Ligadura de las arterias coronarias y la inyección intramiocárdica en un modelo murino de infarto

Resumen

Numerosas manipulaciones genéticas y / o inyecciones intramiocárdica de genes, proteínas, células, y / o los biomateriales se superponen a la dimensión del tiempo en los estudios de agudos de isquemia / reperfusión y la remodelación crónica en ratones. Este video ilustra los procedimientos de microcirugía de la isquemia / reperfusión, la ligadura permanente de la arteria coronaria, y los estudios de inyección intramiocárdica.

Resumen

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.

Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.

Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.

Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Protocolo

1. Instrumentos quirúrgicos estériles (Tabla 1) y 3 "aplicadores con punta de algodón se colocan en una underpad estéril. El esterilizador de cuentas (Germinador 500) está encendido.
2. Ratones (edad:> 6 semanas; peso:> 18 g) se anestesiaron con una inyección ip de 20μl / g de peso corporal de tribromoethanol (250mg/kg; duración - aproximadamente 40 minutos).
3. Cuando los ratones no responden a los pies-una pizca, un lubricante estéril (Lágrimas renovado) se aplica a los ojos para protegerlos de la desecación y el lado izquierdo del pecho está cubierto con crema depilatoria (por ejemplo, Nair) para eliminar el pelo de la piel.
4. La depilación se lava con agua tibia y betadine / alcohol hisopado se utiliza para desinfectar el área quirúrgica.
5. El ratón es colocado en una almohadilla caliente deltaphase isotérmica que se fija a una mesa de plexiglás. Cada miembro es inmovilizado con cinta adhesiva y un hilo grueso se coloca horizontalmente bajo los dientes de arriba para mantener la mandíbula superior en su lugar.
6. La tabla está en posición vertical y una luz de fibra óptica se ilumina directamente sobre la zona del cuello para la iluminación transesofágica. Esto requiere la colocación precisa de tal manera que la apertura de la garganta es visto como un orificio bien iluminada, lo que permite la tráquea para ser visualizados para facilitar la inserción de la tubería de PE.
7. El tubo se conecta al ventilador (conectado a un 95% O ₂ / 5% CO ₂₎ para administrar ventilación a presión positiva constante (TOPO ventilador, tasa de 125 respiraciones / min; pico de presión inspiratoria 10-12 cmH ₂ O; nota * : Los ajustes varían con la cepa y el sexo 1-3). Una vez que la ventilación es confirmado por los movimientos del tórax sincronizado, la conexión se fija a la plataforma con cinta adhesiva para evitar la extubación durante la cirugía.
8. Con unas pinzas dentadas para tirar de la piel hacia arriba y lejos del pecho, una hoja de bisturí # 10 estéril conectada a un mango de bisturí n º 3 se utiliza para hacer una incisión de 1,5 cm en la piel paralelo al esternón.
9. Curva microtijeras Vanna se utilizan para cortar los músculos pectorales y hacer un pequeño agujero en el músculo intercostal.
10. Recta, micro tijeras romas se utilizan para cortar a través de tres costillas.
11. El espéculo de 9 mm oftálmica pediátrica se utiliza para retirar la caja torácica.
12. Utilizando la pinza curva, tirar el pericardio desde el corazón y el uso de las pinzas dentadas para arrancar suavemente abierta.
13. Utilizando el porta-agujas Castroviejo, un punto cónico de 6 mm 3 / 8 hilos de la aguja de la sutura de polietileno de 8-0 por debajo de la descendente anterior izquierda arteria coronaria (a lo largo del eje longitudinal del corazón) perpendicular a ella.
    1. Para una ligadura temporal que puede ser eliminado debido a que la reperfusión tiempo, un estéril 0.5-1cm pedazo de PE90 se coloca en el corazón de forma paralela a la arteria coronaria. La sutura, que haya sido enrollado debajo de la arteria coronaria, se ata a la tubería. En el momento en que va a ser liberado, la ligadura se afloja. Esto se puede repetir si lo desea y el tiempo de oclusión / reoclusión puede ser modificado ^4. Dependiendo de la duración del protocolo y el tipo de anestesia utilizada, la suplementación puede ser necesaria.
    2. Para una oclusión permanente, la ligadura atada debajo de la arteria coronaria es simplemente atados. Escaldado y discinesia son evidentes y el extremo largo de la sutura se corta ^5.10.
    3. Para la inyección intramiocárdica (s), una jeringa estéril de Hamilton con una aguja estéril de calibre 30 biselados se introduce en la base del corazón por encima de la zona de la lesión en el lado derecho de la ligadura. La aguja se avanzó hacia la zona de la lesión y se retira un poco para que el bisel se puede ver aproximadamente en la zona fronteriza. Parte de la solución en la jeringa (2-3μl) se inyecta en el corazón y la aguja se mantiene en su lugar. La jeringa se retira otro de 1-3mm y el resto de la solución se inyecta. La jeringa se mantiene en su lugar hasta que la ampolla que se forma por la solución se disipa. La aguja se retira. Si hay algún sangrado, un aplicador de algodón se presiona suavemente sobre el sitio de inserción de la aguja hasta que el sangrado se detiene ^5-7.
14. Una vez que las manipulaciones de miocardio se han completado, los retractores de la costilla se eliminan y la cavidad torácica se cierra con 3.2 puntos de colchonero con sutura 6-0 Surgipro.
15. Dos y tres puntos de colchonero se hacen a cerca de los músculos pectorales, 1-3 gotas de bupivacaína al 0,25% 1:10 en solución salina estéril (ratón 0.1ml/25g) se aplica a los músculos y luego 2-3 puntos de colchonero se hacen para cerca de la piel.
16. El ratón se retira del ventilador. Una vez que la respiración rítmica, rápida y superficial, se ha verificado, el ratón puede ser extubado.
17. 0,5 ml de solución salina estéril caliente se inyecta en el espacio subcutáneo dorsal y el ratón se coloca sobre una plataforma de calentamiento en una jaula hasta que recupera la movilidad (1 hora mínimo).
18. Para los experimentos de supervivencia, los ratones se vuelven a colocar en sus jaulas y se devuelve al vivero hasta el momento del sacrificio. Durante los 2 primeros días, se humedece los alimentoscolocado en el piso de la jaula para facilitar la alimentación (por lo que no tiene que llegar hasta lo que puede causar dolor) y la buprenorfina debe ser administrado cada 6 de 12 horas. Atención post-operatoria también incluye el monitoreo diario de la primera semana para verificar una adecuada movilidad, el aseo y los hábitos alimenticios.
19. Los instrumentos quirúrgicos son limpiados con etanol y se inserta en el esterilizador de cuentas antes de la operación siguiente.
20. En el momento del sacrificio, los ratones se anestesian con pentobarbital sódico (65mg/ml; 55-65 mg / kg). Cuando un plano de anestesia adecuado se logra, la cavidad torácica se abre.
21. Mientras el corazón sigue latiendo, una jeringa con una aguja de calibre 23, que contienen cloruro de potasio en frío (KCl, 30 mM) o 2,3-butanodiona monoxima (BDM, 10 mM) se utiliza para perforar la región basal posterior del ventrículo y la solución es se inyecta lentamente en la cámara hasta que el corazón es detenido en diástole.
22. Una vez que el corazón se retira, una jeringa que contenía PBS se utiliza para perfundir retrógradamente el corazón de enjuague para eliminar la sangre que queda. Para estudios de toxicidad aguda, al final del período de reperfusión, el muchacho se re-liga en el punto original de la oclusión. Una solución que contiene 1% de azul de Evans se inyecta en la aorta. Una vez que el corazón se extrae, se corta transversalmente en tres secciones de igual grosor, se incubaron en 1% de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio, y la imagen de los análisis morfométricos ^11. Para estudios de toxicidad crónica, el corazón se sumerge en el fijador, procesados ​​y embebidos de acuerdo a los procedimientos de rutina. Las diapositivas se pueden teñir histológicamente y con imágenes para el análisis morfométrico (con Scion, NIH Image J, o Image Pro Plus) ^9,10,12.

Los resultados representativos:

Cuando se hace correctamente, las tasas de supervivencia en ratones (machos: 8-10 semanas de edad, 22-28g; mujeres: la edad de 10-12 semanas, 20-26g) son: más del 90% en aguda por isquemia / reperfusión isquémica y experimentos de precondicionamiento, en 85% en los estudios de la arteria ligadura permanente, y aproximadamente el 80% para inyección intramiocárdica. Desde temprana lesión es más fácilmente visible por los cambios metabólicos en lugar de la determinación estructural, el tamaño del infarto en la isquemia / reperfusión y la cardiopatía isquémica experimentos pre-acondicionamiento se realiza mediante la infusión de 1% de colorante azul de Evans en la aorta que perfundir el corazón que no es suministrado por la DA ( Figura 1 A). Una vez que el corazón y cortadas transversalmente por la mitad, el tejido se incuba en el 1% de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio para medir el tamaño del infarto (fig. 1B). Las áreas se miden con Scion o NIH software de imágenes que puede ser calibrado usando un micrómetro de imágenes con el mismo aumento. Estos números se utilizan para calcular el área de riesgo / ventrículo izquierdo y el tamaño del infarto / área de riesgo ^11. Diferencias de las cepas puede dar lugar a variaciones en el peso corporal y el tamaño del corazón y por lo tanto se debe tener cuidado para normalizar las medidas de peso del corazón, el peso corporal, o la longitud de la tibia con fines comparativos.

Permanente resultados ligadura de la arteria en grandes cambios estructurales, tales como necrosis, adelgazamiento de la pared, y la dilatación de la cámara. La comparación de los efectos del tratamiento y / o tiempo en el tamaño del infarto y necrosis en relación con el ventrículo izquierdo, área de la cámara, y el espesor de la pared septal del ventrículo izquierdo de la pared libre en el modelo de oclusión permanente (Figura 2) también se puede medir con Scion o imágenes de NIH software. Tinción de colágeno con picrosirius rojo / verde rápido (Figura 2B) se puede utilizar para medir la fibrosis intersticial que se correlaciona con los índices funcionales de ^8-10 rigidez de la pared. La imagen en la figura 3 se representa la distribución de la solución de 6ul (azul de Evans) se inyecta en la zona fronteriza del corazón después de la ligadura arterial permanente. Tenga en cuenta que procede en la dirección de la lesión, así como hacia la base y también transmural.

Figura 1. A. Evan 's azul se inyecta en la aorta antes de la escisión. Esta imagen muestra las regiones de perfusión del corazón (manchado) y la zona ocluida (sin manchas). Evan B.' s azul y manchas TTC siguientes efectos agudos de isquemia / reperfusión. Esta es una imagen representativa (20x) que muestra la distribución del colorante azul que se tiñe las regiones sin oclusión, así como la tinción de tejido viable TTC metabólicamente (rojo). Áreas necróticas no mancha y lo que se mantienen pálido (contorno).

Figura 2. A. hematoxilina y eosina. Se trata de una imagen representativa (20x) de la tinción H & E de un corazón de ratón cortada transversalmente a través de la región del infarto a los 4 días post-infarto (20x). * Denota la necrosis de los tejidos, las flechas apuntan al tejido de granulación, RV = ventrículo derecho y ventrículo LV = izquierda. B. Picrosirius rojo y verde rápido mancha. Este es unLa imagen (20x) de picrosirius rojo / verde tinción rápida de una sección transversal de corazón de ratón a las 4 semanas post-infarto de miocardio. El verde citoplasma manchas y fibras de colágeno son de color rojo.

Figura 3. Azul distribución del colorante de Evan mancha después de la inyección intramiocárdica 6ul. Esta es una imagen representativa que muestra la distribución global y transmural del colorante azul de Evans a través del corazón después de la inyección intramiocárdica 6ul en la zona de frontera inmediatamente después de la ligadura de la arteria coronaria (12x).

Discusión

La enfermedad coronaria sigue siendo un método epidemiológico y fiscalmente problema de salud pública. La investigación básica sigue siendo considerable para comprender los mecanismos por los que las lesiones y remodelación proceder y cómo terapéuticos potenciales pueden modular estos procesos para que puedan ser desarrollados para su uso clínico. Los roedores son los más utilizados y la amplia gama de ratones modificados genéticamente, consigue de esta especie un modelo más atractivo.

Aunque hay diferencias entre los ratones y otras especies, hay muchas ventajas para un modelo murino. El uso de un ámbito sencillo de disección o una lupa y las condiciones de buena iluminación permitirá a la vasculatura para ser visto con facilidad (por la anatomía detallada bruto de la vasculatura, véase Salto-Téllez et al., 2004 ^13). Para reducir el riesgo de mortalidad postoperatoria, es muy importante para evitar la ruptura de grandes vasos ya que el volumen total de sangre de un ratón de 25 g es menor de 2 ml ^14. En el caso de que la hemorragia excesiva, aplicación suave de la presión o cauterización señalar se puede utilizar para detener el sangrado.

Este procedimiento también puede ser modificado en una variedad de maneras. Por ejemplo, los ratones pueden ser anestesiados con isoflurano, la ketamina / xilazina, o pentobarbital sódico y la selección apropiada es determinada por la duración del protocolo de ^15-18. El reflejo de los pies-pinch es el índice más utilizado de la profundidad de la anestesia. Además, para mejorar la probabilidad de supervivencia a largo plazo, algunos investigadores utilizan fármacos antiarrítmicos como la lidocaína para reducir la incidencia de arritmias letales ^19,20 sin embargo, debe tenerse en cuenta que este ha sido recientemente demostrado tener propiedades anti-apoptóticas en una aguda modelo ^21. Además, para reducir el dolor postoperatorio, los analgésicos como la buprenorfina puede ser administrada durante las primeras 48 horas después de la cirugía ^{3,16,17,22,23.} Para mantener la temperatura corporal durante la cirugía (especialmente para los más protocolos), una sonda rectal en serie con un cojín de la calefacción es a menudo usado en lugar de la almohadilla isotérmica. De la isquemia / reperfusión / o pre-isquémica o poscondicionamiento: la duración de la oclusión (s) y la reperfusión (s) puede ser alterado;; para oclusión permanente, el tamaño del infarto puede ser modificado mediante el ajuste de la ubicación de la ligadura y para inyección intramiocárdica (por ejemplo, células, proteínas), no puede haber lugares 1.3 de inyección y el volumen por inyección puede ser de hasta 15 l ^24. Si las células se inyectan, el calibre de la aguja utilizada (usualmente 26-30) ^5,25,26 deben ser elegidos con base en el tamaño de las células de modo que el diámetro interno de la aguja es lo suficientemente grande para evitar Sheering. Para evitar confunde debido a procesos inflamatorios provocados por la cirugía, algunos investigadores han reportado con una trampa que se manipula ex vivo para ocluir y reperfundir el corazón de un ratón de tórax cerrado en cualquier momento después de la cirugía ^27-29. Más recientemente, Gao et al. ³⁰ han demostrado que la oclusión temporal y permanente se puede realizar sin la necesidad de ventilación y algunos laboratorios han empezado a utilizar el ultrasonido para llevar a cabo a tórax cerrado intramiocárdica inyecciones ^25,31.

Desde el primer estudio que demuestra la viabilidad de la ligadura de la arteria coronaria en ratones fue publicado por Johns y Olson en 1954, ^{de 32 años,} muchos otros han adoptado este modelo y lo modificó para estudiar diversos aspectos de la lesión miocárdica y remodelación ^3,33-45. La naturaleza de los ratones en términos de tamaño, capacidad de reproducción, y el costo relativamente menor para la compra y mantenimiento hacen que esta especie en una herramienta atractiva para una amplia gama de estudios fisiológicos y fisiopatológicos. A medida que la miniaturización de la tecnología para obtener imágenes de los avances en vivo ^46-49, así como los medios para llevar a cabo y analizar la genómica y la proteómica a gran escala, la detección de drogas, la eficacia de las terapias basadas en células y / o proteínas, así como biomateriales ^50-64, en combinación con el número cada vez mayor de las manipulaciones genéticas ofrecidas por todas partes o tejidos específicos de los ratones transgénicos o mutantes / octavos de final, el modelo murino de infarto de miocardio, sin duda, seguirá siendo una herramienta muy valiosa en la evaluación del daño cardíaco agudo y la remodelación a largo plazo. Por lo tanto, no es un valor incuestionable en el poder para llevar a cabo estos experimentos de forma fiable y reproducible.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Vanna Scissors	George Tiemann & Co.	160-159
Micro Dissecting Scissors	George Tiemann & Co.	160-161
Forceps – straight, 1x2 teeth	George Tiemann & Co.	105-205
Scalpel handle #3	George Tiemann & Co.	105-64	#10 sterile blade
Forceps – half curved serrated	George Tiemann & Co.	160-19
Tissue Scissors	George Tiemann & Co.	105-410
Castroviejo Needle Holder	Miltex Inc.	18-1828
Cook Eye Speculum	Miltex Inc.	18-63
Surgipro II 8-0	Suture Express	VP-900-X
Prolene 6-0	Suture Express	8776
Germinator 500 Bead Sterilizer	Cellpoint Scientific	65369-1
Deltaphase isothermal pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP
Hamilton syringe - 25μl	Hamilton Co	80430
30 gauge beveled needle	Hamilton Co	7803-07
Ventilator	Kent Scientific	TOPO