Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

Zusammenfassung

"E-DNA"-Sensoren, Reagenzienfreier haben elektrochemische Biosensoren, die gute Leistungen, auch wenn direkt in Blut und anderen komplexen Matrices in Frage gestellt, um den Nachweis einer Vielzahl von Nukleinsäure-, Protein-und Small Molecule Analyten angepasst. Hier präsentieren wir ein allgemeines Verfahren für die Herstellung und Verwendung solcher Sensoren.

Zusammenfassung

Als Medizin derzeit praktiziert wird, schicken Ärzte Proben an ein zentrales Labor für die Prüfung und muss daher Stunden oder Tage warten, um die Ergebnisse zu erhalten. Viele Patienten würden besser durch schnelle, Nachttisch-Tests serviert werden. Zu diesem Zweck unser Labor und andere haben ein vielseitiges, Reagenzienfreier Biosensor-Plattform, die quantitative, Reagenzienfreier, elektrochemische Detektion von Nukleinsäuren (DNA, RNA), Proteine ​​(einschließlich Antikörper) und kleinen Molekülen Analyten direkt in unverarbeiteten klinischen und Umweltproben unterstützt entwickelt. In diesem Video zeigen wir die Herstellung und Verwendung von mehreren Biosensoren in diesem "E-DNA"-Klasse. Insbesondere fertigen wir und zeigen, Sensoren für die Detektion einer Ziel-DNA-Sequenz in einer Polymerase-Kettenreaktion Mischung, eine HIV-spezifische Antikörper und die Droge Kokain. Die Vorbereitung Verfahren erfordert nur drei Stunden von Hands-on-Aufwand durch eine Inkubation über Nacht folgte, und ihre Verwendung erfordert nur wenige Minuten.

Protokoll

1. Einstellen der Bühne

1. Erwerben Sie die entsprechenden, chemisch modifizierten DNA-Sonde aus einer benutzerdefinierten Oligonukleotidsynthese Unternehmen wie Biosearch Technologies (Novato, CA) oder Midland Certified (Midland, TX). Die Sonde wird während der Synthese durch die Zugabe eines C6 Thiol an seinem 3'-Ende und einem redoxaktiven Methylenblau an seinem 5'-Ende modifiziert.
2. Lösen Sie die DNA-Sonde in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 zu einer Konzentration von 200 pM und überprüfen Sie die Konzentration durch Messung der Absorption bei 260 nm mit einem Spektralphotometer. Aufgrund der Methylenblau-Einheit auf der DNA-Sonde sollte die Lösung einen sichtbaren Blaustich.
3. Frisch zubereiten 1 mL einer 10 mM Lösung von Tris (2-carboxy) phosphin TCEP in destilliertem, deionisiertem Wasser (DI-Wasser). Nach unseren Erfahrungen bleiben diese TCEP Lösungen für eine Woche frisch, wenn im Dunkeln bei 4 ° C gelagert
4. Zur Reduzierung einer Disulfidbindungen, die vorhanden sein in der Sonden-DNA-Lösung könnten, kombinieren 1 ul der Sonde DNA-Stammlösung mit 2 ul der TCEP-Lösung und vorsichtig mischen mit einer Pipette. Inkubieren Sie die Mischung für eine Stunde in einem dunklen, Kühlcontainer. Die ursprünglich blaue Lösung soll klar werden, wie die TCEP reversibel reduziert die Methylenblau. Wenn die Lösung nicht geworden ist klar, wiederholen Sie den Vorgang mit einem frischen TCEP-Lösung oder eventuell bei Raumtemperatur.
5. Nach einer Stunde verdünnen reduziert DNA-Sonde Lösung mit 1 ml Puffer, das wird es zu einer Konzentration von 200 nM verdünnt. Später werden Sie inkubieren eine Reihe von Gold Disk-Elektroden in 200 ul Portionen dieser verdünnten Sonde Lösung.
6. Frisch vorzubereiten mindestens 2 mL von 2mm Mercaptohexanol in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.

2. Sensor Vorbereitung

1. Kombinieren 0,05 Mikrometer Aluminiumoxid-Pulver mit Wasser an einem schönen Poliertuch. Polnische eine Reihe von Gold Disk-Elektroden (CH Instruments, Austin, TX), indem Sie die Goldoberfläche fest in den feuchten Tuch und bewegten sie in einer Acht-Muster für etwa drei Minuten pro Elektrode.
2. Spülen Sie den polierten Elektroden mit DI-Wasser und tauchen sie in Eppendorf-Röhrchen mit der gleichen gefüllt. Ultraschallbad für 5 Minuten, um restliche Aluminiumoxidpulver zu entfernen.
3. Platzieren Sie die Elektroden in einem 0,5 M Schwefelsäure-Lösung, bringen Sie sie an einen Potentiostaten zusammen mit einer Platin-Gegenelektrode und Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode, und führen eine Reihe von Voltammogramme zu oxidieren, zu reduzieren, und elektrochemisch reinigen ihre Oberflächen. Im Anschluss an diese führen eine zweite elektrochemische Reinigung in einer Lösung von 0,01 M KCl in 0,1 M Schwefelsäure. Die feinen Details dieser Reinigungsverfahren finden Sie in unserem Nature Protocols Papier ^1, und in der Ergänzung, um dieses Video zu finden.
4. Vereinbaren Sie einen Satz von 2 mL Eppendorf-Röhrchen in ein Rack und füllen mit je 200 ul der Sonde DNA-Lösung. Die Konzentration der Sonden-DNA in dieser Lösung wird die Dichte, mit der die Sonde DNAs Pack auf der Sensoroberfläche zu definieren. Sensor Performance ist stark abhängig von Sonde Dichte, mit der optimalen Dichte variierend von einem Sensor-Architektur zur nächsten. Die Sonde Konzentration bei diesem Schritt verwendet werden, sollten daher für jede neue Art von Sensor ² optimiert werden. Für die Sonde Architekturen, die wir bisher untersucht haben, die Sonden-DNA-Konzentrationen beschäftigen wir in diesem Schritt von 15 nm bis 2 um, mit 200 nM, ein typischer Wert.
5. Spülen Sie den Gold-Disk-Elektroden mit DI-Wasser, und dann tauchen sie in den entsprechenden Sonden-DNA-Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen für eine Stunde. An diesem Punkt wird die Sonden-DNA auf die Goldelektrode Oberfläche über die Bildung einer Thiol-on-gold selbst Monoschicht befestigen.
6. Spülen Sie die Elektroden mit DI-Wasser, tauchen sie in 2mm Mercaptohexanol in ein Eppendorf-Röhrchen und lagern Sie sie an einem dunklen Ort für 3 Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur um eine vollständige Bildung des Selbst Monoschicht zu gewährleisten. Dieser Schritt beinhaltet die Mercaptohexanol als Teil einer gemischten Monoschicht auf die Bildung einer stabilen Monoschicht zu gewährleisten. Um zu verhindern, Verdunstung möchten Sie vielleicht die Elektrode in die Eppendorf-Röhrchen Dichtung mit Parafilm. Sensoren können in dieser Lösung für mehrere Tage bei Bedarf gespeichert werden.
7. Wenn Sie bereit sind, den Sensor zu verwenden, spülen Sie ihn mit DI-Wasser und dann lassen Sie sie in einem Puffer für mindestens 10 Minuten. Sensoren an Antikörpernachweis Ziel muss auch in einer 100 nM Lösung des entsprechenden Anerkennung Strang vor dem Gebrauch durch eine extrem schnelle Spülen mit Puffer gefolgt getaucht werden.

3. Sensor Testing, DNA-Erkennung

1. In diesem Protokoll ist ein 17 Nukleotidsonde Strang zu einer Goldelektrode fixiert. Es hat eine Methylenblau-Redox-Reporter am 3'-Ende (Abbildung 1). Wenn die Sonde Molekül mit einem Capture-Strang hybridisiert, nimmt der Strom durch den Sensor-Schaltung.
2. Spülen Sie eine frische Sensor mit DI-Wasser und tauchen Sie in eine leereProbe fehlt das Ziel, um das Hintergrundsignal es produziert aufzunehmen. Befestigen Sie den Sensor an der Arbeitselektrode führen eines Potentiostaten. Legen Sie eine Platin-Gegenelektrode und einer Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung.
3. Führen Sie einen Rechteck-Messung von 0 bis -0,6 V mit einer Amplitude von 25 mV und einer Schrittweite von 1 mV. Die optimale Rechteck Frequenz wird über die Details der Sonde Architektur ^2,3 ab; für die Sonde Architekturen haben wir die optimalen Werte werden typischerweise im Bereich von 60 bis 600 Hz. Sie sollten eine abgerundete Spitze bei etwa -0,35 V, das Redox-Potential von Methylenblau (der Gipfel Potenzial kann leicht verschieben je nach den genauen pH-Wert der Testlösung). Die Höhe von der Grundlinie Strom dieser Peak ist proportional zur Effizienz Elektronen-Transfer zwischen den Methylenblau und der Goldelektrode (Abbildung 2). Speichern Sie diese Hintergrund-Messung.
4. Bewegen Sie die Elektroden an einer Lösung, die die Ziel-DNA-Molekül von Interesse enthält, äquilibriert (5 bis 120 min in Abhängigkeit von der Größe, Struktur und Konzentration der target4, 5) und sammeln ein zweites Rechtecksignal voltammagram. Die Höhe des Peaks auf -0,35 V wird von der ersten, Hintergrund Messung ändern. Die Größe dieser Änderung ist es, die Konzentration des Analyten im Zusammenhang. Es ist das wichtigste Output-Daten dieses Sensors (Abbildung 3).
5. Messung der relativen Signaländerung, die prozentuale Abnahme oder Zunahme der Signal relativ zum Hintergrund Spitze, ist oft besser reproduzierbar als die Messung der absoluten Veränderung in der aktuellen, da dies korrigiert Variationen in der Oberfläche der Elektrode. Dazu sind die Differenz zwischen dem Spitzenstrom und der Hintergrund Spitzenstrom durch den Hintergrund Spitzenstrom unterteilt.

4. Sensor Regeneration

1. Nachdem Sie Ihre Messungen abgeschlossen sind, bewegen Sie den Sensor in einen Behälter mit DI-Wasser für 30 s gefüllt, oder spritzen sie mit einem stetigen Strom von DI-Wasser für 30 s. Wiederholen Sie diesen noch zwei weitere Male mit frischem deionisiertem Wasser. Hinweis: Einige Analyte sind resistent gegen diesen Ansatz, denn sie versuchen aggressive Spülen in 6 M Guanidin-Hydrochlorid oder 70% Ethanol.
2. Setzen Sie den Sensor wieder in eine Lösung, bei der Messungen vorgenommen werden. Innerhalb einer Minute sollte die Peak-Höhe auf den ursprünglichen Wert zurückgekehrt sind. Es ist bemerkenswert, dass diese Sensoren weisen oft eine etwas größere Signaländerung bei ihrem ersten Test-und Regenerationszyklus und sehr konsistente Ergebnisse bei der späteren Zyklen ^6.

5. Sensor Testing, Antikörper-Nachweis

1. In diesem Protokoll dient dem Methylenblau und Thiol-modifizierten DNA-Sonde in diesen Sensoren verwendet als "Anker" Strang ^7. Es ist direkt an der Goldelektrode angebracht. Dies ist dann mit einer zweiten, "Anerkennung" DNA-Strang, die kovalent an das betreffende Antigen (Abbildung 4) hat hybridisiert. Wir haben viel Glück mit kommerziellen Synthese Häuser wie Biosearch Technologies und Panagene hatte, für die Synthese der benötigten DNA-Antigen-Chimären. Die Hybridisierung wird durch die Übertragung eines vorgefertigten Sensor in ein Eppendorf-Röhrchen mit 100 nM des entsprechenden Anerkennung DNA-Strang in PBS für 1 Stunde durchgeführt.
2. Platzieren Sie den Sensor in den entsprechenden Blindprobe. Bringen Sie es zu der Arbeitselektrode führen eines Potentiostaten und legen Sie eine Platin-Gegenelektrode und Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung.
3. Führen Rechteck Voltammetrie wie oben beschrieben. Für die besonderen Sonde Architektur haben wir hier das optimale Rechteck-Frequenz beträgt 60 Hz eingesetzt werden. Sie sollten eine abgerundete Spitze um -0,35 siehe V. Save diesem Hintergrund Messung.
4. Übertragen Sie die Elektroden an einer Lösung des Zielanalyten, für 5 bis 60 min inkubieren, und sammeln Sie ein zweites Rechteck voltammagram. Wenn das Ziel Antikörper vorhanden Gipfel von -0,35 V sinkt. Die Größe dieser Änderung ist es, die Antikörper-Konzentration zusammen.

6. Sensor Testing, Small Molecule Detection-

1. In diesem Fall ist das Sondenmolekül auf der Sensoroberfläche ein Aptamer, ein DNA-oder RNA-Molekül, das in vitro ausgewählt wurde, um eine spezifische molekulare Analyten, dass seine Struktur ändert (Falten) nach Bindung an ihren Zielanalyten ^8,9 bind ( Abbildung 5). Hier beschäftigen wir einen Kokain-Bindung, DNA-Aptamer durch die Stojanovic ^10,11 Labor entwickelt.
2. Spülen Sie eine frische Sensor mit DI-Wasser und tauchen Sie es in einer Blindprobe fehlt das Ziel, um das Hintergrundsignal es produziert aufzunehmen. Befestigen Sie den Sensor an der Arbeitselektrode führen eines Potentiostaten. Legen Sie eine Platin-Gegenelektrode und einer Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung.
3. Führen Rechteck Voltammetrie wie oben beschrieben. Für die besonderen Sonde Architektur, die wir hier haben, beschäftigt die optimale Rechteck Frequenz ist 200Hz (Aber 60 Hz funktioniert auch). Sie sollten eine abgerundete Spitze um -0,35 siehe V. Save diesem Hintergrund Messung.
4. Übertragen Sie die Elektroden an einer Lösung des Zielanalyten, für ~ 5 min inkubieren, und sammeln Sie ein zweites Rechteck voltammagram. Die Höhe des Peaks auf -0,35 V wird sich ändern. Die Größe dieser Änderung ist es, die Konzentration der Analyt zusammen. Wenn Sie nicht erhalten eine Kokain-Probe, Procain, deren Verwendung nicht reguliert ist, kann als Ersatz verwendet werden.

7. Repräsentative Ergebnisse:

Wenn verwendet, um DNA zu erkennen mit der ersten Architektur, sollte das Signal von mindestens 60% verringern, wenn äquilibriert bei 200 nM Ziel. Nach drei kurzen Spülen in deionisiertem Wasser, sollte das Signal sehr nahe return (innerhalb 0,1-5%) auf den ursprünglichen Wert. Antikörpernachweis Sensoren sollten einer Abnahme des Signals um 40 bis 80%. Aptamer-basierte Sensoren für den Nachweis von Kokain zeigen ein Signal von bis zu 200% in Abhängigkeit von der Frequenz und Flächendeckung in denen sie tätig sind. Für die Kokain-Sensor ist eine geringe Flächendeckung besten ^3.

Abbildung 1. Erkennung von DNA mit einem elektrochemischen DNA-Biosensor.

Abbildung 2. Screenshot zeigt das Signal von einem E-DNA-Biosensor im Rechteck Voltammetrie produziert.

Abbildung 3. Screenshot zeigt die Signale von einem E-DNA-Biosensor im Rechteck Voltammetrie produziert, vor und nach der Hybridisierung mit einem Analyten.

Abbildung 4. Nachweis von Antikörpern mit einem Gerüst Biosensor.

Abbildung 5. Erkennung von Kokain oder Procain mit einem elektrochemischen Aptamer Biosensors.

Benutzerdefinierte Oligo	Reihenfolge	Kommentare
Linear Probe DNA (LP17)	5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 '	HPLC gereinigt, kann mit SS bestellt werden
Zielanalyten DNA	AATAAAACGCCGATCCA	Unverändert
Recognition Strand	5'-Antigen-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 '
Scaffold Anchor	5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7-MB	HPLC gereinigt, kann mit SS bestellt werden
A4 Cocaine Aptamer	5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 '	HPLC gereinigt, kann mit SS bestellt werden

Tabelle 1. Sonde und Target DNA-Sequenzen.

Diskussion

Ein wichtiger Hinweis ist, dass keines der oben beschriebenen Experimente ordnungsgemäß funktionieren, wenn die Elektroden richtig gereinigt worden sein. Hier ist eine Anleitung für unsere elektrochemische Reinigung. Bei der Arbeit mit CH Instruments Potentiostaten, führen wir diese Reinigungsschritte mit einem Satz von drei Makro-Programmen.

Phase Zero (E-clean O)
Tauchen Sie die Elektroden in 0,5 MH ₂ SO ₄ und verbinden sie mit der Arbeit Elektroden eines Potentiostaten. Auch legen und tauchen ein Ag / AgCl Referenz-und Platin-Gegenelektrode. Beginnen Sie mit einer Oxidationsstufe (2 V für 5 s) und dann ein Reduktionsschritt (0,35 V für 10 s).

Phase One (E-clean 1)
Initiieren Oxidation und Reduktion Scans unter den gleichen sauren Bedingungen (0,5 M H ₂ SO ₄₎ 0,35 bis 1,5 V (20 Scans mit einer Abtastrate von 4 V / s und eine Probe im Abstand von 0,01 V, die von vier Scans mit einer Abtastrate gefolgt von 0,1 V / s und einem Abtastintervall von 0,01 V).

Phase Zwei (E-clean 2)
Führt eine Reihe von elektrochemischen Oxidation und Reduktion Scans unter sauren Bedingungen (0,01 M KCl/0.1 MH ₂ SO ₄₎ für vier verschiedene Möglichkeiten reicht (alle für 10 Segmente mit einer Abtastrate von 0,1 V s 1 und eine Probe im Abstand von 0,01 V durchgeführt ): (i) Potentialbereich von 0,2 bis 0,75 V, (ii) Potentialbereich von 0,2 bis 1,0 V; (iii) Potentialbereich von 0,2 bis 1,25 V, (iv) Potentialbereich von 0,2 bis 1,5 V.

Viele Arten von Gold-Elektroden können verwendet werden, um diese Experimente durchzuführen. Neben Gold Disk-Elektroden, wie sie hier verwendeten, hatten wir Erfolg mit mikrostrukturierten Goldoberflächen, Golddraht und Gold auf Leiterplatten.

Zusammen mit den Sensoren in diesem Papier beschrieben, haben viele andere elektrochemische DNA-Biosensor-Architekturen berichtet worden. Dazu gehören Sensoren mit Pseudoknoten ^12, Triple-Strang ^{13, Sandwich-14,} Super-Sandwich ^15, oder ^Triplex-16 Architektur.

In Zukunft erwarten wir, dass diese Sensoren in point of care medizinischen Diagnostik verwendet werden. Sie wurden erfolgreich in mehreren mikrofluidischen Bauteilen ^17,18 integriert und bieten viele Vorteile gegenüber optischen Analyt-Detection-Systeme. Insbesondere können diese Sensoren in trüben Funktion, optisch dichten und hoch auto-fluoreszierende Proben.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Gold Disk-Elektroden	CH Instruments	CHI101	Kann wieder verwendet werden
Synthetische DNA-Sonde	Biosearch Technologies	Brauch
Synthetische Ziel-DNA	Sigma Genosys	Brauch
Mercaptohexanol	Sigma Aldrich	725226-1G	An einem kühlen dunklen Ort
Platinelektrode	BASI	MW-1032	Kann wieder verwendet werden
Ag / AgCl Referenz	BASI	MF-2052	Kann wieder verwendet werden
Poliertuch	Buehler	40-7212
Alumina polnischen	Buehler	40-6325-016
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4	Sigma Aldrich	P7059-1L
CH Instruments 605A	CH Instruments	605A	Verwenden Sie Potentiostaten
Newborn Calf Serum	Sigma Aldrich	N4637-500ML	Eingefroren gelagert
NanoDrop	Fisher Scientific	ND-2000	Verwenden Sie keine UV-Vis
PCR Mix	Bio-Rad	170-8862	Eingefroren gelagert
Kokain	Sigma Aldrich	C5776	DEA Lizenz erforderlich
Procain	Sigma Aldrich	P9879	Ersatz für Kokain
Anti-Flag Antikörper	Sigma Aldrich	F1804-1mg