Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Zusammenfassung

Zahlreiche genetische Manipulationen und / oder intramyokardialen Injektionen von Genen, Proteinen, Zellen und / oder Biomaterialien basieren auf die Dimension der Zeit in Studien zur akuten Ischämie / Reperfusion und chronischer Umbau in Mäusen überlagert. Dieses Video zeigt die mikrochirurgische Verfahren für die Ischämie / Reperfusion, permanent koronare Ligation und intramyokardialen Injektion Studien.

Zusammenfassung

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.

Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.

Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.

Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Protokoll

1. Sterile chirurgische Instrumente (Tabelle 1) und 3 "Wattestäbchen Applikatoren sind auf einem sterilen underpad platziert. Die Perle Sterilisator (Germinator 500) eingeschaltet ist.
2. Mäuse (Alter:> 6 Wochen; wt:> 18g) werden anästhesiert mit einer ip Injektion von 20 &mgr; l / g BW von Tribromethanol (250mg/kg, Dauer - ca. 40 Minuten).
3. Wenn die Mäuse nicht mehr auf Fuß-und Zuziehen, ein steriles Gleitmittel (Tears Erneute) sind auf die Augen aufgetragen, um sie vor Austrocknung und der linken Seite der Brust zu schützen, ist mit Enthaarungscreme (zB Nair) beschichtet, um Fell von der Haut entfernen.
4. Die Enthaarungscreme ist weg mit fließend warmem Wasser und betadine / Alkohol swabbing wird verwendet, um den OP-Bereich zu desinfizieren gewaschen.
5. Die Maus ist an einem warmen deltaphase isothermen Pad, die zu einem Plexiglas-Tisch fixiert ist gelegt. Jedes Glied ist immobilisiert mit Klebeband und einem dicken Faden horizontal unter der Spitze Zähne aufgestellt, um den Oberkiefer in Position zu halten.
6. Die Tabelle ist vertikal angeordnet und einen faseroptischen Licht direkt glänzte auf den Halsbereich für transösophageale Beleuchtung. Dies erfordert eine präzise Platzierung, so dass die Öffnung der Kehle, als einem gut beleuchteten Öffnung betrachtet wird, so dass die Luftröhre zu visualisieren, um das Einführen der PE-Schlauch zu erleichtern.
7. Der Schlauch wird dann an das Beatmungsgerät (verbunden mit einem 95% O ₂ / 5% CO ₂₎ verbunden ist konstant Überdruckbeatmung (TOPO Ventilator zu verwalten; bei 125 Atemzüge / min; inspiratorischen Spitzendruck 10-12 cm H ₂ O; * Beachten Sie : Einstellungen variieren je nach Belastung und Geschlecht 1-3). Nach Belüftung durch synchrone Bewegungen der Brust bestätigt wird, wird die Verbindung zum Pad mit Klebeband fixiert Extubation während der Operation zu vermeiden.
8. Mit Hakenpinzette die Haut nach oben ziehen und weg von der Brust, ein # 10 sterile Skalpell an einem # 3 Skalpellgriff wird ein 1,5 cm Hautschnitt parallel zum Brustbein zu machen.
9. Curved Vanna Mikroschere werden verwendet, um die Brustmuskeln geschnitten und machen ein kleines Loch in den Interkostalraum Muskel.
10. Gerade, sind stumpf Mikroschere verwendet, um durch 3 Rippen schneiden.
11. Eine 9mm pädiatrische Ophthalmologie Spekulum wird verwendet, um den Brustkorb eingezogen.
12. Mit der gebogenen Pinzette, ziehen Sie den Herzbeutel vom Herzen weg und nutzen Sie die gezahnten Pinzette vorsichtig aufreißen.
13. Mit dem Castroviejo Nadelhalter, ein 6mm konisch Punkt 3 / 8 Nadelfäden die 8-0 Polyethylen Naht unterhalb des linken vorderen absteigenden Koronararterie (entlang der Längsachse des Herzens) senkrecht dazu.
    1. Für eine temporäre Ligatur, die für zeitlich Reperfusion entfernt werden können, ist ein steriles 0,5-1cm Stück PE90 auf das Herz parallel zu der koronaren Arterie platziert. Die Naht, die zunächst unter der Koronararterie wurde geschleift, wird dann um den Schlauch verbunden. Zur Zeit ist es freigesetzt wird, ist die Ligatur gelockert. Dies kann beliebig wiederholt und die Zeit der Okklusion / Reokklusion können ⁴ modifiziert werden können. Abhängig von der Länge des Protokolls und der Art der Anästhesie verwendet, kann eine Ergänzung notwendig sein.
    2. Für eine dauerhafte Okklusion, ist die Ligatur unter der Koronararterie geschnürt einfach gebunden. Blanchieren und Dyskinesien sind offensichtlich und das lange Ende des Fadens wird geschnitten ^5-10.
    3. Für intramyokardialen Injektion (s), eine sterile Hamilton-Spritze mit einer 30-Gauge sterilen abgeschrägten Nadel wird in die Basis des Herzens über den Bereich der Verletzung auf der rechten Seite der Ligatur eingeführt. Die Nadel wird dann in den Bereich der Verletzung Fortgeschrittene und zurückgezogen geringfügig, so dass die Fase etwa an der Grenzzone zu sehen. Einige der Lösung in der Spritze (2-3μl) ist in das Herz injiziert und die Nadel an ihrem Platz gehalten. Die Spritze wird zurückgezogen anderen 1-3mm und der Rest der Lösung injiziert. Die Spritze wird in Position gehalten, bis die Blase, die durch die entstandene Lösung wird abgeführt. Die Nadel wird dann entfernt. Wenn es eine Blutung, ist ein Wattestäbchen vorsichtig auf die Nadel Insertionsstelle gedrückt, bis die Blutung aufhört ^5-7.
14. Sobald die myokardiale Manipulationen vollständig sind, werden die Rippe Retraktoren entfernt und der Brusthöhle ist mit 2-3 Matratzennähten mit 6-0 surgipro Naht verschlossen.
15. Zwei, drei Matratzennähten werden dann gemacht, um die Brustmuskeln zu schließen, 1-3 Tropfen von 0,25% Marcain 1:10 in steriler Kochsalzlösung (0.1ml/25g Maus) ist es, den Muskel aufgetragen und dann 2-3 Matratzennähte gemacht nahe der Haut.
16. Die Maus ist aus dem Beatmungsgerät entfernt. Sobald rhythmische, schnelle, flache Atmung überprüft wird, kann die Maus extubiert werden.
17. 0,5 ml warme sterile Kochsalzlösung in die dorsale subkutane Raum injiziert und die Maus auf eine wärmende Unterlage in einen Käfig gesetzt, bis sie die Mobilität (1 Stunde minimum) gewinnt.
18. Für das Überleben Experimente sind Mäuse zurück in ihre Käfige gesetzt und kehrte nach dem Vivarium, bis die Zeit des Opfers. Während der ersten 2 Tage, angefeuchtete Lebensmittelplatziert auf dem Käfig vom Boden bis zur Fütterung zu erleichtern (so sie nicht auf bis das kann Schmerzen verursachen) und Buprenorphin sollten alle 6-12-Stunden verabreicht werden. Post-operative Betreuung umfasst auch tägliche Überwachung der ersten Woche eine ausreichende Mobilität, Pflege, und Essgewohnheiten zu überprüfen.
19. Die chirurgischen Instrumente werden mit Ethanol abgewischt sauber und in die Perle Sterilisator, bevor die nächste Operation.
20. Zum Zeitpunkt der Tötung werden die Mäuse mit Natrium-Pentobarbital (65mg/ml, 55-65 mg / kg). Wenn eine angemessene Ebene der Narkose erreicht ist, wird die Brusthöhle eröffnet.
21. Während das Herz noch schlägt, eine Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel mit kaltem Kaliumchlorid (KCl, 30mm) oder 2,3-Butandion Monoxim (BDM; 10 mM) wird verwendet, um die Punktion der hinteren basalen Bereich des Ventrikels und die Lösung langsam in die Kammer injiziert, bis das Herz in Diastole verhaftet wird.
22. Wenn das Herz entfernt wird, wird eine Spritze mit PBS verwendet, um retrograd perfuse spülen das Herz kein Blut, die Reste zu beseitigen. Für akute Studien, am Ende der Reperfusion Zeit ist der LAD mit der ursprünglichen Stelle der Okklusion wieder ligiert. Eine Lösung, die 1% Evans-Blau in die Aorta injiziert. Wenn das Herz gewonnen wird, ist es quer in 3 Abschnitte von gleicher Dicke geschnitten, inkubiert in 1% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid und bebildert für morphometrische Analysen ^11. Bei chronischen Studien, ist das Herz dann in Fixativ eingetaucht, dann verarbeitet und nach Routineverfahren eingebettet. Folien können dann histologisch gefärbt werden und abgebildet für morphometrische Analysen (mit Scion, NIH Image J oder Image Pro Plus) ^9,10,12.

Repräsentative Ergebnisse:

Wenn es richtig gemacht, Preise für das Überleben in Mäusen (männlich: Alter 8-10 Wochen, 22-28g; weiblich: Alter 10-12 Wochen, 20-26g) sind: über 90% der akuten Ischämie / Reperfusion und ischämische Präkonditionierung Experimente, über 85% in permanenten Ligatur Studien und ca. 80% für intramyokardialen Injektionen. Seit Anfang Verletzung ist gut sichtbar durch metabolische Veränderungen und nicht strukturell, Infarktgröße Bestimmung in Ischämie / Reperfusion und ischämische Präkonditionierung Experimente ist durch Infusion von 1% Evans blauen Farbstoff in die Aorta, die das Herz, das nicht von der LAD versorgt wird perfuse durchgeführt ( Abbildung 1A). Wenn das Herz entfernt und quer halbieren, wird das Gewebe in 1% ige Lösung von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid zu Infarktgröße (Abbildung 1B) messen inkubiert. Die Flächen werden mit Scion oder NIH-Imaging-Software, die vom Anwender mit einem Mikrometer bei gleicher Vergrößerung abgebildet werden können. Diese Zahlen werden verwendet, um gefährdete Gebiet / linken Ventrikels und Infarktgröße / gefährdete Gebiet ^{11 zu} berechnen. Der Stamm Unterschiede können in Variationen des Körpergewichts und des Herzens Größe und so darauf geachtet werden, diese Maßnahmen zu Herzen Gewicht, Körpergewicht oder Tibia Länge für Vergleichszwecke zu normalisieren sollte führen.

Permanent Arterienligation Ergebnisse in grobe strukturelle Veränderungen wie Nekrosen, Wandverdünnung und Kammer Dilatation. Vergleich der Wirkungen der Behandlung und / oder Zeit auf die Infarktgröße und Nekrose in Bezug auf die linke Herzkammer, Kammer-Bereich, Septumwand und linksventrikulären freien Wandstärke in der permanenten Okklusion Modell (Abbildung 2A) können auch unter Verwendung von Scion oder NIH Bildgebung werden Software. Collagen Färbung mit Picrosirius rot / schnell grün (Abbildung 2B) kann verwendet werden, um insterstitial Fibrose, die funktionale Indizes der Wand Versteifung ^8-10 korreliert zu messen. Das Bild in Abbildung 3 stellt die Verteilung der 6UL Lösung (Evans-Blau) in der Grenzzone des Herzens nach dem dauerhaften Arterienligation injiziert. Beachten Sie, dass es in Richtung der Verletzungen geht ebenso wie gegen die Basis und auch transmural.

Abbildung 1. A. Evan 's Blue in die Aorta vor Exzision injiziert. Dieses Bild zeigt die durchbluteten Regionen des Herzens (gefärbt) und die eingeschlossenen Fläche (ungefärbten). B. Evan' s Blue und TTC-Färbung nach akuter Ischämie / Reperfusion. Dies ist ein repräsentatives Bild (20x), die den blauen Farbstoff Verteilung, die die unoccluded Regionen sowie TTC-Färbung von metabolisch lebensfähiges Gewebe (rot) gefärbt. Nekrotischen Bereichen nicht verfärben und so bleiben sie blass (umrissen).

Abbildung 2. A. Hämatoxylin und Eosin-Färbung. Dies ist ein repräsentatives Bild (20x) von H & E Färbung von einer Maus Herzen quer durch den Infarkt Region um 4 Tage verkürzt post-MI (20x). Der * kennzeichnet Gewebsnekrose, zeigen Pfeile, um Granulationsgewebe, RV = rechter Ventrikel und LV = linker Ventrikel. B. Picrosirius rot und schnell grün färben. Dies ist einerepräsentatives Bild (20x) von Picrosirius rot / grün Färbung schnell von einem Querschnitt der Maus Herz 4 Wochen post-MI. Das Zytoplasma färbt grün und kollagenen Fasern sind rot.

Abbildung 3. Evans Blau Farbstoff Fleck Verteilung folgenden 6UL intramyokardialen Injektion. Dies ist ein repräsentatives Bild zeigt die globale Verteilung und transmurale des blauen Farbstoffs Evans ganzen Herzen nach 6UL intramyokardialen Injektion an der Grenzzone unmittelbar nach einer koronaren Ligation (12x).

Diskussion

Koronare Herzkrankheit weiterhin ein epidemiologisch und steuerlich erhebliche Problem der öffentlichen Gesundheit werden. Erhebliche Grundlagenforschung ist noch nötig, um die Mechanismen, durch die Verletzung und den Umbau vor und wie potenzielle Therapeutika modulieren kann diese Prozesse, wenn sie für den klinischen Einsatz entwickelt werden, zu verstehen. Nagetiere werden am häufigsten verwendet und die breite Palette von genetisch veränderten Mäusen zur Verfügung stellt, diese Art ein attraktives Modell.

Obwohl es Unterschiede zwischen Mäusen und anderen Tierarten, es gibt viele Vorteile zu einem Mausmodell. Verwenden eines einfachen Binokular oder Lupe und gut beleuchtet Bedingungen ermöglichen das Gefäßsystem zu leicht zu erkennen (für detaillierte makroskopischen Anatomie des Gefäßsystems, siehe Salto-Tellez et al., 2004 ^13). Um das Risiko von post-operative Sterblichkeit, ist es sehr wichtig, um zu vermeiden Durchtrennung großer Gefäße, da die gesamte Blutvolumen eines 25g Maus ist weniger als 2 ml ^14. Für den Fall, dass eine übermäßige Blutungen auftreten, können sanfte Anwendung von Druck oder stecknadelkopfgroße Verätzungen verwendet werden, um die Blutung zu stoppen.

Dieses Verfahren kann auch in einer Vielzahl von Arten modifiziert werden. Zum Beispiel können Mäuse betäubt werden mit Isofluran, Ketamin / Xylazin oder Natrium-Pentobarbital und entsprechende Auswahl wird durch die Dauer des Protokolls ^15-18 bestimmt. Die Zehen Prise Reflex ist das am häufigsten verwendete Index der Tiefe der Anästhesie. Weitere, um die Wahrscheinlichkeit für das langfristige Überleben zu verbessern, verwenden einige Forscher Antiarrhythmika wie Lidocain, um die Inzidenz von tödlichen Arrhythmien ^19,20 es jedoch zu berücksichtigen, dass dieser vor kurzem wurde gezeigt, dass antiapoptotischen Eigenschaften in eine akute haben reduzieren Modell ^21. Auch, um postoperative Schmerzen zu reduzieren, können Schmerzmittel wie Buprenorphin für die ersten 48 Stunden nach der Operation ^{3,16,17,22,23} verabreicht werden. Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur während der Operation (vor allem für längere Protokolle), ist eine rektale Sonde in Reihe mit einem Heizkissen oft an die Stelle der isothermen Pad verwendet. Für Ischämie / Reperfusion und / oder ischämische Prä-oder postconditioning: die Dauer der Okklusion (s) und Reperfusion (s) können verändert werden; für die permanente Okklusion, die Größe des Infarktes kann durch Einstellen der Lage der Ligatur geändert werden; und für intramyokardialen Injektionen (zB Zellen, Proteine), kann es 1-3 Injektionsstellen werden und das Volumen pro Injektion kann bis zu 15 ul ^24. Wenn Zellen injiziert wird, verwendet der Feinheit der Nadel (in der Regel 26-30) ^5,25,26 basierend auf der Größe der Zellen sollte so gewählt werden, der Innendurchmesser der Nadel ist groß genug, um zu vermeiden Scheeren. Um zu vermeiden, verwirrt durch entzündliche Prozesse durch die Operation ausgelöst haben einige Forscher berichteten über eine Schlinge, die ex vivo zu verschließen und reperfuse die Herzen in einem geschlossenen Kasten mit der Maus an einer beliebigen Stelle nach der Operation ^27-29 manipuliert wird. In jüngerer Zeit Gao et al. ³⁰ haben gezeigt, dass temporäre und permanente Okklusion ohne die Notwendigkeit für die Belüftung durchgeführt werden kann und ein paar Labors haben damit begonnen, Ultraschall verwenden, um bei geschlossener Brust intramyokardialen Injektionen ^25,31 auszuführen.

Seit der ersten Studie demonstriert Machbarkeit der Ligation der Koronararterie in Mäusen wurde von Johns und Olson 1954 ^{32 Erscheinungsweise,} viele andere dieses Modell übernommen und modifiziert sie, um verschiedene Aspekte der myokardialen Verletzungen und Umbau ^3,33-45 studieren. Die Art von Mäusen in Bezug auf Größe, Fortpflanzungsfähigkeit, und vergleichsweise weniger Aufwand für Anschaffung und Wartung machen diese Art ein ansprechendes Werkzeug für ein breites Spektrum von physiologischen und pathophysiologischen Studien. Da die Miniaturisierung von Technologie für die Bildgebung in vivo Fortschritte ^46-49, sowie Mittel zur Durchführung und Analyse von großen Maßstab Genomik und Proteomik, Wirkstoff-Screening, die Wirksamkeit der Zell-und / oder Protein-Therapien sowie Biomaterialien ^50-64, kombiniert mit der zunehmend breite Palette von genetischen Manipulationen durch ubiquitäre oder Gewebe spezifische transgene oder Mutanten / Knockout-Mäusen ergab, wird die Maus-Modell des Myokardinfarkts zweifellos auch weiterhin ein unverzichtbares Werkzeug in die Bewertung der akuten kardialen Verletzungen und langfristigen Umbau werden. Deshalb gibt es unbestreitbaren Wert in der Lage, diese Experimente zuverlässig und reproduzierbar durchführen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Vanna Scissors	George Tiemann & Co.	160-159
Micro Dissecting Scissors	George Tiemann & Co.	160-161
Forceps – straight, 1x2 teeth	George Tiemann & Co.	105-205
Scalpel handle #3	George Tiemann & Co.	105-64	#10 sterile blade
Forceps – half curved serrated	George Tiemann & Co.	160-19
Tissue Scissors	George Tiemann & Co.	105-410
Castroviejo Needle Holder	Miltex Inc.	18-1828
Cook Eye Speculum	Miltex Inc.	18-63
Surgipro II 8-0	Suture Express	VP-900-X
Prolene 6-0	Suture Express	8776
Germinator 500 Bead Sterilizer	Cellpoint Scientific	65369-1
Deltaphase isothermal pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP
Hamilton syringe - 25μl	Hamilton Co	80430
30 gauge beveled needle	Hamilton Co	7803-07
Ventilator	Kent Scientific	TOPO