéril, llenar un pozo al animal de una placa de 6 pocillos con 1 ml de medio de cultivo y se incuba a 35 ° C y 5% CO _2.
2. Prepare como muchas inserciones membrana cultura según sea necesario y colocarlos en la campana para su uso posterior.

3. El aislamiento de tronco cerebral auditivo pollo

1. Lugar de huevo en una fuente brillante de luz para determinar el vacío del espacio aéreo lleno de los embriones (por lo general la gran parte de los huevos).
2. Romper la gran parte de la exposición de membrana del saco de huevos. Hacen parte de la membrana del saco con bisturí y retire suavemente la cabeza del embrión de pollo.
3. Rápidamente decapitar a la cabeza con unas tijeras.
4. Coloque la punta de la cuchilla de afeitar ligeramente posterior y entre los ojos. Haga una incisión rostral-caudal a través del cráneo aplicando una ligera presión *.
   * Consejo: la presión aplicada depende de la edad del embrión (es decir, más joven = menos = más mayores)
5. Empuje suavemente a un lado la piel y las plumas para exponer el cráneo y verificar corte medio.
6. Bloquear porción rostral del cráneo por corte con una cuchilla de afeitar. Hoja de posición por detrás de los ojos y rápidamente cortar a través del cráneo y el tejido del cerebro *.
   * Consejo: una fuerte presión es necesaria para eliminar completamente la sección rostral.
7. Hacer la línea media-lateral con unas tijeras pequeñas incisiones en la región caudal del cráneo, ligeramente por delante de los músculos del cuello visible a ambos lados de la cabeza. Alejarse del cráneo y el tejido para exponer el cerebelo y el cerebro.
8. Retire con cuidado el tronco de la base del cráneo por el corte de tejidos unidos con unas tijeras pequeñas. Una vez que todo el tejido se corta, el tronco encefálico debe moverse libremente fuera del cráneo *.
   * Consejo: puede que tenga que voltear la cabeza (por el cerebro) para cortar el tejido adjunto.

4. Preparación de tronco para cortar

1. Una vez extraído del cráneo, el pin del tronco cerebral a través de la óptica tecta.
2. Eliminar completamente el cerebelo por los pedúnculos suavemente corte con unas tijeras pequeñas, exponiendo el piso del cuarto ventrículo.
3. Eliminar cualquier tejido membranoso y los vasos sanguíneos de la superficie del tronco cerebral con unas pinzas y hacer cortes laterales a través de la óptica tecta para aislar el tronco del encéfalo.
4. Coloque una pequeña cantidad de pegamento en el escenario vibratome frente del bloque de agar (hacia la cuchilla vibratome).
5. Con unas pinzas, suavemente y rápidamente levante el tronco cerebral a la médula espinal y el tejido en el lugar de pegamento con la parte rostral hacia abajo y hacia la cara dorsal de la hoja vibratome *.
   * Consejo: el exceso de pegamento debe ser absorbido con kim-limpia o papel de filtro antes de la etapa siguiente.
6. Vierta suavemente ACSF oxigenada en la etapa de vibratome *.
   * Nota: esta ACSF puede estar continuamente burbujas con O ₂ / CO _2. Sin embargo, la propagación del ACSF en un pequeño volumen de resultados de la solución de los movimientos no deseados (y los posibles daños) a rodajas del tronco cerebral. Si se realiza rápidamente, ya oxigenada ACSF de la disección es suficiente.
7. Hoja Vibratome debe estar en un ángulo de 20-22. Inicio vibratome (oscilación debe fijarse en la amplitud máxima) y se mueven etapa hacia la hoja de manera que la parte superior del tejido es paralela a la hoja antes de cortar.
8. Se mueven rápidamente hacia la hoja de tejido cerebral. Reducir la velocidad considerablemente justo antes de ponerse en contacto con la hoja con el tejido.
9. Comience cortando tejido con movimiento de avance más lento posible. Una vez que toda la sección coronal del tejido, mueva suavemente tajada lejos de la hoja con un cepillo o un vidrio roto, disparó pipeta pulida, en forma en un extremo con una perilla de goma.
10. Inferior etapa de 300-500 micras pasos y cortar de nuevo. Repita el proceso hasta la firma anatómicos son visibles en el tejido cerebral. En este momento, el tejido cerebral rebanada contiene estructuras auditivas de 200-1000 m espesor, dependiendo de la edad de las necesidades de los tejidos y experimental.
11. Mantener cuidadosamente rodajas utilizables en la orden de corte, es decir, la división 1 ^ª representa la región más caudal del circuito (de baja frecuencia de procesamiento de sonido) y el último corte representa la parte más rostral (de alta frecuencia processing) *.
    * Nota: para la colocación de cortes para la cultura, ir a la sección 6. Para in-vitro de almacenamiento fisiología, véase la sección siguiente.

5. Rebanada de almacenamiento de in-vitro Fisiología

1. Dependiendo de la edad del embrión de pollo y el grosor de la loncha, cada animal debe proporcionar 1 a 6 porciones.
2. Con cuidado, coloque las rebanadas individuales en la cámara utilizando una pipeta de vidrio pulido de incendios instalado en un extremo con una perilla de goma. Cámara deben ser numeradas. Coloque sólo una porción por pozo, con el fin de mantener cierto grado de especificidad tonotópica (por ejemplo, el tramo más caudal en la cámara 1 y el corte más rostral en la última cámara). Cámara debe estar lleno de ACSF y continuamente burbujas con una mezcla de 95% O ₂ / 5% CO ₂ (pH 7,4, la osmolaridad 295-310 mOsm / l).
3. Permitir rebanadas para equilibrar mediante la colocación de la cámara en un baño de agua tibia (36 ° C) durante aproximadamente 1 hora.
4. Retire la cámara de baño con agua tibia y dejar reposar a temperatura ambiente durante media hora aproximadamente.
5. Después de una hora y media a temperatura ambiente, las rebanadas se pueden transferir desde la cámara de retención con una cámara de grabación de ~ 0,5 ml montada en un microscopio de experimentos electrofisiológicos.
6. Rebanadas se pueden utilizar hasta a 6 horas después de la eliminación de la bañera caliente.

6. Preparación de las Culturas Cortar organotípicos ⁸

1. Inmediatamente después del procedimiento corte (ver sección 6) rodajas de transferencia con ~ 500 ACSF l utilizando una pipeta de vidrio pulido de incendios instalado en un extremo con una pera de goma para una placa de 48 y en el hielo. Un corte por así *.
   * Consejo: Las rebanadas deben ser de al menos 300 micras y hasta 1000 m de espesor.
2. Después de las rebanadas se han recogido, la transferencia de la placa de 48 pocillos a la campana.
3. Eliminar un 6-así placa que contiene medio de cultivo a cabo de la incubadora y la transferencia a la capilla.
4. Antes de colocar las rebanadas de un solo cerebro en las membranas, coloque una de las inserciones de la membrana preparada (ver sección 2.2) en un pozo con medio de cultivo. Asegúrese de que no hay burbujas de aire debajo de la membrana.
5. Con una pipeta de vidrio, la transferencia de una porción en una gota de ACSF en la membrana de la cultura y eliminar el exceso de ACSF con una micropipeta. Repita el procedimiento para las rebanadas restantes (máximo 4 rebanadas por la membrana) *.
   * Consejo: Asegúrese de que las rodajas no se toquen entre sí y las rodajas de lugar central en la membrana para que no toque el borde de la membrana.
6. Repita este proceso con rodajas de cerebro de que sea necesario *.
   * Consejo: Si las culturas son manipulados en un momento posterior, podría ser ventajoso para limitar la cantidad de las membranas de 3 por 6 y placa para reducir el tiempo de las culturas son retirados de la incubadora.
7. Cambio medio de cultivo tres veces a la semana bajo una campana: Quite medio de edad con un tubo de vacío con una punta estéril, mientras que insertar la membrana se levanta del pozo con un par de pinzas. Añadir 1 ml de medio de cultivo fresco en el pozo, mientras que insertar la membrana se levanta del pozo. Cuando todos los medio se cambia, puesto placa en la incubadora.

7. Los resultados representativos:

Figura 1. Circuitos binaural del tronco cerebral auditivo pollo. (A) Esquema de una sección coronal y (BF) in vitro imágenes trozo del tronco cerebral auditivo pollo. El circuito de (A) muestra entradas excitatorias aferentes del nervio auditivo (AN) al núcleo magnocelular (NM) y el núcleo angularis (NA). NM proyectos bilaterales entradas excitatorias al núcleo laminaris (NL) en ambos lados del tronco cerebral. Una entrada de inhibición de la superior, núcleo olivar (SON) proyectos de NA, NM y NL. Las rebanadas de in-vitro en (BF) son una secuencia de imágenes (200 m cada uno) que va de caudal (B) a rostral (F) del tronco cerebral auditivo de pollo, lo que representa la baja de las regiones de alta frecuencia, respectivamente. Circuito es responsable de la codificación de las propiedades temporales de sonido que se utilizan principalmente para la localización del sonido. Barra de escala en (B) = 500 micras y se aplica a las imágenes de (CF). Las flechas en (D) apuntan a la capa de células del cuerpo único de la Liga Nacional.

Figura 2. Desarrollo normal de las neuronas cultivadas propiedades respuesta fisiológica. Superponen los cambios de voltaje de membrana en respuesta a la hiperpolarización y despolarización medidas actuales de agudos (A & C) y cultivos de tejido en 4 (B) y 7 (D) días de cultivo (DIC). Notar cambios en la hiperpolarización de tensión "hundimiento", fuerte reducción de la corriente hacia el exterior, y de un solo tiro AP que se desarrollan de manera similar en el enfoque de la cultura rebanada comparación con la edad aguda del tejido equivalente. Inyecciones de corriente fueron de 200 ms, a pasos de 50 a 100 pA. PGR fueron entre -55 y -60 mV.

Figura 3. Estructura anatómica de la cultura sliCES. mitad izquierda del tronco cerebral auditivo de pollo E11 después de 7 días en la cultura (DIC). Un anticuerpo contra la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2), que se produce en el soma y las dendritas, se etiqueta de color verde. Un grupo de núcleo magnocelular (NM), las neuronas y sus axones están marcados en rojo a través de la electroporación de un tinte Alexa dextrano. Ambos NM y la línea celular NL son visibles. Ipsilateral terminales de los axones NM se puede ver la proyección de la dorsal dendritas NL (puntas de flecha blanca).

Discusión

Durante varias décadas, la preparación rebanada aguda del tronco del encéfalo de pollo se ha utilizado para el estudio del procesamiento auditivo ^{9, 10.} Este enfoque ha proporcionado una enorme cantidad de datos in-vitro fisiológicos en el procesamiento binaural de ambos estados de desarrollo y de madurez ^{4, 11, 12.} Se sabe mucho sobre este circuito de alta especialización y el papel que juega cada núcleo en el procesamiento temporal del sonido ^{13, 14.} De hecho, a corto pl...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken ACSF
NaCl		Fisher Scientific	M-11624	130 mM
NaHCO3		Fisher Scientific	M-10576	26 mM
KCl		Sigma-Aldrich	P-9333	3 mM
NaH2PO4		Sigma-Aldrich	S-8282	1.25 mM
Glucose		Sigma-Aldrich	G-7528	10 mM
MgCl2		Fisher Scientific	M33-500	1 mM
CaCl2		Acros Organics	423525000	2 mM
Chicken culture medium (store at 4°C)
advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)		GIBCO, by Life Technologies	12492-013	48.00%
Earl’s balanced salt solution		Sigma-Aldrich	E-2888	24.00%
L-glutamine (200 mM)		Sigma-Aldrich	G-7513	1.00%
Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	G-7528	2.75%
horse serum (heat inactivated, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	H-1138	24.00%
Penicillin-streptomycin*		Sigma-Aldrich	P-0781	1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination
Specific equipment
Millicell-CM cell culture inserts	PICMORG50	EMD Millipore
6-well plate	6 Well Cell Culture Cluster	Corning
Incubator	Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific