Изготовление Электрохимические ДНК-биосенсоры для Безреагентная Обнаружение нуклеиновых кислот, белков и малых молекул

Резюме

"E-ДНК" датчики, безреагентной, электрохимические биосенсоры, которые выполняют хорошо, даже когда оспаривается непосредственно в крови и других комплексных матриц, были адаптированы для обнаружения широкого диапазона нуклеиновые кислоты, белки и малые молекулы аналита. Здесь мы приведем общий порядок изготовления и использования таких датчиков.

Аннотация

Как медицина практикуется в настоящее время, врачи отправить образцы в центральную лабораторию для тестирования и, следовательно, должны ждать несколько часов или дней, чтобы получить результаты. Многие пациенты, было бы лучше, быстрым, прикроватные тесты. Для этого наша лаборатория и другие разработали универсальный, безреагентной биосенсор платформе, которая поддерживает количественные, безреагентной, электрохимические обнаружения нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), белков (в том числе антитела) и малых молекул аналитов непосредственно в необработанном клинических и экологических пробах. В этом видео, мы демонстрируем подготовки и использования нескольких биосенсоров в этом "E-ДНК" класса. В частности, мы изготавливаем и демонстрируют датчики для обнаружения последовательности ДНК-мишени в полимеразной цепной реакции смеси, ВИЧ-специфических антител и наркотик кокаин. Подготовка процедуры требуется всего три часа практических усилий следует инкубации в течение ночи, а их использование требует всего несколько минут.

протокол

1. Создание основы

1. Покупка уместно, химически модифицированного зонда ДНК из пользовательских компании синтеза олигонуклеотида, таких как Biosearch технологий (Новато, Калифорния) или Midland Сертифицированный (Мидленд, штат Техас). Зонда изменяется в процессе синтеза при добавлении C6 тиоловых на своем 3'-конце и окислительно-восстановительной активностью метиленового синего на своих 5'-конца.
2. Растворите зонда ДНК в фосфатном буферном растворе рН 7,4 до концентрации 200 мкМ и проверить его концентрации путем измерения ее поглощения при 260 нм, используя спектрофотометр. В связи с метиленовым синим фрагмент на ДНК-зонд раствор должен иметь видимые синий оттенок.
3. Недавно подготовить 1 мл 10 мМ раствора трис (2-карбоксиэтил) фосфин TCEP в дистиллированной, деионизированной воды (DI-вода). По нашему опыту, эти TCEP решения остаются свежими в течение одной недели при хранении в темноте при 4 ° C.
4. Чтобы уменьшить любые дисульфидных связей, которые могут присутствовать в растворе ДНК-зонда, смешайте 1 мкл исходного раствора ДНК-зонда с 2 мкл TCEP раствора и осторожно смешать с пипеткой. Выдержите смесь в течение одного часа в темном, рефрижераторный контейнер. Первоначально сине решение должно стать ясно, как TCEP обратимо снижает метиленового синего. Если решение не стало ясно, повторите процедуру, используя свежий раствор TCEP или, возможно, при комнатной температуре.
5. Через час разбавленный раствор уменьшается зонда ДНК с 1 мл буфера, это будет разбавить его до концентрации 200 нм. Позже, вы инкубировать комплект золотых электродов диск в 200 мкл части этого разбавленного раствора зонда.
6. Недавно подготовить не менее 2 мл 2 мМ mercaptohexanol в фосфатным буферным раствором.

2. Датчик подготовка

1. Комбинат 0,05 микрон порошок оксида алюминия с водой на тонкого сукна полировки. Польский комплект золотых электродов диск (CH инструменты, Остин, Техас), нажав золотой поверхности, прочно в мокрую ткань, и перемещение их в восьмерку картины в течение примерно трех минут на электроде.
2. Промойте электроды с полированной DI-воды и опустите их в пробирки Эппендорф заполнены одинаково. Разрушать ультразвуком в течение пяти минут, чтобы удалить остатки порошка оксида алюминия.
3. Место электродов в 0,5 М раствор серной кислоты, присоединить их к потенциостате вместе со счетчиком платину и серебро / серебро электрода сравнения хлорид, и запустить серию вольтамперограммы для окисления, сокращение и электрохимически чистой их поверхности. После этого выполните вторую очистки электрохимическим в растворе 0,01 М KCl в 0,1 М серной кислоты. Мелкие детали этих процедур очистки можно найти в нашей природе протоколы бумаги ^1, а в дополнение к этому видео.
4. Упорядочить комплект из 2 мл пробирок Эппендорф в стойке и заполнить каждую 200 мкл раствора ДНК-зонда. Концентрация зонда ДНК в это решение будет определять плотность, с которой зонд ДНК пакет на поверхности сенсора. Эффективность работы датчиков сильно зависит от датчика плотности, с оптимальной плотности колеблется от одного датчика архитектуры к другой. Зонд концентрации использоваться на этом этапе должны таким образом быть оптимизированы для каждого нового типа датчика ^2. Для зонда архитектуры мы исследовали на сегодняшний день, концентрация зонда ДНК у нас работают на этом этапе в диапазоне от 15 нм до 2 мкм, с 200 нМ будучи типичным значением.
5. Промыть золотых электродов диск с DI-воды, а затем погружают их в соответствующие решения ДНК-зонда в пробирку Эппендорфа течение одного часа. В этот момент зонд ДНК будет приложить к поверхности электрода золота через образование тиол-на-золото само собраны монослоя.
6. Промойте электроды с DI-воды, погрузите их в 2 мМ mercaptohexanol в пробирку Эппендорфа и хранить их в темном месте в течение 3 часов ночи при комнатной температуре для обеспечения полного формирования самостоятельной собрали монослоя. Этот шаг включает в себя mercaptohexanol как часть смешанного монослоя обеспечить формирование стабильного монослоя. Для предотвращения испарения вы можете уплотнение электрода в пробирку Эппендорф с парафильмом. Датчики могут быть сохранены в этом растворе в течение нескольких дней, если это необходимо.
7. Когда вы будете готовы использовать датчик, промойте ее с DI-воды, а затем окуните его в буфер, по крайней мере десять минут. Датчики, направленных на обнаружение антител, также должны быть погружены в 100 нм решения соответствующих прядь признание перед употреблением, а затем очень быстро промыть буфера.

3. Тестирование датчика, обнаружение ДНК

1. В этом протоколе 17 нуклеотидные нити зонда прикреплен к золотой электрод. Он метиленового синего окислительно-восстановительных репортера на своем 3'-конце (рис. 1). Когда пробная молекула гибридизуется с захвата нити, ток через цепь датчика уменьшается.
2. Промойте свежие сенсор с DI-воды и опустите его в пустуюобразца не хватает целевой для записи фонового сигнала она производит. Прикрепите датчик рабочего электрода примеру потенциостате. Место платиновый электрод счетчика и серебра / хлорида серебра электрода в раствор.
3. Выполнить измерения квадратных волна от 0 до -0,6 В с амплитудой 25 мВ и размер шага 1 мВ. Оптимальная площадь частота волны будет зависеть от деталей архитектуры зонд ^2,3; для зонда архитектуры мы использовали оптимальные значения, как правило, в диапазоне от 60 до 600 Гц. Вы должны увидеть округлый пик примерно -0,35 V, окислительно-восстановительный потенциал метиленовый синий (пиковый потенциал может слегка смещаться в зависимости от конкретной рН тестового раствора). Высота по сравнению с исходным актуальными и по сей пика пропорциональна эффективности переноса электрона между метиленовый синий и золотой электрод (Figure2). Сохранить этом фоне измерения.
4. Перемещение электродов в раствор, который содержит молекулы ДНК-мишени интересов, равновесие (от 5 до 120 мин в зависимости от размера, структуры и концентрации target4, 5) и собрать второй квадрат voltammagram волны. Высота пика при -0,35 V будет меняться от начального, фон измерений. Величина этого изменения, связанные с концентрацией аналита. Это главный вывод данных этого датчика (рис. 3).
5. Измерение относительного изменения сигнала, уменьшения процента или увеличения сигнала относительно фонового пика, часто более воспроизводимым, чем измерение абсолютное изменение тока, так как это корректирует изменения площади поверхности электрода. Чтобы сделать это, разница между пиковый ток и ток фоне пика делятся на фоне пикового тока.

4. Датчик Регенерация

1. Как только ваши измерения полного, перемещение датчика в емкость, наполненную DI-воде в течение 30 с, или струя ее устойчивый поток DI-воде в течение 30 сек Повторите это еще два раза, со свежей деионизированной водой. Примечание: некоторые аналитов устойчивы к этим подходом, для них пытаются агрессивной промывки в 6 М гуанидина гидрохлорид или 70% этанола.
2. Поместите датчик обратно в раствор, где измерения будут сделаны. В течение минуты, высота пика должен был вернуться к своей первоначальной стоимости. Стоит отметить, что эти датчики часто демонстрируют чуть больше изменение сигнала во время их первого испытания, а цикл регенерации, и чрезвычайно устойчивые результаты в течение последующих циклах ^6.

5. Датчик тестирование, обнаружение антител

1. В этом протоколе, метиленовым синим и тиоловых модифицированных ДНК-зонда, используемые в этих датчиков служит "якорем" нить ^7. Он крепится непосредственно к золотому электроду. Это то гибридизации с во-вторых, "признание" ДНК, который был ковалентно конъюгированный с соответствующим антигеном (рис. 4). У нас были удачи в коммерческих домах синтеза, таких как Biosearch технологий и Panagene, для синтеза необходимых ДНК-антигену химеры. Гибридизации шаг осуществляется путем перечисления сборных датчика в трубке Эппендорф, содержащий 100 нМ соответствующей цепи ДНК признание в PBS в течение 1 часа.
2. Установите датчик в соответствующих пустое решение. Прикрепите его к рабочему электроду примеру потенциостате и место платиновый электрод счетчика и серебро / серебро электрода сравнения хлорида в растворе.
3. Выполните квадратных вольтамперометрии волны, как описано выше. Для определенной архитектуры зонда мы использовали здесь оптимальная частота волны площадью 60 Гц. Вы должны увидеть округлый пик около -0,35 В. Сохранить этом фоне измерения.
4. Передача электроды к раствору, содержащему целевой аналита, инкубировать 5 до 60 мин, а собирать второй квадрат voltammagram волны. Если цель антител присутствует пик при -0,35 V будет уменьшаться. Величина этого изменения, связанные с концентрации антител.

6. Тестирование датчика, Малый Обнаружение молекулы

1. В этом случае зонд молекулы на поверхности сенсора является аптамеров, ДНК или РНК, молекулы, которая была выбрана в пробирке связать конкретные молекулярные аналита, что изменение его структуры (складки) при связывании с его целевым аналита ^8,9 ( Рисунок 5). Здесь мы воспользуемся кокаина имеют обязательной силы, ДНК аптамер разработан Стоянович ^10,11 лаборатории.
2. Промойте свежие сенсор с DI-воды и опустите его в пустой образец отсутствует цель, чтобы записать фонового сигнала она производит. Прикрепите датчик рабочего электрода примеру потенциостате. Место счетчик платины и серебра / хлорида серебра ссылку в раствор.
3. Выполните квадратных вольтамперометрии волны, как описано выше. Для определенной архитектуры зонда мы использовали здесь оптимальным квадратный частоты волны 200 Гц (Но 60 Гц также работает). Вы должны увидеть округлый пик около -0,35 В. Сохранить этом фоне измерения.
4. Передача электроды к раствору, содержащему целевой аналита, инкубировать в течение ~ 5 мин, и собирают второй квадрат voltammagram волны. Высота пика при -0,35 V будет меняться. Величина этого изменения, связанные с концентрацией целевой аналита. Если вы не можете получить кокаин образца, прокаин, использование которых не регулируется, может быть использован в качестве замены.

7. Представитель Результаты:

Когда используется для обнаружения ДНК с использованием первого архитектуры, сигнал должен уменьшиться не менее 60% при уравновешенной при 200 нм цели. После трех кратких полосканий в деионизованной воде, сигнал должен вернуть в непосредственной близости (в пределах 0,1-5%) в его первоначальное значение. Датчики обнаружения антител должен пройти сигнал снижение от 40 до 80%. Аптамер основе датчиков для обнаружения кокаина выставку сигнал увеличение до 200% в зависимости от частоты и покрытия поверхности, на которой они работают. Для кокаина датчик, низкий охват поверхности лучше ^3.

Рисунок 1. Обнаружение ДНК с ДНК электрохимических биосенсоров.

Рисунок 2. Снимок показывает сигнал, E-ДНК-биосенсор в квадратных вольтамперометрии волны.

Рисунок 3. Снимок экрана показывающий сигналы, создаваемые E-ДНК биосенсор в квадратных вольтамперометрии волны, до и после гибридизации с аналита.

Рисунок 4. Обнаружение антител с биосенсор эшафот.

Рисунок 5. Обнаружения кокаина или прокаин с биосенсор электрохимической аптамеров.

Custom Oligo	Последовательность	Комментарии
Линейный датчик ДНК (LP17)	5'-HS-(CH 2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(СН2) 7-NH-MB-3 '	ВЭЖХ очищенная, могут быть заказаны с SS
ДНК-мишени Аналит	AATAAAACGCCGATCCA	Немодифицированные
Признание Strand	5'-антиген-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 '
Леса Якорь	5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7 МБ	ВЭЖХ очищенная, могут быть заказаны с SS
A4 Кокаин аптамер	5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 '	ВЭЖХ очищенная, могут быть заказаны с SS

Таблица 1. Зонд и последовательности ДНК-мишени.

Обсуждение

Важно отметить, что ни один из экспериментов, описанных выше, будет работать корректно, если электроды были должным образом очищена. Вот руководство, чтобы наша процедура очистки электрохимическим. При работе с СН potentiostats инструменты, бежим этих ступеней очистки с помощью набора из трех макросов программ.

Фазы Ноль (E-чистой O)
Погрузите электроды в 0.5MH ₂ SO ₄ и соединить их с рабочих электродов потенциостате. Также приложите и погрузиться Ag / AgCl ведения и платиновый электрод счетчика. Начните с окислением шаг (2 V в течение 5 с), а затем уменьшение шага (0,35 В в течение 10 с).

Первый этап (E-чистой 1)
Инициировать окисления и восстановления сканирует под тем же кислотной среде (0.5MH ₂ SO ₄₎ от 0,35 до 1,5 В (20 сканирований в скорости сканирования 4 V / с, а интервал выборки в 0,01 В, следуют четыре сканирует на скорости сканирования от 0,1 В / с, а интервал выборки в 0,01 V).

Второй этап (E-чистым 2)
Поведение другой набор электрохимического окисления и восстановления сканирует в кислой среде (0,01 М KCl/0.1 М H ₂ SO _4), охватывающий четыре различных потенциальных диапазонов (все выполнены на 10 сегментов по скорости сканирования 0,1 В с 1 и образец интервалом 0,01 В ): (я) потенциала диапазоне от 0,2 до 0,75 В; (II) потенциальный диапазон от 0,2 до 1,0 В; (III) потенциальный диапазон от 0,2 до 1,25 В; (IV) потенциальный диапазон от 0,2 до 1,5 В.

Многие виды золотых электродов могут быть использованы для проведения этих экспериментов. В дополнение к золотым электродам диске, такие как лиц, работающих здесь, мы имели успех с microfabricated золота поверхностей, золотой проволоки, и золото на печатных платах.

Наряду с датчиками описанных в этой статье, многие другие архитектуры ДНК электрохимических биосенсоров не поступало. Это включает в себя датчики с псевдоузел ^12, тройной нити ^{13, сэндвич-14,} супер-сэндвич ^15, или триплекс ¹⁶ архитектуре.

В будущем мы ожидаем, что эти датчики будут использоваться в медико-санитарных пунктах диагностики медицинский. Они были успешно интегрированы в несколько микрожидкостных устройств ^17,18, и предлагают множество преимуществ по сравнению с оптическими системами обнаружения аналита. В частности, эти датчики могут функционировать в мутных, оптически плотной и очень самофлюоресцирующими образцов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Золотые электроды диска	CH инструменты	CHI101	Может использоваться повторно
Синтетические ДНК-зонда	Biosearch Технологии	Обычай
Синтетические ДНК-мишени	Sigma Genosys	Обычай
Mercaptohexanol	Sigma Aldrich	725 226-1G	Хранить в прохладном темном месте
Платинового электрода	Basi	MW-1032	Может использоваться повторно
Ag / AgCl Ссылка	Basi	MF-2052	Может использоваться повторно
Ткань для полировки	Бюлер	40-7212
Глинозема польской	Бюлер	40-6325-016
Фосфатным буферным солевым буфером, рН 7,4	Sigma Aldrich	P7059-1L
CH инструменты 605A	CH инструменты	605A	Используйте любой потенциостате
Новорожденные телячьей сыворотки	Sigma Aldrich	N4637-500ML	Хранят в замороженном виде
NanoDrop	Fisher Scientific	ND-2000	Используйте любой UV-Vis
ПЦР Mix	Bio-Rad	170-8862	Хранят в замороженном виде
Кокаин	Sigma Aldrich	C5776	DEA лицензия
Прокаин	Sigma Aldrich	P9879	Замените на кокаин
Anti-Flag антител	Sigma Aldrich	F1804-1 мг