Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

Resumo

"E-DNA" sensores, reagentless, biossensores eletroquímicos que um bom desempenho, mesmo quando desafiados diretamente no sangue e outras matrizes complexas, foram adaptados para a detecção de uma ampla gama de ácido nucléico, proteínas e moléculas pequenas analitos. Aqui apresentamos um procedimento geral para a fabricação e uso de tais sensores.

Resumo

Como a medicina é praticada atualmente, os médicos enviar amostras para um laboratório central para testes e, portanto, deve esperar horas ou dias para receber os resultados. Muitos pacientes seriam melhor servidos pela rápida, testes de cabeceira. Para este fim o nosso laboratório e outros desenvolveram uma plataforma versátil, reagentless biosensor que suporta o quantitativo, reagentless, detecção eletroquímica de ácidos nucléicos (DNA, RNA), proteínas (incluindo anticorpos) e analitos pequenas moléculas não transformados diretamente em amostras clínicas e ambientais. Neste vídeo, demonstramos a preparação e utilização de biossensores várias neste "E-DNA" de classe. Em particular, podemos fabricar e demonstrar sensores para a detecção de uma seqüência de DNA alvo em uma mistura de reação em cadeia da polimerase, um anticorpo HIV-específicos e da cocaína de drogas. O procedimento de preparação requer apenas três horas de hands-on esforço seguido por uma incubação durante a noite, e seu uso exige apenas alguns minutos.

Protocolo

1. Montando o Palco

1. Compra relevante, DNA sonda quimicamente modificados de uma empresa de costume oligonucleotídeo síntese, tais como Biosearch Technologies (Novato, CA) ou Certified Midland (Midland, TX). A sonda é modificado durante a síntese pela adição de um tiol C6 em sua extremidade 3'-e um azul de metileno redox-ativo em sua extremidade 5'-.
2. Dissolver o DNA da sonda em tampão fosfato salina pH 7,4 para uma concentração de 200 mM e verificar a sua concentração, medindo sua absorbância a 260 nm usando um espectrofotômetro. Devido à molécula de azul de metileno na sonda de DNA a solução deve ter uma coloração azul visível.
3. Recém preparar 1 mL de uma solução de 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina TCEP em água destilada deionizada (DI-água). Em nossa experiência, essas soluções TCEP permanecem frescos por uma semana quando armazenado no escuro a 4 ° C.
4. Para reduzir qualquer pontes dissulfeto que podem estar presentes na solução de DNA sonda, combine 1 mL da solução-mãe sonda de DNA com 2 mL da solução TCEP e misture delicadamente com uma pipeta. Incubar a mistura por uma hora em um recipiente escuro e refrigerado. A solução, inicialmente azul deve ficar claro como o TCEP reversivelmente reduz o azul de metileno. Se a solução não se torna claro, repita o procedimento usando uma solução de TCEP frescos ou, possivelmente, à temperatura ambiente.
5. Depois de uma hora diluir a solução sonda reduzida DNA com 1 mL de tampão, o que irá diluir a uma concentração de 200nM. Mais tarde, você vai incubar um conjunto de eletrodos de disco de ouro em 200 porções mL desta solução diluída sonda.
6. Recém preparar pelo menos 2 mL de 2mm mercaptohexanol em tampão fosfato salino.

2. Preparação de sensor

1. Combine 0,05 micron alumina em pó com água em um pano de polimento fino. Polonês um conjunto de eletrodos de disco de ouro (CH Instruments, Austin, TX), pressionando a superfície de ouro firmemente o pano molhado, e movê-los em uma figura oito padrão por aproximadamente três minutos por eletrodo.
2. Enxágüe os eletrodos polido com DI-água e mergulha-as em tubos Eppendorf preenchido com o mesmo. Sonicado por cinco minutos para remover qualquer pó de alumina residual.
3. Colocar os eletrodos em uma solução 0,5 M de ácido sulfúrico, anexá-los a um potenciostato, juntamente com um contador de platina e prata / cloreto de prata eletrodo de referência, e executar uma série de voltamogramas para oxidar, reduzir e eletroquimicamente limpa suas superfícies. Seguindo essa executar uma limpeza eletroquímica segundo de uma solução de 0,01 M KCl em 0,1 M de ácido sulfúrico. Os detalhes destes procedimentos de limpeza podem ser encontrados em nosso artigo da Nature Protocols ^1, e no suplemento a este vídeo.
4. Organizar um conjunto de 2 tubos Eppendorf mL em um rack e preencha cada um com 200 mL da solução de DNA sonda. A concentração do DNA sonda nesta solução irá definir a densidade com que a sonda DNAs pacote na superfície do sensor. Desempenho do sensor é fortemente dependente da densidade de sonda, com a densidade ideal varia de uma arquitetura de sensores para a próxima. A concentração sonda utilizada nesta etapa devem, portanto, ser otimizados para cada novo tipo de sensor ^2. Para as arquiteturas sonda temos investigado até o momento, as concentrações de DNA sonda que empregamos nesta faixa de passo de 15 nM de 2 m, com 200 nM de ser um valor típico.
5. Enxágüe os eletrodos de disco de ouro com DI-água, e depois mergulha-as na solução de relevantes sonda de DNA em um tubo Eppendorf durante uma hora. Neste ponto, o DNA sonda irá anexar à superfície do eletrodo de ouro através da formação de uma monocamada auto-tiol-on-ouro montado.
6. Enxágüe os eletrodos com água DI, mergulha-as na 2mM mercaptohexanol em um tubo Eppendorf e armazená-los em um lugar escuro por 3 horas durante a noite à temperatura ambiente para garantir a formação completa da monocamada auto montado. Esta etapa incorpora o mercaptohexanol como parte de uma monocamada mista para garantir a formação de uma monocamada estável. Para evitar a evaporação que você pode querer fechar o eletrodo dentro do tubo Eppendorf com parafilme. Sensores podem ser armazenados nessa solução por vários dias, se necessário.
7. Quando você está pronto para usar o sensor, lave-o com DI-água e, em seguida, mergulhe-o em buffer de pelo menos 10 minutos. Sensores destinados a detecção de anticorpos também deve ser imerso em uma solução de 100 nM da vertente reconhecimento relevantes antes do uso, seguida por uma rápida extremamente enxaguar com buffer.

3. Teste do sensor, detecção de DNA

1. Neste protocolo, a 17 nucleotídeos vertente sonda está afixada a um eletrodo de ouro. Tem um azul de metileno repórter redox em sua extremidade 3'-(Figura 1). Quando a molécula sonda hibridiza com uma fita de captura, a corrente através do circuito do sensor diminui.
2. Enxágüe um sensor fresco com DI-água e mergulhe em um espaço em brancoamostra sem o alvo, a fim de gravar o sinal de fundo que produz. Ligue o sensor ao cabo-eletrodo de trabalho de um potenciostato. Coloque um contra-eletrodo de platina e um de prata / prata eletrodo de referência de cloreto na solução.
3. Executar uma medição de onda quadrada de 0 a -0,6 V com uma amplitude de 25 mV e um tamanho de passo de 1mV. A freqüência da onda quadrada ideal vai depender dos detalhes da arquitetura sonda ^2,3; para as arquiteturas sonda temos empregado os valores ideais são tipicamente na faixa de 60 a 600 Hz. Você deverá ver um pico arredondado em aproximadamente -0,35 V, o potencial redox do azul de metileno (o potencial de pico pode mudar ligeiramente, dependendo do pH precisa da sua solução de teste). A altura da linha de base atual para este pico é proporcional à eficiência de transferência de elétrons entre o azul de metileno eo eletrodo de ouro (Figura 2). Salve esta medida de fundo.
4. Mover os eletrodos a uma solução que contém a molécula de DNA alvo de interesse, equilibrar (5 a 120 min, dependendo do tamanho, estrutura e concentração do target4, 5) e recolher uma voltammagram segunda onda quadrada. A altura do pico em -0,35 V vai mudar a partir da medição de fundo inicial,. A magnitude desta mudança está relacionada com a concentração do analito. É a saída de dados principal deste sensor (Figura 3).
5. Medir a mudança de sinal, a diminuição ou aumento do sinal em relação ao pico de fundo, muitas vezes é mais reprodutível de medir a variação absoluta na corrente, pois isso corrige as variações de área de superfície do eletrodo. Para fazer isso, a diferença entre a corrente de pico ea corrente de pico de fundo são divididos pelo pico de fundo actual.

4. Regeneração Sensor

1. Uma vez que suas medições estão completas, mova o sensor em um recipiente cheio de água DI por 30 s, ou esguicho-lo com um fluxo constante de DI-água por 30 s. Repita isso duas vezes mais com água deionizada fresco. Nota: alguns analitos são resistentes a esta abordagem, para eles tentar agressivo de lavagem em 6 de cloridrato de guanidina M ou etanol a 70%.
2. Coloque o sensor de volta em uma solução onde as medições serão feitas. Dentro de um minuto, a altura do pico deveria ter retornado ao seu valor original. É interessante notar que esses sensores apresentam frequentemente uma mudança de sinal ligeiramente maior durante seu primeiro teste e ciclo de regeneração, e os resultados altamente consistentes durante os ciclos subseqüentes ^6.

5. Teste do sensor, a detecção de anticorpos

1. Neste protocolo, a sonda de DNA-azul de metileno e tiol-modificadas utilizados nestes sensores serve como uma "âncora" vertente ^7. Ele está ligado diretamente ao eletrodo de ouro. Este é então hibridizado com uma segunda vertente "reconhecimento", o DNA que foi covalentemente conjugado com o antígeno relevante (Figura 4). Tivemos sorte com casas síntese comerciais, tais como Biosearch Technologies e Panagene, para a síntese de DNA necessária antígeno-quimeras. A hibridação é realizada através da transferência de um sensor de pré-fabricados em um tubo Eppendorf contendo 100 nM da vertente relevante o reconhecimento de DNA em PBS por 1 hora.
2. Coloque o sensor na solução relevantes em branco. Anexá-lo ao cabo-eletrodo de trabalho de um potenciostato e colocar um contra-eletrodo de platina e prata / cloreto de prata eletrodo de referência na solução.
3. Executar voltametria de onda quadrada, como descrito acima. Para a arquitetura sonda especial que temos aqui empregada a freqüência de onda ideal quadrado é de 60 Hz. Você deverá ver um pico arredondado em torno de -0,35 V. Salve esta medida de fundo.
4. Transferir os eletrodos a uma solução contendo o analito alvo, incubar por 5 a 60 min, e cobrar uma voltammagram segunda onda quadrada. Se o anticorpo alvo é apresentar o pico em -0,35 V irá diminuir. A magnitude desta mudança está relacionada com a concentração de anticorpos.

6. Teste do sensor, detecção de pequenas moléculas

1. Neste caso, a molécula sonda na superfície do sensor é um aptamer, uma molécula de RNA ou DNA que foi selecionado in vitro para vincular um analito específico molecular, que muda sua estrutura (dobras) sobre a ligação ao seu analito alvo ^8,9 ( Figura 5). Aqui nós empregamos uma cocaína de ligação aptamer DNA, desenvolvida pelo laboratório ^10,11 Stojanovic.
2. Enxágüe um sensor fresco com DI-água e mergulhe em uma amostra em branco sem o alvo, a fim de gravar o sinal de fundo que produz. Ligue o sensor ao cabo-eletrodo de trabalho de um potenciostato. Coloque um contador de platina e um de referência de cloreto de prata / prata na solução.
3. Executar voltametria de onda quadrada, como descrito acima. Para a arquitetura sonda especial que temos aqui empregada a freqüência da onda quadrada é ótima 200Hz (Mas 60 Hz também funciona). Você deverá ver um pico arredondado em torno de -0,35 V. Salve esta medida de fundo.
4. Transferir os eletrodos a uma solução contendo o analito alvo, incubar por 5 min ~, e cobrar uma voltammagram segunda onda quadrada. A altura do pico em -0,35 V vai mudar. A magnitude desta mudança está relacionada com a concentração do analito alvo. Se você não puder obter uma amostra de cocaína, procaína, cuja utilização é regulamentada, pode ser usado como um substituto.

7. Resultados representativos:

Quando usado para a detecção do DNA usando a arquitetura de primeira, o sinal deve diminuir em pelo menos 60%, quando equilibrada em 200 nM alvo. Depois de três lavagens em água deionizada breve, o sinal deve retornar muito perto (dentro de 0,1-5%) ao seu valor original. Sensores de detecção de anticorpos devem ser submetidos a uma diminuição do sinal de 40 a 80%. Aptamer baseado em sensores para a detecção de cocaína apresentam um aumento de sinal de até 200%, dependendo da freqüência e cobertura da superfície na qual eles operam. Para o sensor de cocaína, uma cobertura de superfície de baixa é o melhor ^3.

Figura 1. Detecção de DNA com um biosensor eletroquímico DNA.

Figura Captura de tela 2. Mostrando o sinal produzido por um biosensor E-DNA durante a voltametria de onda quadrada.

Figura Captura de tela 3. Mostrando os sinais produzidos por um biosensor E-DNA durante a voltametria de onda quadrada, antes e depois de hibridação com um analito.

Figura 4. Detecção de anticorpos com um biosensor andaime.

Figura 5. Detecção de cocaína ou procaína com um biosensor aptamer eletroquímica.

Personalizado Oligo	Seqüência	Comentários
Probe linear de DNA (LP17)	5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 '	HPLC purificada, pode ser encomendado com SS
DNA do analito alvo	AATAAAACGCCGATCCA	Sem modificações
Reconhecimento Strand	5'-antígeno-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 '
Andaime Anchor	5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7-MB	HPLC purificada, pode ser encomendado com SS
A4 cocaína Aptamer	5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 '	HPLC purificada, pode ser encomendado com SS

Tabela 1. Sonda e seqüências de DNA alvo.

Discussão

Uma observação importante é que nenhum dos experimentos descritos acima irá funcionar corretamente a menos que os eletrodos tenham sido adequadamente limpos. Aqui está um guia para o nosso procedimento de limpeza eletroquímica. Ao trabalhar com potentiostats CH Instruments, corremos estes passos limpeza utilizando um conjunto de três programas de macro.

Fase Zero (E-clean O)
Mergulhar os eléctrodos na 0.5MH ₂ SO ₄ e conectá-los para os eletrodos de trabalho de um potenciostato. Também anexar e mergulhe uma referência de Ag / AgCl e contra eletrodo de platina. Comece com uma etapa de oxidação (2 V por 5 s) e, em seguida, uma etapa de redução (0,35 V durante 10 s).

Phase One (E-clean 1)
Iniciar a oxidação e redução de varreduras nas mesmas condições ácidas (0.5MH ₂ SO ₄₎ 0,35-1,5 V (20 scans em uma taxa de varredura de 4 V / s e um intervalo de amostragem de 0,01 V, seguido por quatro varreduras em uma taxa de varredura de 0,1 V / s e um intervalo de amostragem de 0,01 V).

Fase Dois (E-clean 2)
Realizar um outro conjunto de eletroquímica de oxidação e redução de scans em condições ácidas (0,01 M KCl/0.1 MH ₂ SO _4), abrangendo quatro diferentes faixas de potencial (tudo feito por 10 segmentos em uma taxa de varredura de 0,1 V s 1 e um intervalo de amostragem de 0,01 V ): (i) faixa de potencial 0,2-0,75 V; (ii) alcance potencial 0,2-1,0 V, (iii) faixa de potencial de 0,2-1,25 V; (iv) potencial gama 0,2-1,5 V.

Muitos tipos de eletrodos de ouro podem ser usados ​​para realizar esses experimentos. Além de eletrodos de disco de ouro, como aqueles empregados aqui, temos tido sucesso com superfícies de ouro microfabricated, fio de ouro, e ouro em placas de circuito impresso.

Juntamente com os sensores descritos neste documento, muitas outras arquiteturas biosensor eletroquímico DNA têm sido relatados. Isto inclui sensores com uma pseudoknot ^12, fio triplo ^{13, 14} sanduíche, sanduíche ^super-15, ou triplex arquitetura ^16.

No futuro, esperamos que estes sensores serão utilizados no ponto de diagnósticos de cuidados médicos. Eles foram integrados com sucesso em vários dispositivos microfluídicos ^17,18, e oferecem muitas vantagens sobre os sistemas de detecção óptica analito. Em particular, esses sensores podem funcionar em turvas, opticamente denso e altamente auto-fluorescentes amostras.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Eletrodos de ouro Disk	CH Instruments	CHI101	Podem ser reutilizados
DNA Probe sintético	Biosearch Technologies	Personalizado
DNA alvo sintético	Sigma Genosys	Personalizado
Mercaptohexanol	Sigma Aldrich	725226-1G	Armazenar em local escuro e fresco
Eletrodo de platina	BASI	MW-1032	Podem ser reutilizados
Ag / AgCl de referência	BASI	MF-2052	Podem ser reutilizados
Pano de polimento	Buehler	40-7212
Polonês Alumina	Buehler	40-6325-016
Tampão salina tampão fosfato, pH 7,4	Sigma Aldrich	P7059-1L
CH Instruments 605A	CH Instruments	605A	Usar qualquer potenciostato
Serum bezerro recém-nascido	Sigma Aldrich	N4637-500ML	Armazenadas congeladas
NanoDrop	Fisher Scientific	ND-2000	Usar qualquer UV-Vis
PCR Mix	Bio-Rad	170-8862	Armazenadas congeladas
Cocaína	Sigma Aldrich	C5776	DEA Licença Obrigatório
Procaína	Sigma Aldrich	P9879	Substituto para a cocaína
Anticorpos Anti-Flag	Sigma Aldrich	F1804-1mg