Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

Riepilogo

"E-DNA" sensori, reagentless, biosensori elettrochimici che ottengono buoni risultati anche quando sfidato direttamente nel sangue e altre matrici complesse, sono stati adattati per il rilevamento di una vasta gamma di acidi nucleici, proteine ​​e analiti di piccole molecole. Qui vi presentiamo una procedura generale per la fabbricazione e l'uso di sensori di questo tipo.

Abstract

Come la medicina è attualmente praticata, i medici inviare i campioni a un laboratorio centrale per la verifica e quindi devono aspettare ore o giorni per ricevere i risultati. Molti pazienti sarebbero meglio serviti da una rapida, test capezzale. A tal fine il nostro laboratorio e altri hanno sviluppato una versatile piattaforma reagentless biosensore in grado di supportare il quantitativo, reagentless, rilevazione elettrochimica degli acidi nucleici (DNA, RNA), proteine ​​(compresi gli anticorpi) e piccole molecole di analiti direttamente trasformati in campioni clinici e ambientali. In questo video, ci dimostrano la preparazione e l'impiego di biosensori diversi in questa categoria "E-DNA". In particolare, fabbricare e dimostrare sensori per la rilevazione di una sequenza di DNA in una miscela di reazione a catena della polimerasi, un HIV-specifici anticorpi e la cocaina droga. La procedura di preparazione richiede solo tre ore di hands-on sforzo seguito da una notte di incubazione, e il loro uso richiede solo pochi minuti.

Protocollo

1. Impostazione della fase

1. Acquisto pertinenti, il DNA sonda modificati chimicamente da una società di sintesi su oligonucleotidi come Technologies Biosearch (Novato, CA) o Midland Certified (Midland, TX). La sonda viene modificato durante la sintesi con l'aggiunta di un tiolo C6 alla sua 3'-end e un redox-attivi blu di metilene al suo 5'-end.
2. Sciogliere il DNA sonda in soluzione salina tampone fosfato pH 7,4 a una concentrazione di 200 micron e verificare la sua concentrazione misurando la sua assorbanza a 260 nm con uno spettrofotometro. A causa della porzione blu di metilene sulla sonda DNA la soluzione deve avere una tinta blu visibile.
3. Appena preparare 1 ml di una soluzione 10 mM di tris (2-carbossietil) fosfina TCEP in distillata, acqua deionizzata (acqua demineralizzata). Nella nostra esperienza, queste soluzioni TCEP rimangono freschi per una settimana, se conservato al buio a 4 ° C.
4. Per ridurre i ponti disolfuro che potrebbero essere presenti nella soluzione del DNA sonda, unire 1 ml di soluzione madre sonda di DNA con 2 ml di soluzione TCEP e mescolare delicatamente con una pipetta. Incubare la miscela per un'ora al buio, contenitore refrigerato. La soluzione inizialmente blu dovrebbe diventare chiaro come il TCEP riduce reversibilmente il blu di metilene. Se la soluzione non diventa chiaro, ripetere la procedura utilizzando una soluzione fresca TCEP o, eventualmente, a temperatura ambiente.
5. Dopo un'ora diluire la soluzione ridotto sonda di DNA con 1 ml di tampone, questo lo diluire ad una concentrazione di 200Nm. In seguito, si incubare una serie di elettrodi disco d'oro in 200 ml di porzioni questa soluzione diluita sonda.
6. Appena preparare almeno 2 ml di 2mM mercaptohexanol in tampone fosfato salino.

2. Sensore di preparazione

1. Combina 0,05 micron polvere di allumina con acqua su un panno fine. Lucidare una serie di elettrodi disco d'oro (CH Instruments, Austin, TX) premendo la superficie d'oro saldamente il panno bagnato, e lo spostamento in una figura otto modello per circa tre minuti per ogni elettrodo.
2. Lavare gli elettrodi lucido con acqua demineralizzata e immergerli in provette Eppendorf riempito con la stessa. Ultrasuoni per cinque minuti per rimuovere ogni residuo di polvere di allumina.
3. Posizionare gli elettrodi in una soluzione 0,5 M di acido solforico, allegarle a un potenziostato insieme a un contatore di platino e argento / argento cloruro di elettrodo di riferimento, ed eseguire una serie di voltammograms di ossidare, ridurre e elettrochimicamente pulite le superfici. A seguito di questa eseguire una seconda pulizia elettrochimica in una soluzione di KCl 0,01 M a 0,1 M di acido solforico. I dettagli di queste operazioni di pulizia si possono trovare in Nature nostro protocolli ^1, e nel supplemento di questo video.
4. Organizzare una serie di 2 ml provette Eppendorf in un rack e riempire ogni con 200 microlitri della soluzione di DNA sonda. La concentrazione del DNA sonda in questa soluzione definirà la densità con la quale la sonda DNA pacchetto sulla superficie del sensore. Prestazioni del sensore è fortemente dipendente dalla densità della sonda, con la densità ottimale che variano da un sensore di architettura a quella successiva. La concentrazione sonda utilizzata in questa fase devono quindi essere ottimizzate per ogni nuovo tipo di sensore ^2. Per le architetture sonda abbiamo studiato fino ad oggi, le concentrazioni sonda di DNA che impieghiamo in questa fascia di passo da 15 nm a 2 micron, con 200 nM di essere un valore tipico.
5. Lavare gli elettrodi disco d'oro con acqua demineralizzata, e poi immergere nella soluzione di rilevanti DNA sonda in una provetta Eppendorf per un'ora. A questo punto, il DNA sonda attribuirà alla superficie dell'elettrodo d'oro attraverso la formazione di un tiolo-on-oro monostrato auto assemblate.
6. Lavare gli elettrodi con acqua demineralizzata, immergerle in 2mM mercaptohexanol in una provetta Eppendorf e conservarle in un luogo buio per 3 ore a notte a temperatura ambiente per garantire la formazione completa della monostrato auto assemblate. Questa fase comprende la mercaptohexanol come parte di un monostrato misto a garantire la formazione di un monostrato stabile. Per evitare l'evaporazione si consiglia di sigillare l'elettrodo all'interno del tubo Eppendorf con parafilm. I sensori possono essere memorizzati in questa soluzione per diversi giorni, se necessario.
7. Quando si è pronti per utilizzare il sensore, sciacquare con acqua demineralizzata e poi immergerlo in un tampone per almeno dieci minuti. Sensori volti a rilevazione degli anticorpi devono essere immersi in una soluzione di 100 nM del filamento riconoscimento rilevanti prima dell'uso, seguito da un risciacquo estremamente veloce con il tampone.

3. Sensore di test, rilevamento del DNA

1. In questo protocollo, da 17 filamento sonda nucleotide è apposto su un elettrodo d'oro. Ha un giornalista redox blu di metilene al suo 3'-end (Figura 1). Quando la molecola sonda ibrida con un filo di cattura, la corrente attraverso il circuito del sensore diminuisce.
2. Sciacquare un sensore di fresco con acqua demineralizzata ed immergerlo in un vuotocampione manca il bersaglio in modo da registrare il segnale di fondo che produce. Collegare il sensore al cavo elettrodo di lavoro di un potenziostato. Posizionare un elettrodo contatore platino e un argento / argento cloruro di elettrodo di riferimento nella soluzione.
3. Eseguire una misurazione ad onda quadra da 0 a -0,6 V con un'ampiezza di 25 mV e un passo di 1mV. La frequenza ottimale onda quadra dipenderà dai dettagli dell'architettura sonda ^2,3; per le architetture sonda abbiamo impiegato i valori ottimali sono tipicamente nella gamma da 60 a 600 Hz.. Si dovrebbe vedere un picco arrotondato a circa -0,35 V, il potenziale redox del blu di metilene (il potenziale di picco potrebbe spostarsi leggermente a seconda del pH della soluzione esatta di prova). L'altezza dal basale a questa corrente di picco è proporzionale alla efficienza di trasferimento di elettroni tra il blu di metilene e l'elettrodo di oro (Figura 2). Salva questo misurazione del fondo.
4. Spostare gli elettrodi di una soluzione che contiene la molecola di DNA bersaglio di interesse, equilibrare (5 a 120 min a seconda della struttura le dimensioni e la concentrazione del target4, 5) e raccogliere un voltammagram secondo un'onda quadra. L'altezza del picco a -0,35 V cambierà da iniziale, misurazione del fondo. L'entità di questo cambiamento è legato alla concentrazione dell'analita. Si tratta di dati di output principale di questo sensore (Figura 3).
5. Misurare il cambiamento relativo segnale, la diminuzione percentuale o aumento del segnale relativo al picco di fondo, spesso è più riproducibile di misurare la variazione assoluta di corrente, in quanto corregge le variazioni di superficie dell'elettrodo. Per fare questo, la differenza tra la corrente di picco e la corrente di picco di fondo sono divisi per il picco di sfondo corrente.

4. Sensore di Rigenerazione

1. Una volta che le misurazioni sono state completate, spostare il sensore in un contenitore riempito con acqua demineralizzata per 30 s, oppure spruzzare con un flusso costante di acqua demineralizzata per 30 s. Ripetere questa altre due volte con dolce acqua deionizzata. Nota: alcuni analiti sono resistenti a questo approccio, per loro provare aggressivi risciacquo in 6 M guanidina cloridrato o etanolo al 70%.
2. Mettere il sensore posteriore in una soluzione in cui le misure saranno effettuate. Nel giro di un minuto, l'altezza del picco dovrebbe essere restituita al suo valore originale. Vale la pena notare che questi sensori spesso mostrano un cambiamento di segnale leggermente più grande durante il loro primo test e ciclo di rigenerazione, ed i risultati altamente coerente durante i cicli successivi ^6.

5. Sensore di test, ricerca di anticorpi

1. In questo protocollo, la sonda di DNA di blu di metilene e tiolo modificati utilizzati in questi sensori funge da filo "ancora" ^7. E 'collegato direttamente all'elettrodo d'oro. Questo è quindi ibridato con un secondo filone "riconoscimento" del DNA che è stato coniugato covalentemente per l'antigene in questione (Figura 4). Abbiamo avuto fortuna con le case sintesi commerciali, come le tecnologie Biosearch e Panagene, per la sintesi del DNA-antigene necessaria chimere. L'ibridazione avviene con il trasferimento di un sensore di prefabbricati in una provetta Eppendorf contenente 100 nM del filamento di DNA rilevante riconoscimento in PBS per 1 ora.
2. Posizionare il sensore nella soluzione di rilevanti vuoto. Allegarlo al piombo dell'elettrodo di lavoro di un potenziostato e posizionare un elettrodo contatore platino e argento / elettrodo di riferimento nella soluzione di cloruro.
3. Eseguire voltammetria ad onda quadra come descritto sopra. Per l'architettura sonda particolare abbiamo impiegato qui l'ottimale frequenza dell'onda quadra è di 60 Hz. Si dovrebbe vedere un picco arrotondato intorno -0,35 V. Salva questo misurazione del fondo.
4. Trasferire gli elettrodi di una soluzione contenente l'analita target, incubare per 5 a 60 minuti, e raccogliere un voltammagram secondo un'onda quadra. Se il bersaglio degli anticorpi è presente il picco a -0,35 V diminuirà. L'entità di questo cambiamento è legato alla concentrazione di anticorpi.

6. Sensore di prova, Molecule Detection Piccoli

1. In questo caso, la molecola sonda sulla superficie del sensore è un aptamero, una molecola di DNA o RNA che è stato selezionato in vitro per associare un analita molecolare specifico, che cambia la sua struttura (pieghe) su vincolante per i suoi dell'analita bersaglio ^8,9 ( Figura 5). Qui ci impiegano un cocaina-vincolante, aptamero DNA sviluppato dal Stojanovic ^10,11 laboratorio.
2. Sciacquare un sensore di fresco con acqua demineralizzata e immergerlo in un campione in bianco manca il bersaglio in modo da registrare il segnale di fondo che produce. Collegare il sensore al cavo elettrodo di lavoro di un potenziostato. Mettere un contatore di platino e un argento / argento cloruro di riferimento nella soluzione.
3. Eseguire voltammetria ad onda quadra come descritto sopra. Per l'architettura sonda particolare abbiamo impiegato qui la frequenza ottimale onda quadra è 200Hz (Ma funziona anche 60 Hz). Si dovrebbe vedere un picco arrotondato intorno -0,35 V. Salva questo misurazione del fondo.
4. Trasferire gli elettrodi di una soluzione contenente l'analita target, incubare per ~ 5 minuti, e raccogliere un voltammagram secondo un'onda quadra. L'altezza del picco a -0,35 V cambierà. L'entità di questo cambiamento è legato alla concentrazione dell'analita bersaglio. Se non è possibile ottenere un campione di cocaina, procaina, il cui uso è regolamentato, può essere utilizzato come un sostituto.

7. Rappresentante dei risultati:

Quando viene utilizzato per rilevare il DNA utilizzando la prima architettura, il segnale dovrebbe diminuire di almeno il 60% quando equilibrata bersaglio a 200 nM. Dopo tre brevi risciacqui in acqua deionizzata, il segnale dovrebbe tornare molto vicino (entro 0,1-5%) al suo valore originale. Sensori di rilevamento degli anticorpi devono essere sottoposti ad una diminuzione del segnale dal 40 al 80%. Aptamer a base di sensori per il rilevamento di cocaina mostrano un aumento del segnale fino a 200% a seconda della copertura di frequenza e la superficie in cui operano. Per il sensore di cocaina, una copertura superficiale bassa è meglio ^3.

Figura 1. Rilevazione del DNA con un biosensore elettrochimico DNA.

Figura 2. Schermata che mostra il segnale prodotto da un E-DNA biosensore durante voltammetria ad onda quadra.

Figura 3. Schermata che mostra i segnali prodotti da una E-DNA biosensore durante voltammetria ad onda quadra, prima e dopo ibridazione con un analita.

Figura 4. Individuazione di anticorpi con un biosensore patibolo.

Figura 5. Rilevamento di cocaina o procaina con un biosensore elettrochimico aptamero.

Personalizzati Oligo	Sequenza	Commenti
Lineare sonda DNA (LP17)	5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 '	HPLC purificato, può essere ordinato con la SS
Analita bersaglio del DNA	AATAAAACGCCGATCCA	Non modificato
Riconoscimento Strand	5'-antigene-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 '
Ponteggio di ancoraggio	5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7 MB	HPLC purificato, può essere ordinato con la SS
A4 cocaina aptamero	5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 '	HPLC purificato, può essere ordinato con la SS

Tabella 1. Sonda e sequenze di DNA bersaglio.

Discussione

Una nota importante è che nessuno degli esperimenti descritti sopra funzioneranno correttamente a meno che gli elettrodi sono stati adeguatamente puliti. Ecco una guida per la nostra procedura di pulizia elettrochimica. Quando si lavora con CH potenziostati Instruments, corriamo queste operazioni di pulizia utilizzando una serie di tre programmi macro.

Fase Zero (E-clean O)
Immergere gli elettrodi nella 0.5MH ₂ SO ₄ e collegarli agli elettrodi di lavoro di un potenziostato. Anche allegare e immergere un riferimento Ag / AgCl e contro elettrodo di platino. Inizia con un passo di ossidazione (2 V per 5 s) e poi una fase di riduzione (0,35 V per 10 s).

Phase One (E-clean 1)
Avviare l'ossidazione e riduzione scansioni alle stesse condizioni acide (0.5MH ₂ SO ₄₎ 0,35-1,5 V (20 scansioni a una velocità di scansione di 4 V / s ed un intervallo di campionamento di 0,01 V, seguito da quattro scansioni a una velocità di scansione di 0,1 V / s ed un intervallo di campionamento di 0,01 V).

Fase Due (E-clean 2)
Effettua un'altra serie elettrochimica di ossidazione e riduzione scansioni in condizioni di acidità (0,01 M KCl/0.1 MH ₂ SO ₄₎ che coprono quattro campi diversi potenziali (tutti eseguiti per 10 segmenti ad una velocità di scansione di 0,1 V s 1 e un intervallo di campionamento di 0,01 V ): (i) campo di potenziale 0,2-0,75 V, (ii) Gamma potenziali 0,2-1,0 V, (iii) la gamma potenziale 0,2-1,25 V, (iv) la gamma potenziale 0,2-1,5 V.

Molti tipi di elettrodi d'oro possono essere utilizzate per condurre questi esperimenti. Oltre a elettrodi disco d'oro come quelli impiegati qui, abbiamo avuto successo con superfici d'oro microfabbricazione, filo d'oro, e oro su circuiti stampati.

Insieme con i sensori descritti in questo documento, molti altri elettrochimici architetture biosensore di DNA sono stati segnalati. Ciò include sensori con pseudoknot ^12, triplo filo ^13, panino ^14, panino Super ^15, o ¹⁶ triplex dell'architettura.

In futuro, ci aspettiamo che questi sensori verranno utilizzati nel punto di assistenza diagnostica medica. Sono state integrate con successo in diversi dispositivi microfluidici ^17,18, e offrono molti vantaggi rispetto ai sistemi ottici di rilevamento analita. In particolare, questi sensori possono funzionare nel torbido, otticamente denso e altamente auto-fluorescente campioni.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Elettrodi disco d'oro	CH Instruments	CHI101	Possono essere riutilizzati
Sintetico sonda DNA	Biosearch Technologies	Costume
Obiettivo DNA sintetico	Sigma Genosys	Costume
Mercaptohexanol	Sigma Aldrich	725226-1G	Conservare in luogo fresco e buio
Elettrodi di platino	BASI	MW-1032	Possono essere riutilizzati
Ag / AgCl di riferimento	BASI	MF-2052	Possono essere riutilizzati
Panno	Buehler	40-7212
Allumina polacco	Buehler	40-6325-016
Tampone fosfato tampone salino, pH 7,4	Sigma Aldrich	P7059-1L
CH Instruments 605A	CH Instruments	605A	Utilizzare qualsiasi potenziostato
Siero di vitello neonato	Sigma Aldrich	N4637-500ML	Conservati congelati
NanoDrop	Fisher Scientific	ND-2000	Utilizzare qualsiasi UV-Vis
PCR Mix	Bio-Rad	170-8862	Conservati congelati
Cocaina	Sigma Aldrich	C5776	DEA o titolo richiesto
Procaina	Sigma Aldrich	P9879	Sostituto di cocaina
Anti-Flag anticorpo	Sigma Aldrich	F1804-1mg