Legatura dell'arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto

Riepilogo

Numerose manipolazioni genetiche e / o iniezioni intramiocardiche di geni, proteine, cellule e / o biomateriali si sovrappongono la dimensione del tempo negli studi di acuta ischemia / riperfusione e rimodellamento cronica nel topo. Questo video illustra le procedure di microchirurgia per ischemia / riperfusione, permanente legatura delle arterie coronarie, e gli studi di iniezione intramiocardico.

Abstract

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.

Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.

Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.

Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Protocollo

1. Sterili strumenti chirurgici (Tabella 1) e 3 "applicatori di cotone con punta sono disposti su un underpad sterile. Lo sterilizzatore tallone (Germinator 500) è acceso.
2. Topi (età:> 6 settimane, peso:> 18g) sono anestetizzati con una iniezione ip di 20μl / g BW di tribromoethanol (250mg/kg, durata - circa 40 minuti).
3. Quando i topi non rispondono alla punta pizzico, un lubrificante sterile (Tears rinnovata) è applicato agli occhi per proteggerli dalla disidratazione e il lato sinistro del petto è rivestita con depilatorio (ad esempio Nair) per rimuovere pelo dalla pelle.
4. Il depilatoria viene lavato via con acqua corrente calda e betadine / alcool tampone è usato per disinfettare l'area chirurgica.
5. Il mouse è posizionato su una calda pad DeltaPhase isotermici che è fissato a un tavolo di plexiglass. Ogni arto è immobilizzato con del nastro e un filo spesso viene posta orizzontalmente sotto i denti superiori per tenere la mascella superiore al suo posto.
6. Il tavolo è in posizione verticale e una luce a fibre ottiche è brillato direttamente sulla regione del collo per l'illuminazione transesofagea. Ciò richiede un posizionamento preciso in modo che l'apertura della gola è visto come un orifizio ben illuminato, permettendo così la trachea da visualizzare per facilitare l'inserimento del tubo in PE.
7. Il tubo viene poi collegato al ventilatore (collegato ad un 95% O ₂ / 5% di CO ₂₎ per amministrare costante ventilazione a pressione positiva (TOPO ventilatore; tasso di 125 atti / min, picco di pressione inspiratoria 10-12 cm H ₂ O; nota * : le impostazioni variano a seconda ceppo e sesso 1-3). Una volta che la ventilazione è confermata dai movimenti del torace sincrono, la connessione è fissato per il pad con del nastro adesivo per evitare estubazione durante l'intervento.
8. Utilizzando pinze a denti per tirare la pelle in alto e lontano dal petto, una lama # 10 bisturi sterile collegato ad un manico # 3 bisturi viene utilizzato per fare un'incisione 1,5 centimetri in parallelo pelle allo sterno.
9. Curve microscissors Vanna sono usati per tagliare i muscoli pettorali e fare un piccolo buco nel muscolo intercostale.
10. Dritto, microscissors smussato sono usati per tagliare a 3 costole.
11. Uno speculum 9 millimetri oftalmico pediatrica è utilizzata per ritirare la gabbia toracica.
12. Utilizzando la pinza curva, tirare il pericardio lontano dal cuore e usare la pinza dentata di strappare delicatamente aperta.
13. Utilizzando la porta aghi Castroviejo, un punto di 6 millimetri conico 3 / 8 fili degli aghi del 8-0 sutura polietilene sotto discendente anteriore dell'arteria coronarica (lungo l'asse del cuore) perpendicolare ad esso.
    1. Per una legatura temporanea che può essere rimossa per riperfusione a tempo, una sterile 0,5-1cm pezzo di PE90 è posto sul cuore in parallelo per l'arteria coronaria. La sutura, che è stato prima in loop sotto l'arteria coronaria, viene poi legata al tubo. Nel momento in cui deve essere rilasciata, la legatura è allentato. Questo può essere ripetuto a piacere e il tempo di occlusione / riocclusione può essere modificata ^4. A seconda della lunghezza del protocollo e il tipo di anestesia utilizzato, l'integrazione può essere necessario.
    2. Per una occlusione permanente, la legatura cucita sotto l'arteria coronaria è semplicemente legato. Sbiancamento e discinesia sono evidenti e l'estremità lunga della sutura viene tagliato ^5-10.
    3. Per l'iniezione intramiocardico (s), una siringa sterile Hamilton con un ago sterile da 30 gauge smussato è introdotto nella base del cuore sopra l'area di lesione sul lato destro della legatura. L'ago viene poi avanzate nella zona di lesione e ritirata leggermente in modo che la smussatura può essere visto circa nella zona di confine. Alcune delle soluzione nella siringa (2-3μl) viene iniettato nel cuore e l'ago viene tenuto in posizione. La siringa è ritirato un altro 1-3mm e il resto della soluzione viene iniettata. La siringa è tenuto in posizione fino a quando il bleb che è formato dalla soluzione dissipa. L'ago viene poi rimossa. Se non vi è alcun sanguinamento, un cotton-applicatore con la punta è leggermente premuto sul sito inserimento dell'ago fino a quando il sanguinamento si ferma ^5-7.
14. Una volta che le manipolazioni del miocardio sono state completate, la costola divaricatori vengono rimosse e la cavità toracica è chiuso con 2-3 punti di sutura materasso utilizzando 6-0 sutura surgipro.
15. Due-tre punti di sutura materasso sono poi messi a chiudere i muscoli pettorali, 1-3 gocce del 0,25% 1:10 marcaine in soluzione salina sterile (mouse 0.1ml/25g) viene applicato al muscolo e poi 2-3 suture materassi sono fatti per chiudere la pelle.
16. Il mouse viene rimosso dal ventilatore. Una volta respirazione ritmica, rapido, poco profondo è verificata, il mouse può essere estubato.
17. 0,5 ml soluzione salina calda sterile viene iniettata nello spazio sottocutaneo dorsale e il mouse è posizionato su un blocco del riscaldamento in una gabbia fino a quando non riprende la mobilità (minimo 1 ora).
18. Per gli esperimenti di sopravvivenza, i topi sono rimessi nelle loro gabbie e restituita al vivaio fino al momento del sacrificio. Durante i primi 2 giorni, il cibo è inumiditoimmessi sul pavimento della gabbia per facilitare l'alimentazione (in modo da non dover arrivare fino che possono provocare dolore) e la buprenorfina deve essere somministrato ogni 6-12h. Post-operatorio comprende anche il monitoraggio quotidiano per la prima settimana per verificare la mobilità adeguata, governare, e le abitudini alimentari.
19. Gli strumenti chirurgici sono puliti con etanolo e inserita nel tallone sterilizzatore prima dell'intervento successivo.
20. Al momento del sacrificio, i topi vengono anestetizzati con sodio pentobarbital (65mg/ml; 55-65 mg / kg). Quando un piano adeguato di anestesia viene raggiunto, la cavità toracica è aperta.
21. Mentre il cuore batte ancora, una siringa con un ago 23 gauge contenente cloruro di potassio a freddo (KCl, 30 mm) o 2,3-butanedione monoxime (BDM; 10mM) viene utilizzato per forare la regione posteriore basale del ventricolo e la soluzione è lentamente iniettato nella camera fino a quando il cuore è arrestato in diastole.
22. Una volta che il cuore è rimosso, una siringa contenente PBS viene utilizzato per perfusione retrograda lavare il cuore per rimuovere il sangue che rimane. Per gli studi acuti, alla fine del periodo di riperfusione, il LAD è ri-legatura nel punto di occlusione originale. Una soluzione contenente 1% di Evan blu viene iniettato nell'aorta. Una volta che il cuore è estratto, è tagliato trasversalmente in 3 sezioni di uguale spessore, incubate in 1% 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro, e ripreso per le analisi morfometriche ^11. Per gli studi cronici, il cuore viene poi immerso in fissativo, poi elaborati e integrati secondo le procedure di routine. Le diapositive possono essere colorati istologicamente e ripreso per l'analisi morfometrica (utilizzando Scion, NIH immagine J, o Image Pro Plus) ^9,10,12.

Rappresentante dei risultati:

Se fatto correttamente, i tassi di sopravvivenza nei topi (maschi: età 8-10 settimane, 22-28g; femmine: età 10-12 settimane, 20-26g) sono: oltre il 90% in acuto ischemia / riperfusione e precondizionamento ischemico esperimenti, oltre 85% in studi permanente legatura dell'arteria, e circa il 80% per iniezioni intramiocardiche. Dal trauma precoce è più visibile da cambiamenti metabolici piuttosto che strutturale, la determinazione dimensione infartuale in ischemia / riperfusione e ischemico esperimenti precondizionamento viene eseguita infondendo l'1% di Evan colorante blu in aorta che perfusione del cuore che non è fornito dal LAD ( Figura 1A). Una volta che il cuore viene rimosso e trasversalmente tagliato a metà, il tessuto è incubato in 1% di soluzione di cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio per misurare la dimensione dell'infarto (Figura 1B). Le aree sono misurati utilizzando Scion o NIH software di imaging che può essere calibrato utilizzando un micrometro fotografato allo stesso ingrandimento. Questi numeri sono usati per calcolare l'area a rischio / ventricolo sinistro e infarto dimensioni / area a rischio ^11. Differenze di ceppo può portare a variazioni di peso corporeo e le dimensioni del cuore e quindi occorre prestare attenzione a queste misure per normalizzare il peso del cuore, peso corporeo, o la lunghezza della tibia ai fini comparativi.

Permanente risultati legatura dell'arteria lordo cambiamenti strutturali quali necrosi, parete assottigliamento e dilatazione della camera. Confronto degli effetti del trattamento e / o temporali dell'infarto e necrosi rispetto al ventricolo sinistro, zona camera, parete sinistra del setto e spessore della parete ventricolare libera nel modello occlusione permanente (Figura 2A) può essere misurata utilizzando Scion o NIH di imaging software. Colorazione del collagene con picrosirius rosso / verde veloce (Figura 2B) può essere utilizzato per misurare la fibrosi insterstitial che è correlato agli indici funzionali di ^8-10 irrigidimento della parete. L'immagine in Figura 3 rappresenta la distribuzione della soluzione 6ul (Evan blu) iniettato nella zona di confine del cuore dopo legatura dell'arteria permanente. Si noti che si procede nella direzione della lesione così come verso la base e anche transmurally.

Figura 1. A. Evan 's Blu iniettata nell'aorta prima escissione. Questa immagine mostra le regioni perfusi del cuore (macchiato) e la zona occlusa (senza macchia). Evan B.' s Blue e colorazione TTC acuta da ischemia / riperfusione. Questa è un'immagine rappresentativa (20x) che mostra la distribuzione colorante blu che macchiato le regioni non occluse così come colorazione TTC del tessuto metabolicamente vitali (rosso). Aree necrotiche non macchia e così rimangono pallidi (descritto).

Figura 2. A. ematossilina e eosina. Questa è un'immagine rappresentativa (20x) della colorazione H & E di un cuore topo tagliati trasversalmente in tutta la regione infarto a 4 giorni dopo l'infarto miocardico (20x). Il * denota necrosi dei tessuti, le frecce indicano tessuto di granulazione, RV = ventricolo destro e ventricolo LV = sinistra. B. Picrosirius rosso e veloce verde macchia. Si tratta di unrappresentante immagine (20x) di picrosirius rosso / veloce colorazione verde di una sezione del cuore del mouse a 4 settimane post-infarto miocardico. Il verde citoplasma macchie e le fibre di collagene sono rossi.

Figura 3. Blu di Evan distribuzione colorante macchia seguenti 6ul iniezione intramiocardico. Questa è un'immagine rappresentativa che mostra la distribuzione globale e transmurale della tintura blu di Evan tutto il cuore segue 6ul iniezione intramiocardico alla zona di confine subito dopo la legatura dell'arteria coronaria (12x).

Discussione

Malattia coronarica continua ad essere un epidemiologico e fiscalmente rilevante problema di sanità pubblica. Notevole la ricerca di base è ancora necessaria per capire i meccanismi con cui lesioni e rimodellamento procedere e come potenziali terapie possono modulare questi processi, se si vuole essere sviluppate per uso clinico. Roditori sono più comunemente utilizzati e la vasta gamma di topi geneticamente modificati, rende disponibile questa specie un modello più attraente.

Anche se ci sono differenze tra topi e altre specie, ci sono molti vantaggi a un modello murino. L'uso di un ambito semplice dissezione o lente d'ingrandimento e condizioni ben illuminata per consentire la vascolarizzazione facilmente essere visto (per informazioni dettagliate anatomia del sistema vascolare, vedere Salto-Téllez et al., 2004 ^13). Per ridurre il rischio di mortalità post-operatoria, è molto importante evitare di recidere vasi di grandi dimensioni in quanto il volume totale del sangue di un topo 25g è inferiore a 2 ml ^14. In caso di eccessivo sanguinamento si verifica, l'applicazione delicata di pressione o cauterizzazione individuare può essere usato per fermare l'emorragia.

Questa procedura può anche essere modificata in diversi modi. Per esempio, i topi possono essere anestetizzati con isoflurano, ketamina / xylazina, o sodio pentobarbital e un'adeguata selezione è determinata dalla durata del protocollo ^15-18. La punta pizzico riflesso è l'indice più utilizzato della profondità dell'anestesia. Inoltre, per aumentare la probabilità di sopravvivenza a lungo termine, alcuni ricercatori utilizzano farmaci antiaritmici, come lidocaina per ridurre l'incidenza di aritmie letali ^19,20 però, si deve tener conto che questo è stato di recente dimostrato di avere proprietà antiapoptotiche in un acuto modello ^21. Inoltre, per ridurre il dolore post-operatorio, analgesici come la buprenorfina può essere somministrato per le prime 48 ore dopo l'intervento ^{3,16,17,22,23.} Per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico (soprattutto per i più protocolli), una sonda rettale in serie con una piastra elettrica è spesso usato al posto del pad isotermici. Per ischemia / riperfusione e / o pre-ischemico o postconditioning: la durata dell'occlusione (s) e riperfusione (s) può essere modificata, per occlusione permanente, la dimensione dell'infarto può essere modificato regolando la posizione della legatura; e per le iniezioni intramiocardiche (es. cellule, proteine), ci possono essere posizioni di iniezione 1-3 e il volume per iniezione può essere fino a 15 microlitri ^24. Se le cellule vengono iniettate, il calibro dell'ago utilizzato (di solito 26-30) ^5,25,26 deve essere scelto in base alle dimensioni delle celle in modo che il diametro interno dell'ago è grande abbastanza per evitare Sheering. Per evitare confonde a causa di processi infiammatori innescati da l'intervento, alcuni ricercatori hanno riferito di usare una trappola che viene manipolato ex vivo per occludere e reperfuse il cuore in petto un topo chiuso in qualsiasi momento dopo l'intervento chirurgico ^27-29. Più recentemente, Gao et al. ³⁰ hanno dimostrato che l'occlusione temporanea e permanente può essere eseguito senza la necessità di ventilazione e di alcuni laboratori hanno iniziato ad utilizzare gli ultrasuoni per eseguire chiuso petto intramiocardico iniezioni ^25,31.

Dal momento che il primo studio che dimostrano la fattibilità di legatura dell'arteria coronarica nei topi è stato pubblicato da Johns e Olson nel 1954 ^32, molti altri hanno adottato questo modello e modificato per studiare vari aspetti del danno miocardico e rimodellamento ^3,33-45. La natura di topi in termini di dimensioni, capacità riproduttiva, e relativamente meno spese per l'acquisto e la manutenzione rendono questa specie uno strumento interessante per una vasta gamma di studi fisiologici e fisiopatologici. Come la miniaturizzazione della tecnologia per l'imaging in vivo degli anticipi ^46-49, così come mezzo per eseguire ed analizzare su larga scala genomica e proteomica, screening di farmaci, l'efficacia di terapie basate sulle cellule e / o di proteine ​​così come biomateriali ^50-64, combinato con la gamma sempre più ampia di manipolazioni genetiche offerta da topi specifiche ubiquitaria o tessuto transgenici o mutanti / eliminazione diretta, il modello murino di infarto miocardico senza dubbio continuerà ad essere uno strumento prezioso nella valutazione lesione acuta rimodellamento cardiaco e lungo termine. Pertanto, non vi è valore indiscutibile di essere in grado di effettuare questi esperimenti in modo affidabile e riproducibile.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Vanna Scissors	George Tiemann & Co.	160-159
Micro Dissecting Scissors	George Tiemann & Co.	160-161
Forceps – straight, 1x2 teeth	George Tiemann & Co.	105-205
Scalpel handle #3	George Tiemann & Co.	105-64	#10 sterile blade
Forceps – half curved serrated	George Tiemann & Co.	160-19
Tissue Scissors	George Tiemann & Co.	105-410
Castroviejo Needle Holder	Miltex Inc.	18-1828
Cook Eye Speculum	Miltex Inc.	18-63
Surgipro II 8-0	Suture Express	VP-900-X
Prolene 6-0	Suture Express	8776
Germinator 500 Bead Sterilizer	Cellpoint Scientific	65369-1
Deltaphase isothermal pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP
Hamilton syringe - 25μl	Hamilton Co	80430
30 gauge beveled needle	Hamilton Co	7803-07
Ventilator	Kent Scientific	TOPO