Подготовка и культуры Куриные ломтики Слуховые мозга

Резюме

Ствола мозга куриного слуховой состоит из ядер, ответственных за бинауральные обработки звука. Одного корональных подготовки ломтик поддерживает все схемы в то время как культурный подход обеспечивает уникальный препарат для изучения развития нейронной структуры и слуховой функции на молекулярном, клеточном и сетевых уровнях.

Аннотация

Ствола мозга куриного слуховой устоявшихся модель системы, которая широко используется для изучения анатомии и физиологии слухового переработки на дискретные периоды развития ^1-4, а также механизмы для временного кодирования в центральной нервной системе ^5-7.

Здесь мы представляем метод подготовить куриные слухового ствола мозга ломтиками, которые могут быть использованы для острой экспериментальной процедуры или к культуре органотипической ломтиками для долгосрочных экспериментальных манипуляций.

Ствола мозга куриного слуховой состоит из ядра angularis, magnocellularis, laminaris и превосходное оливковое. Эти ядра несут ответственность за бинауральные обработки звука и одного корональных подготовки ломтик сохранения всей схемы. В конечном счете, органотипической культур срез может предоставить возможность манипулировать несколько развития таких параметров, как синаптической активности, выражение пре-и постсинаптических компонентов, выражение аспекты контроля возбудимости и дифференциальное выражение гена

Этот подход может быть использован для расширения общих знаний о нейронных развития цепи, изысканность и созревания.

протокол

1. Подготовка Пройдя площадь

1. Постоянно пузырь искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) смесью 95% O ₂ / 5% СО ₂ (рН между 7.2-7.4, осмолярность 295-310 мОсм / л).
2. Хотя ACSF кипит, чистая рабочая зона с 70% этанола. Также очистите vibratome и нарезки лезвия. Промыть лезвие с дистиллированной водой (дН ₂ O).
3. Место чистую площадку поглощения жидкости на вскрытии области с соответствующими рассекающих инструментов.
4. Клей агар блок (40 мг агарозы / мл, то есть 4%, в дН ₂ O) до стадии vibratome нарезки камеры *.
   * Совет: подготовить агар до вскрытия. Магазин готовых агар внутри покрыты Петри в холодильнике. Агарозном приобрести у EMD химических веществ или Invitrogen.

2. Подготовка 6-луночных культуральной средой

1. Под капотом стерильные, заполнить 1 и одно животное из 6-луночный планшет с 1 мл культуральной среды и инкубировать при температуре 35 ° С и 5% СО _2.
2. Подготовьтесь так много вставок мембраны культуры по мере необходимости и поместите их в капоте для дальнейшего использования.

3. Выделение Куриный слуховых

1. Место яйцо под яркий источник света, чтобы определить воздух, наполненный пустота пространства эмбриона (как правило, большие сторону яйцо).
2. Перерыв открытой большой стороне яйца подвергая мембраны мешка. Сделайте срез в мембранном мешка с скальпель и аккуратно удалить глава куриного эмбриона.
3. Быстро обезглавить голову ножницами.
4. Место кончик лезвия чуть сзади и между глаз. Сделать ростральной до хвостового средней линии разрез через череп применением только небольшое давление *.
   * Совет: давление зависит от возраста эмбриона (т.е. младший = меньше, пожилые = больше)
5. Аккуратно отодвинуть кожу и перья, чтобы подвергать черепа и проверить средней линии разреза.
6. Блок ростральной части черепа, нарезая с лезвия бритвы. Позиция лезвие задней глаза и быстро прорезать всего черепа и мозговая ткань *.
   * Совет: сильное давление требуется, чтобы полностью удалить ростральной разделе.
7. Сделать средней линии к боковой разрез с небольшими ножницами в хвостовой области черепа, немного впереди видимых мышц шеи по обе стороны головы. Вырваться черепа и ткани подвергать мозжечка и мозга.
8. Аккуратно снимите ствол мозга от основания черепа, сокращая прилагается ткани с небольшими ножницами. После того как все ткани вырезать, мозга должны свободно двигаться от черепа *.
   * Совет: Вам может понадобиться, чтобы перевернуть черепа (мозг вниз), чтобы сократить прилагается ткани.

4. Подготовка ствола мозга для нарезки

1. После извлечения из черепа, контактный мозга вниз через оптический tecta.
2. Полное удаление мозжечка, осторожно резки цветоносы с небольшими ножницами, выставляя этаже четвертого желудочка.
3. Удалите все мембранные ткани и кровеносных сосудов с поверхности ствола мозга с помощью пинцета и сделать боковые разрезы через зрительный tecta изолировать мозга.
4. Нанесите небольшое количество супер клей на vibratome сцене перед агар блока (в сторону лезвия vibratome).
5. С помощью пинцета аккуратно и быстро поднять ствол мозга в спинной мозг и ткани на месте супер клей с ростральной стороной вниз и спинной стороны навстречу лезвие vibratome *.
   * Совет: избыток клея должны быть покрыты с Ким-стереть или фильтровальную бумагу до следующего шага.
6. Аккуратно влить кислородом ACSF в стадию vibratome *.
   * Примечание: это ACSF можно непрерывно пропускают с O ₂ / CO _2. Тем не менее, журчание ACSF в таком маленьком объеме раствора приводит к нежелательным движения (и возможного ущерба) в стволе мозга ломтиками. Если выполняются быстро, уже кислородом ACSF от вскрытия достаточно.
7. Vibratome лезвия должна быть 20-22 °. Начало vibratome (колебания должны быть установлены на максимальную амплитуду) и двигаться вверх, к стадии лезвие так, что верхняя часть ткани параллельно с лезвием до нарезки.
8. Быстрое перемещение лезвия в направлении ствола мозга ткани. Замедление значительно непосредственно перед лезвием контакте с тканью.
9. Начните нарезки ткани с минимально возможный движение вперед. Пройдя через весь корональной части ткани, мягко двигаться ломтик от лезвие с кистью или битое стекло, полированная уволен пипетки, подходят на одном конце с резиновой грушей.
10. Нижняя ступень в 300-500 мкм и нарезать шаги снова. Повторяйте, пока анатомические подписи видны в стволе мозга ткани. В это время, кусочек мозга ткани, содержащей слуховых структур на 200-1000 мкм толщины, в зависимости от возраста ткани и экспериментальных потребностей.
11. Тщательно поддерживать использовать ломтики в порядок нарезки, то есть ^1-я часть представляет собой наиболее хвостовой части схемы (низкочастотной обработки звука), а последний срез представляет собой наиболее ростральной разделе (высокочастотные processiнг) *.
    * Примечание: для размещения ломтиками культуры использования, перейдите в раздел 6. Ибо в лабораторных хранения физиологии, см. следующий раздел.

5. Фрагмент для хранения в лабораторных условиях физиологии

1. В зависимости от возраста эмбриона цыпленка и толщина среза, каждое животное должно обеспечить с 1 по 6 ломтиков.
2. Аккуратно отдельных ломтиков в камере с огнем полированные стеклянные пипетки установлены на одном конце с резиновой грушей. Палаты должны быть пронумерованы. Место только один кусочек на лунку, для того, чтобы сохранить некоторые tonotopic специфику (например, большинство хвостового среза в камере 1 и наиболее ростральной ломтик в последней камеры). Палаты должны быть заполнены ACSF и постоянно клокотало смесью 95% O ₂ / 5% СО ₂ (рН 7,4, осмолярность 295-310 мОсм / л).
3. Разрешить ломтиками, чтобы уравновесить путем размещения камеры в теплой ванне (36 ° С) в течение около 1 часа.
4. Удалите камеру из теплой ванны и позволит отдохнуть при комнатной температуре в течение примерно полчаса.
5. После полутора часов при комнатной температуре, кусочки могут быть переданы от проведения камере ~ 0,5 мл записи камеры установлены на микроскоп для электрофизиологических экспериментов.
6. Фрагменты могут быть использованы на срок до ~ 6 часов после удаления из теплой ванны.

6. Подготовка органотипической культур фрагмент ⁸

1. Сразу же после нарезки процедуры (см. раздел 6) передача ломтики с ~ 500 мкл ACSF использованием огня полированного стекла пипеткой установлены на одном конце резиновой груши с 48 лунками на льду. Один кусочек на лунку *.
   * Совет: Ломтики должны быть не менее 300 мкм и до 1000 мкм.
2. После ломтики были собраны, трансфер 48-луночного планшета на капот.
3. Удалите 6-луночный планшет содержащие из культуральной среды инкубатора и перенести его на капот.
4. Незадолго до размещения ломтики из одного мозга на мембранах, место одного из подготовленных вставки мембраны (см. раздел 2.2) в колодец с питательной среды. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков настоящее время под мембраной.
5. Использование стеклянной пипетки, передача ломтик в капле ACSF на культуру мембраны и удаления излишков ACSF с микропипетки. Повторите эти действия для оставшихся ломтиков (макс. 4 ломтика в мембрану) *.
   * Совет: Убедитесь, что ломтики не соприкасались друг с другом и место ломтики централизованно на мембране так, чтобы они не касались мембраны обода.
6. Повторите столько ломтики мозга по мере необходимости *.
   * Совет: Если культур манипулируют в более поздний момент времени, это может быть выгодно, чтобы ограничить количество мембран 3 на 6-луночный планшет, чтобы уменьшить время культур удаляют из инкубатора.
7. Изменение культуральной среде 3 раза в неделю под капотом: Удалить старые среде с вакуумной трубкой с наконечником в то время как стерильные мембраны вставить поднимается из скважины с парой щипцов. Добавить 1 мл свежей питательной среды в хорошо в то время как мембрана вставки поднял из колодца. Когда все среда изменилась, положите пластину обратно в инкубатор.

7. Представитель Результаты:

Рисунок 1. Двойные схема слуховых курицы. () Схема корональных раздел и (BF) в пробирке часть изображения слуховых курицы. Замыкания в () показывает, афферентных возбуждающих входов от слуховой нерв () к ядру magnocellularis (NM) и ядро ​​angularis (NA). Н. М. проектов двусторонних возбуждающих входов к ядру laminaris (NL) по обе стороны ствола мозга. Тормозящий вход с превосходной овальный ядра (SON) проекты Н. А., Н. и NL. В пробирке ломтики в (BF) являются последовательных изображений (200 мкм каждый) идущий от хвостового (В) ростральной (F) из слуховых курица, представляющих низких и высокочастотных областей соответственно. Схема отвечает за кодирование временные свойства звука используется в основном для локализации звука. Шкала бар (B) = 500 мкм и применяется для изображений (CF). Стрелки (D) указывают на один слой клеток организма от NL.

Рисунок 2. Искусственный нейронов развивать нормальные физиологические свойства ответ. Наложенные изменения мембранного напряжения в ответ на гиперполяризующих и деполяризующего тока шагах от острой (& C) и культурной ткани на 4 (B) и 7 (D) дней культуры (ОПК). Обратите внимание, изменения в гиперполяризующих напряжения "провисают", сильное сокращение наружу ток, и однократный обжиг AP, которые развиваются так же в подходе культура ломтик по сравнению с возрастом эквивалент острого ткани. Текущий инъекции 200 мс, шагами по 50-100 мкА. ПРХ были между -55 и -60 мВ.

Рисунок 3. Анатомическое строение в культуре SLICES. Левая половина мозга слуховой из куриного E11 через 7 дней в культуре (DIC). Антитела против микротрубочек связанных белков 2 (MAP2), которое происходит в сомы и дендритов, помечена зеленым цветом. Кластера ядра magnocellularis (NM) нейроны и аксоны его помечены красным через электропорации Alexa декстран красителя. Оба Н. М. и Н. Л. линии ячейки, не видны. Ипсилатеральная терминалов аксона Н. М. можно увидеть проектирования до спинной дендритов NL (белые стрелки).

Обсуждение

В течение нескольких десятилетий острой подготовки ломтиком куриного мозга был использован для исследования слуховой обработки ^{9, 10.} Такой подход обеспечил огромное количество в лабораторных условиях физиологические данные о бинауральных обработки с обеих развития и зрел...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken ACSF
NaCl		Fisher Scientific	M-11624	130 mM
NaHCO3		Fisher Scientific	M-10576	26 mM
KCl		Sigma-Aldrich	P-9333	3 mM
NaH2PO4		Sigma-Aldrich	S-8282	1.25 mM
Glucose		Sigma-Aldrich	G-7528	10 mM
MgCl2		Fisher Scientific	M33-500	1 mM
CaCl2		Acros Organics	423525000	2 mM
Chicken culture medium (store at 4°C)
advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)		GIBCO, by Life Technologies	12492-013	48.00%
Earl’s balanced salt solution		Sigma-Aldrich	E-2888	24.00%
L-glutamine (200 mM)		Sigma-Aldrich	G-7513	1.00%
Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	G-7528	2.75%
horse serum (heat inactivated, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	H-1138	24.00%
Penicillin-streptomycin*		Sigma-Aldrich	P-0781	1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination
Specific equipment
Millicell-CM cell culture inserts	PICMORG50	EMD Millipore
6-well plate	6 Well Cell Culture Cluster	Corning
Incubator	Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific