Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

Özet

"E-DNA" sensörleri, reagentless, kan ve diğer karmaşık matrisler doğrudan meydan bile iyi bir performans elektrokimyasal biyosensörler, nükleik asit, protein ve küçük molekül analitler geniş bir algılama için adapte edilmiştir. Burada bu tür sensörlerin üretimi ve kullanımı için genel bir prosedür mevcut.

Özet

Tıp şu an uygulandığı şekliyle, doktorlar örneklerin test etmek için bir merkez laboratuara göndermek ve böylece sonuç almak için saat veya gün beklemeniz gerekir. Birçok hasta, daha iyi, hızlı, başucu testleri ile hizmet olacaktır. Bu amaçla laboratuar ve diğerleri, nükleik asitler (DNA, RNA), proteinler (antikorlar dahil) ve küçük moleküller analitler doğrudan işlenmemiş klinik ve çevre örneklerinde kantitatif, reagentless, elektrokimyasal algılama destekleyen çok yönlü, reagentless bir biyosensör platformu geliştirdi. Bu video, biz, bu "E-DNA" sınıfı birkaç biyosensörler hazırlanması ve kullanımını göstermek. Özellikle, biz imal ve polimeraz zincir reaksiyon karışımının bir HIV spesifik antikor ve uyuşturucu kokain bir hedef DNA dizisi tespiti için sensörler göstermek. Hazırlık prosedürü hakkında uygulamalı bir gecelik inkübasyon tarafından takip çaba sadece üç saat gerektirir ve bunların kullanımı, sadece birkaç dakika gerektirir.

Protokol

1. Sahne Ayarı

1. Biosearch Teknolojileri (Novato, CA) veya Midland Sertifikalı (Midland, TX) gibi özel bir oligonükleotid sentez şirketi, kimyasal olarak değiştirilmemiş ilgili prob DNA satın alın. Prob, 3'-sonunda ek bir C6 tiyol ve 5'-sonunda bir redoks aktif metilen mavisi sentezi sırasında güncellenmiştir.
2. Fosfat prob DNA çözülür 200 mcM bir konsantrasyon tamponlu salin pH 7.4 ve bir spektrofotometre ile 260 nm dalga boyunda absorbans ölçümü ile konsantrasyon doğrulamak. DNA prob metilen mavisi benzer parçaları nedeniyle çözüm görünür bir mavi tonu olmalıdır.
3. Taze distile, deiyonize su (DI-su), 10 mM tris (2-carboxyethyl) fosfin TCEP çözüm 1 mL hazırlamak. 4 ° C'de karanlıkta saklandığında deneyimlerimiz, bu TCEP çözümleri, bir hafta süreyle taze kalır
4. Prob DNA çözümü mevcut olabilecek herhangi bir disülfür bağları azaltmak için, prob DNA stok solüsyonu 1 mcL TCEP çözüm 2 mcL ile birleştirmek ve bir pipet yardımıyla hafifçe karıştırın. Karışımı bir karanlık, buzdolabında bir kap içinde bir saat boyunca inkübe edin. TCEP geri dönüşümlü metilen mavisi azaltır başlangıçta mavi bir çözüm haline gelmelidir. Çözüm açık duruma değilse, oda sıcaklığında, büyük olasılıkla, taze bir TCEP çözümü kullanarak prosedürü tekrarlayın veya.
5. Bir saat sonra, 1 ml tampon ile azaltılmış DNA prob çözeltinin; 200nm bir konsantrasyon sulandırmak. Daha sonra, bu seyreltilmiş prob çözüm 200 mcL porsiyonlar halinde altın disk elektrotlar bir dizi inkübe olacaktır.
6. Taze 2mm mercaptohexanol en az 2 mL hazırlamak fosfat tamponlu salin.

2. Sensör Hazırlanması

1. Ince bir polisaj bezi su ile 0.05 mikron alümina toz birleştirin. Elektrot başına yaklaşık üç dakika için sekiz desen altın yüzeyi ıslak bir bez içine sıkıca basarak, bir rakam taşıyarak bir dizi altın disk elektrotlar (CH Instruments, Austin, Teksas) Lehçe.
2. DI-su ile durulayın ve cilalı elektrotlar ile aynı dolu Eppendorf tüpleri içine batırmayın. Herhangi bir kalıntı alümina toz kaldırmak için beş dakika sonikasyon.
3. 0.5 M sülfürik asit çözeltisi içine elektrotlar yerleştirin, platin sayacı ve gümüş / gümüş klorür referans elektrot ile birlikte bir potansiyostat ekleyebilirsiniz ve voltamogramları okside azaltmak ve elektrokimyasal yüzeyleri temizlemek için bir dizi çalıştırın. Bu 0.01 M KCl çözeltisi 0,1 M sülfürik asit ikinci bir elektrokimyasal temizlik gerçekleştirmek ardından. Bu temizleme prosedürleri ince ayrıntıları Nature Protokolleri kağıt ^1, ve bu video ekinde bulunabilir.
4. 2 ml Eppendorf tüpleri rafa bir dizi düzenleme ve 200 mcL prob DNA çözümü ile her doldurun. Bu çözüm prob DNA konsantrasyonu prob DNA'lar paketi sensör yüzeyinde yoğunluk tanımlamak olacaktır. Algılayıcı performansını optimum yoğunluğuna sahip bir sensör mimarisi sonraki değişik prob yoğunluğuna kuvvetle bağlı Bu aşamada kullanılan prob konsantrasyon ve böylece her yeni tip ^sensör 2 için optimize edilmiş olmalıdır . Prob mimarileri için bugüne kadar araştıran, prob DNA konsantrasyonları tipik bir değeri olan 200 nM, bu adım aralığı 15 nM 2 mikron istihdam.
5. DI-su ile altın disk elektrotlar durulayın ve sonra bir saat için bir Eppendorf tüp ilgili prob DNA çözüm batırmayın. Bu noktada, prob DNA tiol-on altın kendini monte tek tabaka oluşumu yoluyla altın elektrot yüzeyine eklenecektir.
6. Elektrotlar DI-su ile durulayın, bir Eppendorf tüp 2mm mercaptohexanol onları batırmayın ve kendini monte monolayer oluşumunu sağlamak için oda sıcaklığında bir gecede 3 saat boyunca karanlık bir yerde saklayın. Bu adım, istikrarlı bir tek tabaka oluşumu sağlamak için karma bir tek tabaka parçası olarak mercaptohexanol içermektedir. Buharlaşmasını önlemek için parafilm Eppendorf tüp içine elektrod mühür isteyebilirsiniz. Sensörler, gerekirse birkaç gün boyunca bu çözüm saklanabilir.
7. Sensörü kullanmak için hazır olduğunuzda, DI-su ile yıkayın ve sonra en az on dakika boyunca tampon ıslatın. Antikor tespiti yönelik sensörler aynı zamanda son derece hızlı bir tampon ile durulayın takip kullanmadan önce ilgili tanıma iplikçik 100 nM çözüm dalmış olmalıdır.

3. Sensör Testi, DNA Algılama

1. Bu protokol, 17 nükleotid prob iplikçik altın elektrot yapıştırılmıştır. 3'-sonunda bir metilen mavisi redoks muhabiri (Şekil 1). Prob molekülü bir yakalama iplikçik hybridizes, sensör devre üzerinden akım azalır.
2. DI-su ile durulayın ve taze bir sensör boş bir daldırmayınörnek ürettiği arka plan sinyalini kaydetmek için hedef eksik. Bir potansiyostat çalışma elektrot kurşun sensörü takın. Platin elektrot ve çözelti içine bir gümüş / gümüş klorür referans elektrot yerleştirin.
3. 0 ile 25 mV bir genlik ve 1mV bir adım boyutu -0.6 V kare dalga ölçümü çalıştırın. Optimal kare dalga frekansı prob mimarisi ^2,3 ayrıntılarını bağlıdır; prob mimarileri için 600 Hz - 60 aralığında genellikle optimal değerleri istihdam var. Yaklaşık -0.35 V, metilen mavisi redoks potansiyeli (pik potansiyeli test çözümü kesin pH bağlı olarak biraz değişebilir) yuvarlak bir tepe göreceksiniz. Bu tepe akımı başlangıçtan itibaren yüksekliği, metilen mavisi ve altın elektrot (Şekil 2) arasındaki verimliliği elektron transferi ile doğru orantılıdır. Bu arka plan ölçüm kaydedin.
4. Ilgi hedef DNA molekülü içeren bir çözüm için elektrotlar Taşı, dengelenmesi (5 ila 120 dakika target4 5, büyüklüğü, yapısı ve konsantrasyonuna bağlı) ve ikinci bir kare dalga voltammagram toplamak. Başlangıç, arka plan ölçüm -0.35 V tepe yüksekliği değişecektir. Bu değişimin büyüklüğü analit konsantrasyonu ile ilgilidir. Bu sensörün asıl çıkış verileri (Şekil 3).
5. Ölçüm bağıl sinyal değişikliği, yüzde azalma veya artış arka plan zirvesine göre sinyal, elektrot yüzey alanı varyasyonları için bu düzeltir, genellikle akım mutlak değişim ölçüm daha tekrarlanabilir. Bunu yapmak için, mevcut arka plan tepe tepe ve arka tepe akımı arasındaki fark ayrılır.

4. Sensör Yenilenme

1. Ölçümler tamamlandıktan sonra, DI-su akışı ile 30 saniye 30 saniye DI-suyla dolu bir kabın içine sensör taşımak, veya fışkırtma Taze deiyonize su ile bu iki kez daha tekrarlayın. Not: bazı analitler Bu yaklaşıma dirençli; onları 6 M guanidin hidroklorür veya% 70 etanol durulama agresif denemek için.
2. Sensör ölçümleri yapılacaktır bir çözüm içine geri koyun. Bir dakika içinde, zirve yüksekliği özgün değerine geri olmalıdır. Bu sensörler genellikle ilk test ve yenilenme döngüsü sırasında biraz daha büyük sinyal değişikliği ve sonraki ⁶ döngüleri sırasında oldukça tutarlı sonuçlar sergilediği fazlalaştı.

5. Sensör Test, Antikor Algılama

1. Bu protokol, bu sensörlerin kullanılan metilen mavisi ve tiyol modifiye DNA prob, "çapa" ^iplikçik 7 olarak hizmet vermektedir . Altın elektrot doğrudan bağlı. Bu daha sonra ilgili antijen (Şekil 4) kovalent konjuge olan ikinci bir "tanıma" DNA iplikçik melezleşmiştir. Biz gerekli olan DNA-antijen kimeralar sentezi için Biosearch Teknolojileri ve Panagene gibi ticari sentez evler, iyi bir şans oldu. 1 saat süreyle PBS içinde ilgili tanıma DNA zincirinde 100 nM içeren bir Eppendorf tüp içine prefabriklerin sensörü transfer hibridizasyon adım tarafından yürütülmektedir.
2. Ilgili boş çözüm sensörü yerleştirin. Bir potansiyostat çalışma elektrot kurşun takın ve çözüm içine bir platin elektrot ve gümüş / gümüş klorür referans elektrot yerleştirmek.
3. Yukarıda açıklandığı gibi kare dalga voltametri gerçekleştirin. Özel bir prob mimarisi için en uygun kare dalga frekansı 60 Hz burada istihdam var. -0.35 Etrafında yuvarlak bir tepe görmek V. Bu arka plan ölçüm kaydet gerekir.
4. 5 ila 60 dakika süreyle inkübe hedef analit içeren bir çözüm için elektrotlar aktarın ve ikinci bir kare dalga voltammagram toplamak. Hedef antikor varsa -0.35 V tepe azalacaktır. Bu değişimin büyüklüğü antikor konsantrasyonu ile ilgili.

6. Sensör Test, Küçük Molekül Algılama

1. Bu durumda, sensör yüzeyinde prob molekül (in vitro hedefine analit ^8,9 bağlayıcı üzerine (kıvrım) yapısı değişiklikleri belirli bir moleküler analit bağlamak için seçilmiş olan bir DNA veya RNA molekülü bir aptamer Şekil 5). Burada Stojanovic ^10,11 laboratuvarı tarafından geliştirilen bir kokain bağlayıcı DNA aptamer istihdam etmektedir.
2. DI-su ile durulayın ve taze bir sensör ürettiği arka plan sinyalini kaydetmek için hedef yoksun boş bir örnek batırmayın. Bir potansiyostat çalışma elektrot kurşun sensörü takın. , Platin sayacı ve gümüş / gümüş klorür referans çözelti içine yerleştirin.
3. Yukarıda açıklandığı gibi kare dalga voltametri gerçekleştirin. Biz burada istihdam prob mimarisi için en uygun kare dalga frekansı (200HzAma 60 Hz) çalışır. -0.35 Etrafında yuvarlak bir tepe görmek V. Bu arka plan ölçüm kaydet gerekir.
4. Hedef analit içeren bir çözüm için elektrotlar Transferi, yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe ve ikinci bir kare dalga voltammagram toplamak. -0.35 V tepe yüksekliği değişecektir. Bu değişimin büyüklüğü hedef analit konsantrasyonu ile ilgili. Örnek bir kokain, prokain elde edemiyorsanız, düzensiz olduğu kullanımı, bir yedek olarak kullanılabilir olabilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Ilk mimarisini kullanarak DNA tespit etmek için kullanılan, sinyal en az% 60 azalma 200 nM hedef az dengelenmiş. Deiyonize su üç kısa durular sonra, sinyal özgün değerine çok yakın (% 0,1-5 içinde) dönmelidir. Antikor sensörleri 40 ila% 80 arasında bir sinyal azalma yapılmalıdır. Kokain tespit Aptamer tabanlı sensörler faaliyet hangi frekansta ve yüzey kapsama bağlı olarak% 200 kadar bir sinyal artışı gösterirler. Kokain sensörü için, düşük yüzey kapsama en iyi ^3.

Şekil 1 bir elektrokimyasal DNA biyosensör ile DNA tespiti.

Şekil 2 kare dalga voltametri sırasında E-DNA biyosensör tarafından üretilen sinyal gösteren ekran görüntüsü.

Şekil 3 kare dalga voltametri sırasında E-DNA biyosensör tarafından üretilen sinyalleri gösteren bir analit ile hibridizasyon öncesi ve sonrası ekran görüntüsü.

Şekil 4 bir iskele biyosensör antikorların tespiti.

Şekil 5, bir elektrokimyasal aptamer biyosensör ile kokain ya da prokain Algılama .

Özel Oligo	Dizi	Yorumlar
Lineer Prob DNA (LP17)	5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 '	HPLC Saflaştırılmış, SS ile sipariş edilebilir
Hedef analit DNA	AATAAAACGCCGATCCA	Değiştirilmemiş
Tanıma Strand	5'-Antijen-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 '
İskele Anchor	5'-HS (CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC (CH 2) 7 MB	HPLC Saflaştırılmış, SS ile sipariş edilebilir
A4 Kokain Aptamer	5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG MethyleneBlue-3 '	HPLC Saflaştırılmış, SS ile sipariş edilebilir

Tablo 1. Probe ve Hedef DNA dizileri.

Tartışmalar

Önemli bir not bu elektrotlar düzgün bir şekilde temizlenir sürece yukarıda açıklanan deneyler hiçbiri düzgün çalışması. Burada, bizim elektrokimyasal temizleme prosedürü için bir rehber. CH Instruments potentiostats ile çalışırken, bir dizi üç makro programları kullanarak bu temizleme adımları çalıştırın.

Faz Sıfır (E temiz O)
0.5MH ₂ SO ₄ elektrotlar bırakın ve bir potansiyostat çalışma elektrotlara bağlayın. Ayrıca bir Ag / AgCl referans ve platin elektrot takın ve bırakın. Sonra bir oksidasyon adım (5 saniye 2 V) ve bir azalma adım (10 s için 0,35 V) ile başlayın.

Phase One (E-temiz 1)
0,35 ila 1,5 V (20 tarama hızı az dört tarama takip 4 V / s tarama hızı 0.01 V tarar ve bir örnekleme aralığı, aynı asidik şartlar altında (0.5MH ₂ SO _4), oksidasyon ve redüksiyon taramaları başlatın 0,1 V / s ve 0.01 V bir örnek aralığı).

Aşama (E-temiz 2)
Dört farklı potansiyel aralıkları (0.1 V s 1 tarama hızı ve 0.01 V örnek aralığı 10 segmentleri için yapılan kapsayan asidik şartlar altında (0,01 M KCl/0.1 MH ₂ SO ₄₎ elektrokimyasal oksidasyon ve redüksiyon taramaları başka bir set Davranış ): (i) 0.2 ila 0.75 V potansiyel aralığı, (ii) 0.2 ila 1.0 V potansiyel aralığı, (iii) 0.2 'den 1.25 V potansiyel aralığı, 0.2 ila 1.5 (iv) potansiyel aralık V.

Birçok altın elektrot tipleri, bu deneyler için kullanılabilir. Burada istihdam edilenler gibi altın disk elektrotlar ek olarak, biz microfabricated altın yüzeyler, altın tel, baskılı devre kartları üzerinde yer alan altın ve başarılı oldu.

Bu yazıda anlatılan sensörleri ile birlikte, diğer pek çok elektrokimyasal DNA biyosensör mimarileri bildirilmiştir. Bu pseudoknot ¹² ile sensörler, üçlü iplikçik ^13, sandviç ^14, süper sandviç ¹⁵ veya tripleks ¹⁶ mimarisi içerir.

Gelecekte, biz bu sensörler bakım tıbbi teşhis noktası olacağını bekliyoruz. Onlar birkaç mikroakışkan cihazlar ^17,18 içine başarıyla entegre optik analit algılama sistemleri üzerinden pek çok avantajı sunan edilmiştir. Özellikle, bu sensörlerin optik yoğun ve yüksek oto-floresan örnekleri, bulanık işlev görebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Altın Disk Elektrotları	CH Aletleri	CHI101	Yeniden kullanılabilir
Sentetik koruyucu Probe DNA	Biosearch Teknolojileri	Özel
Sentetik Hedef DNA	Sigma Genosys	Özel
Mercaptohexanol	Sigma Aldrich	725.226-1G	Serin karanlık bir yerde saklayın
Platin Elektrot	Basi	MW-1032	Yeniden kullanılabilir
Ag / AgCl Referans	Basi	MF-2052	Yeniden kullanılabilir
Kumaş Parlatma	Buehler	40-7212
Alümina Lehçe	Buehler	40-6325-016
Fosfat tamponlu salin Tampon, pH 7.4	Sigma Aldrich	P7059-1L
CH Aletleri 605A	CH Aletleri	605A	Herhangi bir potansiyostat kullanın.
Yenidoğan Buzağı Serumu	Sigma Aldrich	N4637-500ML	Dondurularak saklanmalıdır
NanoDrop	Fisher Scientific	ND-2000	UV-Vis kullanın
PCR Mix	Bio-Rad	170-8862	Dondurularak saklanmalıdır
Kokain	Sigma Aldrich	C5776	Gerekli DEA Lisans
Prokain	Sigma Aldrich	P9879	Kokain yerine
Anti-Bayrak Antikor	Sigma Aldrich	F1804-1mg