Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

Resumen

"ADN electrónico" sensores, reagentless, biosensores electroquímicos que funcionan bien, incluso cuando son desafiados directamente en la sangre y otras matrices complejas, se han adaptado a la detección de una amplia gama de ácidos nucleicos, proteínas y los analitos de moléculas pequeñas. Aquí se presenta un procedimiento general para la fabricación y el uso de este tipo de sensores.

Resumen

Como se practica actualmente la medicina, los médicos enviar las muestras a un laboratorio central de pruebas y por lo tanto hay que esperar horas o días para recibir los resultados. Muchos de los pacientes estarían mejor atendidos por las pruebas rápidas de cabecera. Para ello nuestro laboratorio y otros han desarrollado una plataforma versátil, reagentless biosensor que apoya la cuantitativa, la detección reagentless, electroquímica de los ácidos nucleicos (ADN y ARN), las proteínas (anticuerpos) y analitos pequeñas moléculas sin procesar directamente en muestras clínicas y ambientales. En este video, se demuestra la preparación y utilización de biosensores varios en este "E-DNA" de clase. En particular, fabricamos y demostrar sensores para la detección de una secuencia de ADN diana en una mezcla de reacción de polimerasa en cadena, un anticuerpo específicos para el VIH y la cocaína las drogas. El procedimiento de preparación sólo requiere de tres horas de práctica en el esfuerzo seguido de una incubación durante la noche, y su uso requiere sólo unos minutos.

Protocolo

1. Preparando el escenario

1. Compra el ADN correspondiente, sin modificar químicamente la sonda de una empresa de oligonucleótidos de síntesis a medida tales como las tecnologías Biosearch (Novato, CA) o Certificado de Midland (Midland, TX). La sonda se modifica durante la síntesis de la adición de un tiol C6 en su extremo 3 'y un azul de metileno redox-activa en su extremo 5'.
2. Disolver el ADN de la sonda en tampón fosfato salino pH 7,4 a una concentración de 200 mM y verificar su concentración midiendo su absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro. Debido a la mitad de azul de metileno en la sonda de ADN, la solución debe tener un tinte azul visible.
3. Recién preparar 1 ml de una solución 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina TCEP en agua destilada, desionizada (DI-agua). En nuestra experiencia, estas soluciones TCEP se mantienen frescos durante una semana cuando se almacena en la oscuridad a 4 ° C.
4. Para reducir los puentes disulfuro que pueden estar presentes en la solución de ADN de la sonda, combine 1 l de la solución de la sonda de valores de ADN con 2 l de la solución TCEP y mezclar suavemente con una pipeta. Incubar la mezcla durante una hora en un recipiente oscuro, refrigerados. La solución inicialmente azul debe quedar claro que el TCEP reversible reduce el azul de metileno. Si la solución no queda claro, repita el procedimiento usando una solución TCEP fresco o, posiblemente, a temperatura ambiente.
5. Después de una hora se diluye la solución de ADN de la sonda reduce con 1 ml de solución tampón, lo que va a diluir a una concentración de 200 millas náuticas. Posteriormente, se incuba una serie de electrodos de disco de oro en porciones de 200 l de esta solución diluida de la sonda.
6. Recién preparar por lo menos 2 ml de 2 mm mercaptohexanol en tampón fosfato salino.

2. Sensor de preparación

1. Combine 0,05 micras de polvo de aluminio con agua en un paño fino. Polaco una serie de electrodos de disco de oro (CH Instruments, Austin, TX) presionando la superficie de oro con firmeza en la tela húmeda, y moviéndolos en forma de ocho patrones durante aproximadamente tres minutos por cada electrodo.
2. Enjuague los electrodos pulido con DI-agua y sumerja en tubos Eppendorf rellenas con los mismos. Sonicar durante cinco minutos para eliminar cualquier polvo de alúmina residual.
3. Colocar los electrodos en una solución 0,5 M de ácido sulfúrico, la fijación a un potenciostato, junto con un contador de platino y la plata / electrodo de plata cloruro de referencia, y ejecutar una serie de voltamogramas para oxidar, reducir y electroquímicamente limpien sus superficies. Después de esto realizar una segunda limpieza electroquímico en una solución de 0,01 M de KCl en 0,1 M de ácido sulfúrico. Los detalles de estos procedimientos de limpieza se pueden encontrar en nuestra naturaleza el papel Protocolos n º ^1, y en el suplemento de este video.
4. Organizar un conjunto de 2 ml tubos Eppendorf en un rack y rellene cada uno con 200 l de la solución de ADN de la sonda. La concentración de la sonda de ADN en esta solución se define la densidad con la que la sonda de ADN de paquete en la superficie del sensor. El rendimiento del sensor es fuertemente dependiente de la densidad de la sonda, con la densidad óptima que van desde la arquitectura del sensor a la siguiente. La concentración de sonda utilizada en este paso lo que debe ser optimizado para cada nuevo tipo de sensor ^2. Para las arquitecturas de la sonda se ha investigado hasta la fecha, las concentraciones de ADN de la sonda que empleamos en este rango de paso de 15 nm a 2 micras, con 200 nM de ser un valor típico.
5. Enjuague los electrodos de disco de oro con DI-agua, y luego sumergirlas en la solución de sondas de ADN correspondientes en un tubo Eppendorf durante una hora. En este punto, la sonda de ADN se unen a la superficie del electrodo de oro a través de la formación de una monocapa de auto-tiol en oro montado.
6. Enjuague los electrodos con agua DI-, lavarlos en 2 mM mercaptohexanol en un tubo Eppendorf y guárdelas en un lugar oscuro durante 3 horas a la noche a temperatura ambiente para asegurar la formación completa de la monocapa de auto-ensambladas. Este paso incluye la mercaptohexanol como parte de una monocapa mixta para garantizar la formación de una monocapa estable. Para evitar la evaporación es posible que desee para sellar el electrodo en el tubo Eppendorf con parafilm. Los sensores pueden ser almacenados en esta solución durante varios días si es necesario.
7. Cuando esté listo para usar el sensor, se enjuaga con agua DI-y luego en remojo en una solución tampón por lo menos durante diez minutos. Sensores destinados a la detección de anticuerpos también debe ser sumergido en una solución de 100 nm de la cadena el reconocimiento correspondiente antes de su uso, seguido de un extremadamente rápido enjuague con tampón.

3. Prueba de sensor, detección de ADN

1. En este protocolo, una cadena de 17 nucleótidos de la sonda es colocada en un electrodo de oro. Cuenta con un reportero de azul de metileno redox en su extremo 3 '(figura 1). Cuando la molécula sonda se hibrida con una cadena de captura, la corriente a través del circuito del sensor disminuye.
2. Enjuague un sensor nuevo con DI-agua y sumerja en un espacio en blancomuestra que carecen de la meta a fin de registrar la señal de fondo que produce. Conecte el sensor al cable del electrodo de trabajo de un potenciostato. Coloque un electrodo contador de platino y un electrodo de plata / cloruro de plata en la solución de referencia.
3. Ejecutar una medida de la onda cuadrada 0 a -0,6 V con una amplitud de 25 mV y un tamaño de paso de 1 mV. La frecuencia óptima de onda cuadrada dependerá de los detalles de la arquitectura de la sonda ^2,3, para las arquitecturas de la sonda que han empleado los valores óptimos están típicamente en el rango de 60 a 600 Hz. Usted debe ver un pico redondeado en aproximadamente -0,35 V, el potencial redox de azul de metileno (el máximo potencial puede variar ligeramente en función del pH exacto de su solución de prueba). La altura desde la base de referencia actual para este pico es proporcional a la eficiencia de la transferencia de electrones entre el azul de metileno y el electrodo de oro (Figura 2). Guardar esta medida de fondo.
4. Mover los electrodos en una solución que contiene la molécula de ADN de interés objetivo, equilibrar (5 a 120 minutos dependiendo del tamaño, estructura y concentración de la target4, 5) y cobrar un voltammagram segunda onda cuadrada. La altura del pico a -0.35 V va a cambiar a partir de la medición del fondo inicial,. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración de la sustancia analizada. Se trata de los datos de salida principal de este sensor (Figura 3).
5. La medición del cambio de la señal relativa, el porcentaje de disminución o aumento de la señal en relación con el pico de fondo, es a menudo más reproducible que la medición del cambio absoluto en la actual, ya que corrige las variaciones en la superficie del electrodo. Para ello, la diferencia entre la corriente de pico y el pico de corriente de fondo están divididos por el pico de fondo actual.

4. Sensor de la regeneración

1. Una vez que sus mediciones se completa, mueva el sensor en un recipiente lleno de agua para la DI-30 s, o de chorro con un flujo constante de agua para la DI-30 s. Repita esto dos veces más con agua desionizada fresca. Nota: algunos analitos son resistentes a este enfoque, para ellos tratar de aclarar agresiva en 6 millones de clorhidrato de guanidina o etanol al 70%.
2. Coloque el sensor de nuevo en una solución donde las mediciones se realizarán. En un minuto, la altura del pico debería haber vuelto a su valor original. Vale la pena señalar que estos sensores a menudo muestran un cambio de señal un poco más grande en su primera prueba y el ciclo de regeneración, y los resultados muy consistentes durante los ciclos posteriores ^6.

5. Prueba de sensor, la detección de anticuerpos

1. En este protocolo, la sonda de ADN con azul de metileno y tiol modificados utilizados en estos sensores sirve como un "ancla" cadena ^7. Que se conecta directamente al electrodo de oro. Esta es entonces hibridado con una segunda, cadena de "reconocimiento" de ADN que se ha conjugado covalentemente al antígeno correspondiente (Figura 4). Hemos tenido buena suerte con la síntesis de las casas comerciales, tales como las tecnologías y Biosearch Panagene, para la síntesis del ADN de antígeno necesaria quimeras. La etapa de la hibridación se lleva a cabo mediante la transferencia de un sensor de pre-fabricados en un tubo Eppendorf que contiene 100 nM de la cadena de reconocimiento del ADN correspondiente en PBS durante 1 hora.
2. Coloque el sensor en la solución en blanco correspondiente. Adjuntar a la cabeza del electrodo de trabajo de un potenciostato y un lugar contraelectrodo de platino y la plata / electrodo de plata cloruro de referencia en la solución.
3. Realizar voltamperometría de onda cuadrada como se describió anteriormente. Para la arquitectura de la sonda en particular que hemos empleado aquí la frecuencia de onda cuadrada óptima es de 60 Hz. Usted debe ver un pico redondeado alrededor de -0,35 V. Guardar esta medida de fondo.
4. La transferencia de los electrodos a una solución que contiene el analito, incubar por 5 a 60 minutos, y recoger una voltammagram segunda onda cuadrada. Si el anticuerpo está presente meta el pico a -0.35 V se reducirá. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración de anticuerpos.

6. Prueba de sensor, la detección de moléculas pequeñas

1. En este caso, la molécula de la sonda sobre la superficie del sensor es un aptámero, una molécula de ADN o ARN que ha sido seleccionado in vitro para enlazar un analito específico molecular, que los cambios en su estructura (pliegues) en unión a su analito ^8,9 ( Figura 5). Aquí contamos con un enlace de cocaína, aptámero de ADN desarrollada por el laboratorio de ^10,11 Stojanovic.
2. Enjuague un sensor nuevo con DI-agua y sumerja en una muestra en blanco que carecen de la meta a fin de registrar la señal de fondo que produce. Conecte el sensor al cable del electrodo de trabajo de un potenciostato. Colocar un contador de platino y una referencia de plata / cloruro de plata en la solución.
3. Realizar voltamperometría de onda cuadrada como se describió anteriormente. Para la arquitectura de la sonda en particular que hemos empleado aquí la frecuencia óptima de onda cuadrada es de 200Hz (Sin embargo, 60 Hz también funciona). Usted debe ver un pico redondeado alrededor de -0,35 V. Guardar esta medida de fondo.
4. La transferencia de los electrodos a una solución que contiene el analito, se incuba durante ~ 5 min, y cobrar un voltammagram segunda onda cuadrada. La altura del pico a -0.35 V va a cambiar. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración del analito. Si usted no puede obtener una muestra de la cocaína, procaína, cuyo uso no está regulada, puede ser utilizado como un sustituto.

7. Los resultados representativos:

Cuando se utiliza para detectar el ADN utilizando la arquitectura en primer lugar, la señal debe disminuir al menos un 60% cuando se equilibra a meta 200 nm. Después de tres lavados brevemente en agua destilada, la señal debe volver muy cerca (a menos de 0,1-5%) a su valor original. Sensores de detección de anticuerpos deben ser sometidos a una disminución de la señal de 40 a 80%. Aptámero basada en sensores para la detección de cocaína muestran un aumento de la señal de hasta un 200% dependiendo de la cobertura de la frecuencia y la superficie a la que trabajan. Para el sensor de cocaína, una baja cobertura de la superficie es el mejor ^3.

Figura 1. Detección de ADN con un biosensor de ADN electroquímico.

Figura 2. Captura de pantalla que muestra la señal producida por un biosensor E-ADN durante la voltamperometría de onda cuadrada.

Figura 3. Captura de pantalla que muestra las señales producidas por un biosensor E-ADN durante la voltamperometría de onda cuadrada, antes y después de la hibridación con un analito.

Figura 4. Detección de anticuerpos con un biosensor de andamios.

Figura 5. Detección de la cocaína o la procaína con un biosensor electroquímico aptamer.

Costumbre Oligo	Secuencia	Comentarios
Sonda lineal de ADN (LP17)	5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 '	HPLC purificada, se puede pedir con SS
ADN diana analito	AATAAAACGCCGATCCA	Sin modificar
Reconocimiento Strand	5'-antígeno-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 '
Andamio de anclaje	5'-HS-(CH2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7 MB	HPLC purificada, se puede pedir con SS
A4 cocaína aptámero	5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 '	HPLC purificada, se puede pedir con SS

Tabla 1. Sonda y secuencias de ADN diana.

Discusión

Una nota importante es que ninguno de los experimentos descritos anteriormente funcionará correctamente a menos que los electrodos se han limpiado adecuadamente. Aquí está una guía a nuestro procedimiento de limpieza electroquímica. Cuando se trabaja con CH potenciostatos Instruments, que ejecutar estos pasos de limpieza con un conjunto de tres programas de macro.

Fase Cero (E-limpia O)
Sumergir los electrodos en 0.5MH ₂ SO ₄ y su conexión a los electrodos de trabajo de un potenciostato. También adjunte y sumergirse en una referencia Ag / AgCl y electrodo auxiliar de platino. Comienza con una etapa de oxidación (2 V por 5 s) y luego una etapa de reducción (0,35 V durante 10 s).

Phase One (E-limpia 1)
Iniciar la oxidación y la reducción de las exploraciones en las mismas condiciones ácidas (0.5MH ₂ SO ₄₎ 0,35 a 1,5 V (20 escanea a una velocidad de barrido de 4 V / s, y un intervalo de muestreo de 0,01 V, seguido de cuatro escanea a una velocidad de barrido de 0,1 V / s, y un intervalo de muestreo de 0,01 V).

La segunda fase (E-limpia 2)
Llevar a cabo otra serie de oxidación electroquímica y la reducción de las exploraciones en condiciones de acidez (0,01 M KCl/0.1 MH ₂ SO _4), que abarca cuatro gamas diferentes potenciales (todos ellos realizados por 10 segmentos en una velocidad de barrido de 0,1 V s 1 y un intervalo de muestreo de 0,01 V ): (i) alcance potencial de 0,2 a 0,75 V, (ii) el rango potencial 0,2 a 1,0 V, (iii) potencial de rango 0,2 a 1,25 V, (iv) alcance potencial de 0,2 a 1,5 V.

Muchos tipos de electrodos de oro se pueden utilizar para llevar a cabo estos experimentos. Además de los electrodos de disco de oro, como los que trabajan aquí, hemos tenido éxito con las superficies de oro microfabricated, hilo de oro, y oro en los tableros de circuitos impresos.

Junto con los sensores descritos en este documento, muchas otras arquitecturas biosensor electroquímico de ADN han sido reportados. Esto incluye los sensores con una pseudoknot ^12, capítulo ¹³ triples, ¹⁴ bocadillo, sandwich Super ^15, o la arquitectura de triple ^16.

En el futuro, esperamos que estos sensores se utilizan en el punto de atención de diagnóstico médico. Se han integrado con éxito en varios dispositivos de microfluídica ^17,18, y ofrecen muchas ventajas sobre los sistemas ópticos de detección de analitos. En particular, estos sensores pueden funcionar en turbio, ópticamente denso y altamente muestras auto-fluorescentes.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Los electrodos de oro en disco	CH Instrumentos	CHI101	Pueden ser reutilizados
Sonda de ADN sintético	Biosearch Tecnologías	Costumbre
ADN sintético blanco	Sigma Genosys	Costumbre
Mercaptohexanol	Sigma Aldrich	725226-1G	Almacenar en lugar fresco y oscuro
Electrodo de platino	BASI	MW-1032	Pueden ser reutilizados
Ag / AgCl de referencia	BASI	MF-2052	Pueden ser reutilizados
Paño de limpieza	Buehler	40-7212
Alúmina polaco	Buehler	40-6325-016
Tampón fosfato buffer salino, pH 7,4	Sigma Aldrich	P7059-1L
CH Instrumentos 605A	CH Instrumentos	605A	Utilice cualquier potenciostato
Suero de ternera recién nacido	Sigma Aldrich	N4637-500ML	Almacenan congelados
NanoDrop	Fisher Scientific	ND-2000	Utilice cualquier UV-Vis
PCR Mix	Bio-Rad	170-8862	Almacenan congelados
Cocaína	Sigma Aldrich	C5776	DEA requiere licencia
Procaína	Sigma Aldrich	P9879	Sustituto de la cocaína
Anticuerpo anti-Flag	Sigma Aldrich	F1804-1mg