Preparação e Cultura do Fatias de frango auditivo de tronco cerebral

Resumo

O tronco cerebral de frango é composta por núcleos responsáveis ​​pelo processamento de som binaural. A preparação única fatia coronal mantém o circuito inteiro, enquanto a abordagem culta fornece uma preparação única para estudar o desenvolvimento da estrutura neuronal e função auditiva em nível molecular, celular e rede.

Resumo

O tronco cerebral frango é um sistema modelo bem estabelecido que tem sido amplamente utilizada para estudar a anatomia e fisiologia do processamento auditivo em períodos discretos de desenvolvimento ^04/01, bem como os mecanismos de codificação temporal no sistema nervoso central ^5-7.

Aqui apresentamos um método para preparar fatias de frango auditivo do tronco cerebral que pode ser usada para procedimentos experimentais aguda ou fatias organotípicas cultura de longo prazo manipulações experimentais.

O tronco cerebral é composto por frango angularis núcleo, azeitona, magnocellularis laminaris e superior. Esses núcleos são responsáveis ​​pelo processamento de som binaural única e preparações corte coronal preservar o circuito inteiro. Em última análise, as culturas fatia organotípicas pode fornecer a oportunidade de manipular vários parâmetros de desenvolvimento, como atividade sináptica, expressão de componentes pré e pós-sináptica, expressão de aspectos excitabilidade controle e expressão gênica diferencial

Esta abordagem pode ser usada para ampliar o conhecimento geral sobre o desenvolvimento do circuito neural, refinamento e amadurecimento.

Protocolo

1. Preparação de Dissecting Área

1. Continuamente bolha artificial de fluido cerebral espinhal (ACSF) com uma mistura de 95% O ₂ / 5% CO ₂ (pH entre 7,2-7,4, osmolaridade 295-310 mOsm / l).
2. Enquanto ACSF está borbulhando, limpe a área de trabalho com EtOH 70%. Também limpar o vibratome e lâmina de corte. Enxaguar a lâmina com água destilada (dH ₂ O).
3. Local almofada de absorção de líquidos limpos em dissecar área com ferramentas adequadas de dissecação.
4. Cola bloco de agar (40 mg de agarose / mL, ou seja 4%, em dH ₂ O) para o palco de uma câmara de vibratome-slicing *.
   * Dica: prepare ágar antes da dissecção. Loja agar pré-fabricados dentro de uma placa de Petri cobertas na geladeira. Agarose comprado de Merck Química ou Invitrogen.

2. Preparação de 6-bem Placas com meio de cultura

1. Sob um capuz estéril, preencher um bem por animal de uma placa de 6-bem com 1 mL de meio de cultura e incubar a 35 ° C e 5% de CO _2.
2. Prepare como inserções membrana muitos cultura como necessários e colocá-los na capa para uso posterior.

3. Isolamento do tronco cerebral Chicken

1. Ovo lugar sob uma fonte de luz brilhante para determinar o ar vazio espaço preenchido do embrião (normalmente o lado grande do ovo).
2. Quebre aberto lado grande saco de ovos a exposição da membrana. Faça fatia na membrana saco com bisturi e remover suavemente a cabeça do embrião de galinha.
3. Rapidamente decapitar a cabeça com uma tesoura.
4. Ponta lugar de lâmina ligeiramente posterior para e entre os olhos. Faça uma incisão rostral-to-caudal da linha média através do crânio aplicando-se apenas uma ligeira pressão *.
   * Dica: pressão aplicada depende da idade do embrião (ou seja, = jovens menos, mais velhos = mais)
5. Suavemente afastar pele e penas para expor crânio e verificar corte da linha média.
6. Bloco porção rostral do crânio por corte com uma lâmina de barbear. Blade posição posterior para os olhos e rapidamente cortou o crânio inteiro e tecido cerebral *.
   * Dica: forte pressão é necessária para remover completamente seção rostral.
7. Faça a linha média-lateral incisões com uma tesoura pequena na região caudal do crânio, um pouco anterior aos músculos do pescoço visível em ambos os lados da cabeça. Se afastar do crânio e do tecido para expor cerebelo e cérebro.
8. Remova cuidadosamente tronco a partir da base do crânio através do corte do tecido ligado com uma tesoura pequena. Uma vez que todo o tecido é cortado, tronco deve mover-se livremente fora do crânio *.
   * Dica: você pode precisar virar a cabeça (para baixo do cérebro) para cortar o tecido em anexo.

4. Preparação de Tronco para Slicing

1. Uma vez retirados do crânio, o pino para baixo através do tronco cerebral TECTA óptica.
2. Remover completamente o cerebelo suavemente cortando os pedúnculos com uma tesoura pequena, expondo o assoalho do quarto ventrículo.
3. Remover qualquer tecido membranoso e dos vasos sanguíneos da superfície do tronco cerebral, com uma pinça e fazer cortes laterais através da TECTA óptica para isolar o tronco cerebral.
4. Coloque uma pequena quantidade de super-cola no palco vibratome na frente do bloco de ágar (na direção da lâmina vibratome).
5. Com uma pinça, com cuidado e rapidamente levantar o tronco na medula espinhal e tecido lugar para a super-cola com o lado rostral baixo e de lado dorsal em direção à lâmina vibratome *.
   * Dica: excesso de cola deve ser absorvido com uma kim-wipe ou filtro de papel antes da etapa seguinte.
6. Derramar delicadamente ACSF oxigenado para o estágio vibratome *.
   * Nota: esta ACSF pode ser continuamente aeradas com O ₂ / CO _2. No entanto, borbulhando de ACSF em um volume tão pequeno de resultados solução em movimentos indesejados (e possíveis danos) para as fatias do tronco cerebral. Se realizada rapidamente, já oxigenado ACSF da dissecção é suficiente.
7. Blade Vibratome deve estar em um ângulo de 20-22. Iniciar vibratome (oscilação deve ser fixado em amplitude máxima) e mova-se palco para a lâmina de modo que a parte superior do tecido é paralela com a lâmina antes de cortar.
8. Mover rapidamente em direção da lâmina de tecido cerebral. Diminuir consideravelmente pouco antes entrar em contato com o tecido da lâmina.
9. Comece cortando o tecido com o mais lento possível movimento para a frente. Depois de atravessar toda a seção coronal do tecido, suavemente move fatia de distância da lâmina com uma escova ou um vidro quebrado, disparou pipeta polido, se encaixam em uma das extremidades com um bulbo de borracha.
10. Estágio inferior em passos 300-500 mm e fatia de novo. Repita até que as assinaturas são visíveis anatômica no tecido cerebral. Neste momento, o tecido cerebral fatia contendo estruturas auditivas em 200-1000 mM espessuras, dependendo da idade das necessidades do tecido e experimental.
11. Manter cuidadosamente fatias utilizáveis ​​na ordem de corte, ou seja, a fatia de 1 ^º representa a região mais caudal do circuito (de baixa freqüência de processamento de som) ea última fatia representa a parte mais rostral (alta freqüência processing) *.
    * Nota: para a colocação de fatias para uso da cultura, vá para a seção 6. Para in-vitro de armazenamento fisiologia, veja a próxima seção.

5. Armazenamento fatia para in-vitro Fisiologia

1. Dependendo da idade do embrião da galinha e da espessura da fatia, cada animal deve fornecer 1-6 fatias.
2. Delicadamente, coloque fatias individuais na câmara de usar o fogo pipeta de vidro polido montado em uma extremidade com um bulbo de borracha. Câmara devem ser numeradas. Coloque apenas uma fatia por poço, a fim de manter alguma especificidade tonotópica (por exemplo, fatia, mais caudal na câmara 1 ea fatia mais rostral na câmara anterior). Câmara deve ser preenchido com ACSF e continuamente aeradas com uma mistura de 95% O ₂ / 5% CO ₂ (pH 7.4, osmolaridade 295-310 mOsm / l).
3. Permitir fatias para equilibrar colocando a câmara em um banho quente (36 ° C) por aproximadamente 1 hora.
4. Remover câmara de banho morno e deixe descansar em temperatura ambiente por cerca de ½ hora.
5. Depois de horas e meia à temperatura ambiente, as fatias podem ser transferidos da câmara de exploração para uma câmara de gravação de ~ 0,5 mL montado em um microscópio para experimentos eletrofisiológicos.
6. Fatias podem ser utilizados para até ~ 6 horas após a remoção do banho quente.

6. Preparação das Culturas Slice organotípicas ⁸

1. Imediatamente após o procedimento corte (ver Secção 6) fatias de transferência com ~ 500 mL ACSF usando um incêndio pipeta de vidro polido montado em uma extremidade com um bulbo de borracha para uma placa de 48 bem no gelo. Por uma fatia bem *.
   * Dica: As fatias devem ser de pelo menos 300 mm e até 1000 mm de espessura.
2. Depois fatias foram coletadas, a transferência da placa de 48 também para a capa.
3. Remover uma placa bem 6-out meio contendo cultura da incubadora e transferi-la para a capa.
4. Pouco antes de colocar fatias de um único cérebro em membranas, coloque uma das inserções da membrana preparada (ver secção 2.2) em um poço com meio de cultura. Verifique se não há bolhas de ar estão presentes em membrana.
5. Usando uma pipeta de vidro, a transferência de uma fatia em uma gota de ACSF sobre a membrana cultura e remover o excesso ACSF com uma micropipeta. Repita o procedimento para as fatias restantes (max 4 fatias por membrana) *.
   * Dica: Certifique-se de postas não se tocam e coloque fatias de central na membrana de modo que não toque a borda da membrana.
6. Repita o procedimento para a fatias do cérebro que forem necessárias *.
   * Dica: Se as culturas são manipulados em um ponto mais tarde, pode ser vantajoso para limitar a quantidade de membranas para 3 por 6-bem como placa para reduzir o tempo as culturas são retirados da incubadora.
7. Alterar meio de cultura 3 vezes por semana sob um capuz: Remover média de idade com um tubo de vácuo com uma ponta estéreis, enquanto inserir membrana é retirado do poço com um par de fórceps. Adicionar 1 mL de meio de cultura fresco em bem, enquanto inserir membrana é retirado do poço. Quando todas as médias for alterado, colocar placa de volta para a incubadora.

7. Resultados representativos:

Figura 1. Circuito Binaural do tronco cerebral de frango. (A) Esquema de uma seção coronal e (BF) imagens in-vitro fatia do tronco cerebral de frango. O circuito em (A) mostra aferentes excitatórios entradas desde o nervo auditivo (AN) para o núcleo magnocellularis (NM) e angularis núcleo (NA). NM projectos bilaterais entradas excitatórias para o núcleo laminaris (NL) em ambos os lados do tronco cerebral. Uma entrada de inibição do núcleo olivar superior (SON) projetos para NA, NM e NL. As fatias in vitro-in (BF) são imagens seqüenciais (200 mM cada) indo de caudal (B) para rostral (F) do tronco cerebral de frango, representando os de baixa freqüência de regiões de alta, respectivamente. Circuito é responsável pela codificação de propriedades temporais do som usado principalmente para localização do som. Barra de escala em (B) = 500 mm e aplica para imagens em (CF). Setas em (D) apontam para a única camada de células do corpo de NL.

Figura 2. Neurônios cultivados desenvolver normais propriedades resposta fisiológica. Sobreposto variações de tensão de membrana em resposta a hiperpolarizante e despolarizante passos atual aguda (A & C) e tecidos cultivados em 4 (B) e 7 (D) dias de cultura (DIC). Mudanças na nota hiperpolarizantes "sag" tensão, forte redução na corrente para fora, e disparando AP único que se desenvolvem de forma semelhante na abordagem da cultura em comparação com fatia de tecido idade equivalente aguda. Injeções de corrente foram 200 ms, os passos de 50-100 pA. RMPS foram entre -55 e -60 mV.

Figura 3. Estrutura anatômica em sli culturaces. meia esquerda do tronco cerebral de um frango E11 após 7 dias em cultura (DIC). Um anticorpo contra a proteína associada ao microtúbulo 2 (MAP2), que ocorre na soma e dendritos, é rotulado em verde. Um conjunto de núcleo magnocellularis (NM) neurônios e seus axônios são marcados em vermelho via eletroporação de um dextran Alexa corante. Ambos NM ea linha de células NL são visíveis. Terminais do axônio ipsilateral NM pode ser vista a projectar para os dendritos dorsal NL (setas brancas).

Discussão

Durante várias décadas, a preparação fatia aguda do tronco cerebral de frango tem sido utilizada para estudo do processamento auditivo ^{9, 10.} Esta abordagem forneceu uma enorme quantidade de in-vitro dados fisiológicos sobre o processamento binaural de ambos os estados de desenvolvimento e maturidade ^{4, 11, 12.} Muito se sabe sobre este circuito altamente especializados eo papel de cada núcleo desempenha no processamento temporal do som ^{13, 14.} Na verdade, a curto prazo man...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken ACSF
NaCl		Fisher Scientific	M-11624	130 mM
NaHCO3		Fisher Scientific	M-10576	26 mM
KCl		Sigma-Aldrich	P-9333	3 mM
NaH2PO4		Sigma-Aldrich	S-8282	1.25 mM
Glucose		Sigma-Aldrich	G-7528	10 mM
MgCl2		Fisher Scientific	M33-500	1 mM
CaCl2		Acros Organics	423525000	2 mM
Chicken culture medium (store at 4°C)
advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)		GIBCO, by Life Technologies	12492-013	48.00%
Earl’s balanced salt solution		Sigma-Aldrich	E-2888	24.00%
L-glutamine (200 mM)		Sigma-Aldrich	G-7513	1.00%
Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	G-7528	2.75%
horse serum (heat inactivated, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	H-1138	24.00%
Penicillin-streptomycin*		Sigma-Aldrich	P-0781	1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination
Specific equipment
Millicell-CM cell culture inserts	PICMORG50	EMD Millipore
6-well plate	6 Well Cell Culture Cluster	Corning
Incubator	Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific