Enfarktüsü bir murin Model Koroner Arter ligasyon ve intramiyokardiyal Enjeksiyon

Özet

Çok sayıda genetik manipülasyonlar ve / veya genler, proteinler, hücre ve / veya biyomalzemeler intramiyokardiyal enjeksiyonu, akut iskemi / reperfüzyon hasarı ve farelerde kronik remodeling çalışmaları zaman boyutu üzerine bindirilmiş. Bu video iskemi / reperfüzyon için mikrocerrahi prosedürleri, kalıcı koroner arter ligasyonu ve intramiyokardiyal enjeksiyon çalışmaları göstermektedir.

Özet

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.

Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.

Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.

Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Protokol

1. Steril cerrahi aletler (Tablo 1) ve 3 "pamuk uçlu aplikatörler steril bir underpad yerleştirilir. Boncuk sterilizatör (Germinator 500) açık.
2. Fare (yaş:> 6 hafta ağırlık: 18g) bir ip tribromoethanol 20μl / g BW (süresi yaklaşık 40 dakika 250mg/kg) enjeksiyonu ile anestezi vardır.
3. Farelerin ayak tutam steril bir yağ (Tears Yenilendi) yanıt vermeyen gözlerde kuruma ve göğsünün sol tarafında onları korumak için uygulanan deri kürk kaldırmak için tüy dökücü (örneğin Nair) ile kaplanmıştır.
4. Tüy dökücü, ılık akan su ve betadin / alkol sürüntü cerrahi alanı dezenfekte etmek için kullanılır ile yıkanıp.
5. Fare bir pleksiglas tablo sabit bir sıcak deltaphase izotermal ped üzerine yerleştirilir. Her bacak bandı kullanılarak hareketsiz ve üst çene tutmak için kalın bir iplik üst dişlerin altında yatay olarak yerleştirilir.
6. Tablo dikey olarak yerleştirilmiş ve bir fiberoptik ışık transözofageal aydınlatma için boyun bölgesi üzerine doğrudan parlıyordu. Böylece trakea PE boru ekleme kolaylaştırmak için görüntülenebilmekte sağlayan, boğaz açma, iyi aydınlatılmış bir orifis olarak görülüyor böyle hassas bir şekilde yerleştirilmesi gerekir.
7. Hızı 125 solunum / dakika;; pik inspiratuar basınç 10-12 _cmH2O * not tüp daha sonra sürekli pozitif basınçlı ventilasyon (TOPO ventilatör yönetmek için ventilatör (% 95 _O 2 /% 5 _CO 2 bağlı) bağlı olduğu ayarları) zorlanma ve cinsiyet 1-3 ile değişir. Havalandırma senkron göğüs hareketleri tarafından onaylandıktan sonra, bağlantı, ameliyat sırasında ekstübasyon önlemek için ped bant ile sabitlenir.
8. # 3 neşter kolu bağlı bir # 10 steril neşter bıçağı, göğüs cildi yukarı çekin dişli forseps kullanma ve uzak 1.5cm sternum için cilde paralel bir kesi yapmak için kullanılır.
9. Kavisli Vanna microscissors pektoralis kasları kesmek ve küçük bir delik interkostal kas yapmak için kullanılır.
10. Düz, künt microscissors 3 kaburga üzerinden kesmek için kullanılır.
11. 9mm pediatrik oftalmik spekulum göğüs kafesi geri çekmek için kullanılır.
12. Kavisli bir forseps kullanarak, kalp uzak perikard çekin ve hafifçe açık gözyaşı dişli forseps kullanabilir.
13. Castroviejo iğne tutucu, 6mm konik noktası 3 / 8 iğne konuları kullanarak, sol ön inen koroner arter (kalbin uzun ekseni boyunca) altında 8-0 polietilen dikiş dik.
    1. Zamanlı reperfüzyon için çıkarılabilir geçici bir ligatür için, PE90, steril bir 0.5-1cm adet paralel olarak koroner arter kalp üzerine yerleştirilir. Ilk koroner arter altında döngüye olmuştur dikiş, sonra boru bağlıdır. Serbest bırakılmasını zamanda ligatür gevşetti. Istenen ve oklüzyon / reocclusion süresi ⁴ değiştirilebilir tekrar edilebilir. Protokol ve kullanılan anestezi türü uzunluğuna bağlı olarak, takviyesi gerekli olabilir.
    2. Kalıcı bir oklüzyon için, koroner arter altında bağcıklı ligatür sadece bağlıdır. Beyazlaşma ve diskinezi belirgin ve uzun dikiş sonunda ^5-10 kesilir.
    3. Için intramiyokardiyal enjeksiyon (ler), Hamilton 30 gauge eğimli steril iğne ile steril bir şırınga ligatür sağ tarafında yaralanma alanının üstünde kalp üssü haline getirilmiştir. Iğne sonra yaralanma alana, gelişmiş ve biraz bu yüzden konik yaklaşık sınır bölgesi görülebilir içine kapanık. Bazı çözüm şırınga (2-3μl) kalp içine enjekte edilir ve iğne yerinde tutulur. Şırınga, başka bir 1-3mm geri çekilir ve çözüm geri kalanı enjekte edilir. Çözümü ile oluşan bleb çözülene kadar şırınga yerinde tutulur. İğne sonra kaldırılır. Herhangi bir kanama varsa ^kanama 5-7 durana kadar, bir pamuk uçlu bir aplikatör yavaşça iğne ekleme sitesi üzerine basıldığında.
14. Miyokard manipülasyonlar tamamlandıktan sonra, kaburga retraktörlere kaldırılır ve göğüs boşluğu 6-0 surgipro sütür kullanarak 2-3 yatak dikişlerle kapatılır.
15. İki-üç yatak dikişlerle sonra 1-3 damla steril serum fizyolojik içinde% 0.25 marcaine 01:10 (0.1ml/25g fare), pektoral kaslar kapatmak için yapılır kas uygulanır ve daha sonra 2-3 yatak sütür yapılır cilt kapatın.
16. Fare ventilatör kaldırılır. Sığ, hızlı, bir kez ritmik nefes doğrulanır, fare ekstübe edilebilir.
17. 0.5 ml ılık steril serum fizyolojik dorsal subkutan alanı içine enjekte edilir ve bu hareketlilik (1 saat minimum) yeniden kazanıncaya kadar fareyi bir kafes içinde bir ısıtıcı yerleştirilir.
18. Hayatta kalma deneyler, farelerin kafesleri içine geri yerleştirilir ve kurban zamanına kadar vivaryum döndü. Ilk 2 gün boyunca, nemlendirilmiş bir besindir(bu yüzden, ağrıya neden olabilir ulaşmak zorunda değilsiniz) besleme kolaylaştırmak için kafes katta yerleştirilmiş ve buprenorfin her 6-12saat uygulanmalıdır. Post-operatif bakım yeterli hareketlilik, bakım ve beslenme alışkanlıkları da doğrulamak için ilk hafta için günlük izleme içerir.
19. Cerrahi aletler, etanol ile temiz sildi ve sonraki ameliyat öncesi boncuk sterilizatör içine eklenir.
20. Kurban zamanda, fare pentobarbital sodyum ile anestezi (55-65 mg / kg 65mg/ml). Anestezi yeterli bir düzlem elde edilir, göğüs boşluğu açıldı.
21. Kalp hala atıyor iken, 23 gauge soğuk potasyum klorür içeren iğne (KCl, 30mm) veya 2,3-butanedione ile bir şırınga monoxime (DGM; 10mM) ponksiyon ventrikül posterior bazal bölge ve çözüm için kullanılır. kalp diyastol tutuklandı kadar yavaşça odasına enjekte edildi.
22. Kalp kaldırıldıktan sonra, PBS içeren bir şırınga retrograd kalan kan kaldırmak için kalp durulama serpmek için kullanılır. Akut çalışmalar için, reperfüzyon dönemi sonunda, LAD oklüzyonu orijinal noktada yeniden bağlandı. % 1 Evan mavi içeren bir çözüm aort içine enjekte edilir. Kalp ayıklanır sonra, 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür% 1 inkübe 3 bölüme eşit kalınlıkta enine kesilmiş ve morfometrik analizler ¹¹ için görüntülü. Kronik çalışmalar için, kalp daha sonra daha sonra rutin prosedürlere göre işleme ve gömülü fikse. Slaytlar histolojik sonra lekeli ve ^9,10,12 (filiz, NIH Image J veya Image Pro Plus kullanarak) morfometrik analizler için görüntülü olabilir.

Temsilcisi Sonuçlar:

doğru bir şekilde yapılırsa, farelerde sağkalım oranları (erkek yaşı 8-10 hafta, 22-28g; kadın: yaşı 10-12 hafta, 20-26g):% 90 üzerinde akut iskemi / reperfüzyon ve iskemik ön deneyler, üzerinde % 85, kalıcı arter ligasyonu çalışmaları ve intramiyokardiyal enjeksiyonlar için yaklaşık% 80. Erken yaralanma olduğundan daha kolay görünür metabolik değişiklikler, iskemi / reperfüzyon ziyade yapısal, infarkt büyüklüğü ve iskemik ön deneyler LAD tarafından sağlanan kalp serpmek aort içine% 1 Evan mavi boya beslerken tarafından yapılır ( Şekil 1A). Kalp yarısında kaldırılır ve enine kesilmiş sonra, doku infarkt (Şekil 1B) ölçmek için 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür% 1 çözüm inkübe edilir. Alanları filiz veya aynı büyütme görüntülü bir mikrometre kullanarak kalibre edilebilir NIH görüntüleme yazılımı kullanılarak ölçülür. Bu numaralar, risk / sol ventrikül ve infarkt ^riski 11 / alan boyutu alanı hesaplamak için kullanılır . Gerilme farklılıklar, kalp ağırlığı, vücut ağırlığı ya da karşılaştırma amaçlı tibia uzunluğu bu önlemleri normalleştirmek için bakım alınmalıdır vücut ağırlığı ve kalp boyutu ve bu nedenle varyasyonlar neden olabilir.

Böyle bir nekroz olarak brüt yapısal değişiklikler kalıcı arter ligasyonu, duvar incelmesi ve oda dilatasyon. Infarkt ve kalıcı oklüzyon modeli (Şekil 2A) sol ventrikül, oda alanı, septal duvar ve sol ventrikül serbest duvar kalınlığı göre nekroz tedavi ve / veya zaman etkilerinin karşılaştırılması da filiz veya NIH görüntüleme kullanılarak ölçülebilir yazılım. Picrosirius, kırmızı / hızlı yeşil (Şekil 2B) Kollajen boyama duvar ^sertleşme 8-10 fonksiyonel indeksleri ilişkilidir insterstitial fibrozis ölçmek için kullanılabilir . Şekil 3'te görüntü dağıtım kalıcı arter ligasyonu sonrası kalp sınır bölgesine enjekte 6ul çözüm (Evan mavi) temsil eder. Yanı sıra temel doğru olarak ve aynı zamanda transmurally yaralanma yönde ilerler dikkat edin.

Şekil 1. A. Evan 'in Blue önce eksizyon aort enjekte Bu görüntü kalp (lekeli) ve tıkalı alanı (lekesiz) perfüze bölgeleri gösterir. B. Evan' akut iskemi / reperfüzyon hasarı Mavi ve TTC boyama. Bu unoccluded bölgelerinde metabolik canlı doku TTC boyama (kırmızı) gibi boyanmış mavi boya dağılımını gösteren temsili resim (20x). Nekrotik alanlar leke yoktur ve bu yüzden (ana hatları) soluk kalır.

Şekil 2. A. Hematoksilen ve eosin boyası Bu post-MI (20x), 4 gün infarkt bölgenin boyunca enine kesilmiş bir fare kalp H & E boyama temsil eden bir görüntü (20x) . * Doku nekrozu gösterir, oklar granülasyon dokusu, RV = sağ ventrikül ve LV = sol ventrikül B. Picrosirius kırmızı ve yeşil hızlı leke Bu birpicrosirius kırmızı / 4 hafta post-MI fare kalp bir kesit hızlı yeşil boyama temsilcisi görüntü (20x). Sitoplazma lekeler yeşil ve kollajen lifleri kırmızı.

6ul intramiyokardiyal enjeksiyon aşağıdaki Şekil 3. Evan Mavi boya leke dağılımı. Bu kalp koroner arter ligasyonu (12x) hemen ardından sınır bölgesi 6ul intramiyokardiyal enjeksiyon boyunca küresel ve transmural Evan Mavi boya dağılımını gösteren temsili bir resim.

Tartışmalar

Koroner kalp hastalığı, epidemiyolojik ve mali açıdan önemli bir halk sağlığı problemi olmaya devam etmektedir. Halen önemli bir temel araştırma, yaralanma ve yeniden yapılanma devam hangi mekanizmalar ve klinik kullanım için geliştirilen isteniyorsa potansiyel terapötikler bu süreçleri modüle anlamak için gerekli. Kemirgenler en sık kullanılan ve genetik olarak değiştirilmiş fareler geniş bu türün daha cazip bir model kılar.

Fare ve diğer türler arasında farklılıklar olmasına rağmen, bir fare modeli pek çok avantajı vardır. Basit bir diseksiyon kapsamı veya büyüteç kullanın ve iyi aydınlatılmış koşullarda damar kolayca görülebilir (damarsal detaylı brüt anatomisi, Salto-Tellez ve ark., 2004 ^13). 25g bir fare toplam kan hacminin 2ml ¹⁴ daha az olduğundan post-operatif mortalite riski azaltmak için, büyük damarların kesilmesinin önlemek için çok önemlidir. , Aşırı kanama oluşur durumunda, basınç veya belirlemekte koterizasyon nazik uygulama, kanamayı durdurmak için kullanılabilir.

Bu işlem aynı zamanda çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Örneğin, fare, izofluran, ketamin / xylazine veya sodyum pentobarbital ve uygun seçimi ^protokol 15-18 süresi tarafından belirlenir kullanarak narkoz olabilir . Toe-tutam refleks anestezi derinliği en yaygın olarak kullanılan bir endeks. Ayrıca, uzun vadede hayatta kalma olasılığını artırmak için, bazı araştırmacılar, öldürücü ^aritmi 19,20 ancak, bu son zamanlarda akut antiapoptotik özellikleri olduğu gösterilmiştir edildiğini dikkate alınması gerekir insidansını azaltmak için, lidokain gibi antiaritmik ilaçlar modeli ^21. Ayrıca, ameliyat sonrası ağrıyı azaltmak için analjezikler, buprenorfin gibi cerrahi ^{3,16,17,22,23} sonra ilk 48 saat boyunca uygulanmalıdır. Ameliyat sırasında vücut ısısı (özellikle uzun protokoller için) korumak için, bir ısıtma yastığı ile seri bir rektal prob izotermal ped yerine sık sık kullanılır. Kalıcı oklüzyon, infarkt boyutunu ligatür yerini ayarlayarak değişiklik olabilir; tıkanıklığı (ler) ve reperfüzyon (ler) süresi değişmiş olabilir: iskemi / reperfüzyon ve / veya iskemik ön veya postconditioning intramiyokardiyal enjeksiyonları (örn. hücreleri, proteinler), 1-3 enjeksiyon yerlerde olması ve enjeksiyon başına hacmi 15 ul ²⁴ kadar olabilir. Hücreleri enjekte ediliyor, iğne gauge iğnenin iç çapı Sheering önlemek için yeterince büyük ^5,25,26 hücrelerin büyüklüğüne göre seçilmelidir (genellikle 26-30). Cerrahi ile tetiklenen inflamatuvar süreçler nedeniyle boşa önlemek için, bazı ^{araştırmacılar,} 27-29 ameliyat sonrası herhangi bir noktada kapalı göğüs fare kalpleri kapamak ve reperfuse ex vivo manipüle bir tuzak kullanılarak bildirdin . Daha yakın zamanlarda, Gao ve ark. ³⁰ geçici ve kalıcı oklüzyon havalandırma için gerek kalmadan yapılabilir ve bir kaç laboratuarları, kapalı göğüs intramiyokardiyal ^{enjeksiyonları} 25,31 gerçekleştirmek için ultrason kullanmaya başlamışlardır olduğunu göstermiştir .

Farelerde koroner arter ligating fizibilite gösteren ilk çalışma 1954 ³² Johns ve Olson tarafından yayımlanan bu yana, diğerleri bu model kabul edilen ve miyokard hasarı ve remodeling ^3,33-45 çeşitli yönlerini incelemek amacıyla bir değişiklik. Büyüklüğü, üreme kapasitesi, satın alma ve bakım için nispeten daha az harcama açısından fareler doğası bu türün geniş bir yelpazede fizyolojik ve patofizyolojik çalışmalar için cazip bir araç haline getirmektedir. In vivo gelişmeler ^46-49 görüntüleme teknolojisinin yanı sıra minyatür, gerçekleştirmek ve büyük ölçekli genomik ve proteomik, uyuşturucu taraması, hücre-bazlı ve / veya protein tedavilerin etkinliği yanı sıra kombine biyomalzemeler ^50-64, analiz etmek anlamına gelir. giderek daha geniş, her yerde veya doku özel transgenik veya mutant / nakavt fareler tarafından sağlanan genetik manipülasyon, miyokard infarktüsü fare modeli şüphesiz, akut kardiyak yaralanma ve uzun vadeli remodeling değerlendirilmesinde çok değerli bir araç olmaya devam edecektir. Bu nedenle, bu deneyler gerçekleştirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir olması tartışılmaz bir değeri yoktur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Vanna Scissors	George Tiemann & Co.	160-159
Micro Dissecting Scissors	George Tiemann & Co.	160-161
Forceps – straight, 1x2 teeth	George Tiemann & Co.	105-205
Scalpel handle #3	George Tiemann & Co.	105-64	#10 sterile blade
Forceps – half curved serrated	George Tiemann & Co.	160-19
Tissue Scissors	George Tiemann & Co.	105-410
Castroviejo Needle Holder	Miltex Inc.	18-1828
Cook Eye Speculum	Miltex Inc.	18-63
Surgipro II 8-0	Suture Express	VP-900-X
Prolene 6-0	Suture Express	8776
Germinator 500 Bead Sterilizer	Cellpoint Scientific	65369-1
Deltaphase isothermal pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP
Hamilton syringe - 25μl	Hamilton Co	80430
30 gauge beveled needle	Hamilton Co	7803-07
Ventilator	Kent Scientific	TOPO