치킨 청각 Brainstem 슬라이스의 준비 및 문화

요약

닭고기 청각 brainstem는 binaural 사운드 처리에 대한 책임 핵으로 구성되어 있습니다. 교양 접근, 분자 세포 및 네트워크 수준에서의 연결 구조와 청각 기능의 발달을 연구하기 위해 특별한 준비를 제공하는 동안 하나의 코로나 슬라이스 준비는 전체 회로를 유지합니다.

초록

닭고기 청각 brainstem 널리 개발 ^1-4 신중 기간에서뿐만 ^5-7 중추 신경 시스템에서 시간적 코딩을위한 메커니즘으로 청각 처리의 해부학과 생리학을 연구하는 데 사용되었습니다 잘 구축 모델 시스템입니다.

여기 급성 실험 절차 또는 장기 실험 조작에 대한 문화 organotypic 조각하는 데 사용할 수있는 닭고기 청각 brainstem의 조각을 준비하는 방법을 제시한다.

닭고기 청각 brainstem는 핵의 angularis, magnocellularis, laminaris 및 뛰어난 올리브로 구성되어 있습니다. 이 핵은 binaural 사운드 처리 및 단일 코로나 슬라이스 준비 전체 회로를 보존 책임이 있습니다. 궁극적으로, organotypic 슬라이스 문화는 시냅스 활동, 사전 및 postsynaptic 구성 요소의 표현, 부분 통제 흥분과 차별 유전자 발현의 표현과 같은 몇 가지 발달 매개 변수를 조작할 수있는 기회를 제공할 수 있습니다

이 접근법은 신경 회로 개발, 교양과 성숙에 대한 일반 지식을 확대하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 지역 분석 해 봅시다의 준비

1. 95% O ₂ / 5% CO _2의 혼합물 (7.2-7.4 사이의 산도, osmolarity 295-310 mOsm / L)와 함께 지속적으로 거품 인공 대뇌 척수 (ACSF).
2. ACSF가 버블링이지만, 70 % EtOH로 작업 영역을 청소하십시오. vibratome과 깔끔히 칼날에도 청소. 증류수 (DH ₂ O)의 칼날을 씻어.
3. 적절한 해부 도구로 영역을 해부 깨끗한 유체 흡수 패드를 놓습니다.
4. vibratome - 깔끔히 챔버의 무대에 글루 한천 블록 (DH ₂ O 40 MG 아가로 오스 / ML, 즉 4%) *.
   * 도움말 : 해부하기 전에 한천을 준비합니다. 냉장고에 덮여 페트리 접시 안에 스토어 미리 만든 한천. 아가로 오스는 EMD 화학 물질이나 Invitrogen에서 구입했습니다.

2. 문화 매체와 6 - 잘 플레이트의 준비

1. 멸균 후드 아래, 35 문화 매체와 부화 1 ML과 6 자 접시의 동물마다 잘 작성 1 ° C와 5 % CO _2.
2. 많은 문화 막 삽입 등 필요한 준비하고 나중에 사용하기 위해 모자를 놓으십시오.

3. 치킨 청각 Brainstem의 분리

1. 배아 (일반적으로 계란의 큰 쪽)의 공기 가득한 공간 무효를 결정하는 밝은 광원에 따라 플레이스 달걀.
2. 멤브레인 색을 노출 계란의 대형 측면을 열고 브레이크. 때론 막 색으로 슬라이스를 만들어 부드럽게 닭 배아의 머리를 제거합니다.
3. 신속하게 가위로 머리가 목을 베다.
4. 와 눈 사이 약간 후부 면도날의 장소 끝. 단 약간의 압력을 적용하는 두개골을 통해 주동이의 - 투 - 꼬리 정중선 절개를합니다 *.
   * 팁 : 적용 압력이 배아의 나이에 따라 달라집니다 (즉, 젊은 = 적은, 나이 = 이상)
5. 부드럽게 피부와 두개골을 노출하고 정중선 절개를 확인하기 위해 깃털을 잊어버리게.
6. 면도날로 깔끔히에 의해 두개골의 주동이의 부분을 차단합니다. 눈 뒷부분 빠르게 전체 두개골과 뇌 조직을 통해 절단 위치 블레이드 *.
   * 도움말 : 강한 압력이 완전히 주동이의 섹션을 제거하기 위해 필요합니다.
7. 머리 양쪽에 볼 수 목 근육에 약간 앞쪽에 두개골의 꼬리 지역에 작은 가위와 정중선 - 투 - 측면 incisions하십시오. 두개골과 소뇌 및 뇌 노출 조직을 멀리 당기세요.
8. 부드럽게 작은 가위로 연결된 조직을 절단하여 두개골 바닥에서 brainstem를 제거합니다. 모든 조직이 절단되면, brainstem가 두개골에서 떨어져 자유롭게 이동한다 *.
   * 팁 : 연결된 조직을 잘라 두개골 (뇌 아래)를 플립해야 할 수도 있습니다.

4. 부러 뜨리 Brainstem의 준비

1. 일단 두개골에서 제거, 광학 tecta 통해 brainstem을 핀.
2. 완전히 부드럽게, 작은 가위로 peduncles 절삭 번째 뇌실의 바닥을 노출하여 소뇌를 제거합니다.
3. 핀셋으로 brainstem의 표면으로부터 막의 조직과 혈관을 제거하고 brainstem을 분리하기 위해 광학 tecta을 통해 측면 인하합니다.
4. 한천 블록의 앞에 vibratome 단계 (vibratome 블레이드 향해)에 슈퍼​​ 접착제의 작은 금액을 넣으십시오.
5. 족집게를 사용하면, 부드럽게 그리고 신속하게 vibratome 블레이드에 대한 주동이의 측면 아래로 등의 측면과 슈퍼 접착제로 척수와 장소 조직에서 brainstem 리프트 *.
   * 도움말 : 초과하는 접착제가로 흡수해야 킴 - 닦아 또는 다음 단계 전에 종이를 필터링합니다.
6. 부드럽게 vibratome 단계로 산소 ACSF를 따르다 *.
   * 참고 :이 ACSF 연속 O ₂ / CO _2와 함께 부풀어 오른 수 있습니다. 그러나, brainstem의 조각을 원하지 않는 운동의 솔루션 결과 같은 작은 볼륨 (및 손상)에 ACSF들이 꿈틀. 빠르게 수행할 경우, 이미 해부에서 ACSF 충분 산소.
7. Vibratome 블레이드는 20-22 °의 각도로해야합니다. 시작 vibratome (진동이 최대 진폭에서 설정해야합니다)과이 조직의 최고가 깔끔히 전에 블레이드와 평행이되도​​록 블레이드 향해 무대를 이동합니다.
8. 신속 brainstem 조직으로 블레이드를 이동합니다. 조직과 블레이드 연락 상당히 직전 천천히.
9. 느린 가능 전진 운동과 조직을 깔끔히 시작합니다. 일단 조직의 전체 코로나 섹션을 통해, 부드럽게 브러쉬 또는 깨진 유리와 블레이드에서 슬라이스를 멀리 이동 광택 피펫은 고무 전구 한 끝에 맞게, 발사.
10. 로우어 300-500 μm의 단계로 무대와 다시 조각. 해부 학적 서명 brainstem 조직에서 볼 때까지 반복합니다. 이때, 200-1000 μm의의 청각 구조를 포함하는 슬라이스 brainstem 조직 조직과 실험 요구 나이에 따라 두께.
11. 조심스럽게, IE를 깔끔히의 순서로 사용할 슬라이스를 유지, 1 ^{일 슬라이스는} 회로의 가장 꼬리 영역 (저주파 사운드 처리)을 나타내고 마지막 슬라이스가 가장 주동이의 섹션 (고주파 processi을 나타냅니다NG) *.
    * 참고 : 문화 사용을 위해 조각의 배치에 대해, 제 6으로 이동하십시오. 체외 수정 생리학 스토리지, 다음 섹션을 참조하십시오.

5. 체외 수정 생리학에 대한 슬라이스 스토리지

1. 치킨 배아 및 슬라이스의 두께의 연령에 따라 각 동물 1-6 조각을 제공한다.
2. 부드럽게 고무 벌브 한 끝에 장착되어 화재 광택 유리 피펫을 사용하여 챔버에서 개별 조각 장소. 상공 회의소 번호가 있어야합니다. 일부 tonotopic 특이성 (예, 챔버 한 대부분의 꼬리 조각과 마지막 챔버에서 가장 주동이의 슬라이스) 유지하기 위해 잘마다 하나의 슬라이스를 놓습니다. 상공 회의소는 ACSF 가득 지속 95% O ₂ / 5% CO ₂ (산도 7.4, osmolarity 295-310 mOsm / L)의 혼합과 함께 부풀어 오른해야합니다.
3. 조각은 약 1 시간 동안 따뜻한 목욕 (36 ° C)에 챔버를 삽입하여 평형 수 있습니다.
4. 따뜻한 목욕에서 챔버를 제거하고 약 ½의 시간 실온에서 휴식을 허용합니다.
5. 상온에서 ½ 시간 후, 조각은 electrophysiological 실험 현미경에 장착된 ~ 0.5 ML 기록 챔버에 보관 챔버에서 전송할 수 있습니다.
6. 조각은 따뜻한 목욕에서 제거 후 ~ 6 시​​간에 사용할 수 있습니다.

6. Organotypic 슬라이스 문화 ⁸ 준비

1. 즉시 전송 조각 얼음이 48 잘 접시에 고무 전구 한 끝에 장착되어 화재 광택 유리 피펫을 사용하여 ~ 500 μL ACSF와 (제 6 항 참조) 깔끔히 절차에 따라. 하나는 잘마다 조각 *.
   * 팁 : 조각이 적어도 300 μm의 두께 및 최대 1000 μm의해야합니다.
2. 조각이 수집되고 나면, 후드에 48 잘 접시를 전송합니다.
3. 보육의 6 자 플레이트가 포함된 배지 출력을 제거하고 후드에 전송할 수 있습니다.
4. 직전 장소는 문화 매체로 우물에 (섹션 2.2 참조), 세포막에 하나의 머리에서 조각을 준비 막 삽입 중 하나를 배치하는. 더 공기 거품이 막 아래에 존재하지 있는지 확인합니다.
5. 유리 피펫을 사용하여 문화 막에 ACSF의 드롭에 슬라이스를 전송하고 micropipette로 초과 ACSF를 제거합니다. 남은 조각을 반복 (막 당 최대 4 조각) *
   * 도움말 : 그들이 막 림을 만지지 않도록 조각이 막에서 중앙 서로 접촉과 장소의 조각하지 않도록합니다.
6. 필요에 따라 많은 뇌 조각을 반복 *
   * 도움말 : 문화가 나중 지점에서 조작하는 경우에는 문화가 인큐베이터에서 제거하는 시간을 줄일 수로가 6 자 판 당 3 세포막의 양을 제한하는 유리 수도 있습니다.
7. 문화 매체에게 후드 아래에 3 회 일주일 변경 : 막 삽입이 포셉 한 쌍의으로 잘 밖으로 해제하는 동안 진공 튜브 살균 팁과 함께 오래된 매체를 제거합니다. 멤브레인 삽입이 잘 밖으로 해제되는 동안에 잘 신선한 문화 매체 1 ML을 추가합니다. 모든 매체가 변경되면, 인큐베이터에 다시 접시를 넣어.

7. 대표 결과 :

그림 1. 치킨 청각 brainstem의 Binaural 회로. 코로나 섹션 (A) 도식과 치킨 청각 brainstem의 (BF)에 - 체외의 슬라이스 이미지. (A)의 회로는 핵 magnocellularis (NM)와 핵 angularis (NA)로 청각 신경 ()에서 수입 성의 흥분성의 입력을 보여줍니다. NM은 brainstem 양쪽에 핵 laminaris (NL)에 양자 흥분성의 입력을 프로젝트. NA, NM 및 NL에 뛰어난 olivary 핵 (아들) 프로젝트에서 억제 입력. 의 체외 수정의 조각 (BF)는 순차 이미지 고주파 영역 낮은로 대표 꼬리에서 (B) 치킨 청각 brainstem의 주동이의 (F) 갈 (각 200 μm의)는, 각각 있습니다. 회로 소리 로컬 라이제이션을 위해 주로 사용 소리의 시간적 특성을 코딩에 대한 책임이 있습니다. 규모 바 (B) = 500 μm의 및 이미지 (CF) 적용됩니다. NL의 단세포 몸 레이어 (D) 지점에서 화살표.

그림 2. 교양 뉴런 정상 physiologic 응답 특성을 개발할 수 있습니다. 급성 (A & C) 4 (B) 7 (D) 문화 일 (DIC)에서 교양 조직에서 현재 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing에 대한 응답으로 막 전압 변화를 겹쳐. 연령 상응하는 급성 조직에 비해 슬라이스 문화 접근에 유사하게 개발 전압 "세그"외부 전류에 강한 감소하고, 하나의 AP 시행을 hyperpolarizing에 참고 변경됩니다. 현재 주사가 50-100 PA 200 MS, 단계되었습니다. RMPs은 -55과 -60 MV 사이에 있었다.

그림 3. 문화 SLI의 해부 구조CES. 문화 7 일 후 E11 치킨 (DIC)의 청각 brainstem의 왼쪽 반동안. 소마와 dendrites에서 발생하는 미세 소관 결합 단백질 2 (MAP2)에 대한 항체는 녹색으로 표시됩니다. 핵 magnocellularis (NM) 뉴런과 axons의 클러스터는 알렉사 dextran 염료의 electroporation을 통해 빨간색으로 표시됩니다. NM와 NL 세포 라인 모두 볼 수 있습니다. Ipsilateral NM의 축삭 터미널은 지느러미 NL의 dendrites (흰색 화살촉)에 돌출 볼 수 있습니다.

토론

몇 수십년 동안 치킨 brainstem의 급성 슬라이스 준비는 청각에게 처리 ^{9, 10을} 연구하는 데 사용되었습니다. 이러한 접근 방식은 모두 발달 및 성숙 상태 ^{4, 11, 12} binaural 처리에에 - 체외 생리 어마어마한 양의 데이터를 제공하고 있습니다. 대부분이 고도로 전문화된 회로와 각 핵 소리 ^{13, 14의} 시간적 처리하는 역할에 대한 알려져있다. 사실,이 잘 특징 회로의 구조와 기...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken ACSF
NaCl		Fisher Scientific	M-11624	130 mM
NaHCO3		Fisher Scientific	M-10576	26 mM
KCl		Sigma-Aldrich	P-9333	3 mM
NaH2PO4		Sigma-Aldrich	S-8282	1.25 mM
Glucose		Sigma-Aldrich	G-7528	10 mM
MgCl2		Fisher Scientific	M33-500	1 mM
CaCl2		Acros Organics	423525000	2 mM
Chicken culture medium (store at 4°C)
advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)		GIBCO, by Life Technologies	12492-013	48.00%
Earl’s balanced salt solution		Sigma-Aldrich	E-2888	24.00%
L-glutamine (200 mM)		Sigma-Aldrich	G-7513	1.00%
Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	G-7528	2.75%
horse serum (heat inactivated, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	H-1138	24.00%
Penicillin-streptomycin*		Sigma-Aldrich	P-0781	1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination
Specific equipment
Millicell-CM cell culture inserts	PICMORG50	EMD Millipore
6-well plate	6 Well Cell Culture Cluster	Corning
Incubator	Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific