Los filtros de lana de vidrio para la concentración de virus transmitidas por el agua y la agricultura patógenos zoonóticos

Resumen

Filtros de lana de vidrio se han utilizado para concentrar los virus transmitidos por el agua por un número de grupos de investigación en todo el mundo. Aquí se muestra un método sencillo para la construcción de filtros de lana de vidrio y demostrar los filtros también son eficaces en la concentración de patógenos transmitidos por el agua virus, bacterias y protozoos.

Resumen

El primer paso clave en la evaluación de los niveles de patógenos en el agua contaminada se sospecha es la concentración. Los métodos de concentración tienden a ser específicas para un grupo determinado patógeno, por ejemplo Protección Ambiental de EE.UU. Agencia Método 1623 para Giardia y Cryptosporidium ^1, lo que significa que múltiples métodos son necesarios si el programa de muestreo se dirige a más de un grupo de patógenos. Otro inconveniente de los métodos actuales es el equipo puede ser complicado y caro, por ejemplo el método VIRADEL con el filtro de cartucho 1MDS para concentrar los virus ^2. En este artículo se describe cómo construir filtros de lana de vidrio para la concentración de patógenos en el agua. Después de la elución de filtro, el concentrado es susceptible de una segunda etapa de concentración, tales como centrifugación, seguido por la detección de patógenos y la enumeración de los métodos de cultivo o molecular. Los filtros tienen varias ventajas. La construcción es sencilla y los filtros se pueden construir a unny el tamaño para satisfacer las necesidades específicas de muestreo. Las partes del filtro son baratos, por lo que es posible recoger un gran número de muestras sin afectar gravemente un presupuesto del proyecto. Los grandes volúmenes de muestra (100s a 1.000 s L) se puede concentrar en función de la tasa de obstrucción de turbidez de la muestra. Los filtros son fáciles de transportar y con un equipo mínimo, como una bomba y un medidor de flujo, se pueden implementar en el campo para el muestreo de agua potable final, las aguas superficiales, aguas subterráneas, y la escorrentía agrícola. Por último, la filtración de lana de vidrio es eficaz para concentrar una variedad de tipos de patógenos tan sólo un método es necesario. Aquí nos informe sobre la eficacia del filtro en la concentración de enterovirus humanos transmitidas por el agua, S ALMONELLA enterica, Cryptosporidium parvum, y el virus de la gripe aviar.

Protocolo

1. Preparación de la lana de vidrio

1. Antes y después de hacer cada lote de filtros, esterilizar el área de trabajo con una solución de lejía al 10%.
2. Póngase los guantes y la bata. Esterilizar un cubo en autoclave a 121 ° C y 15 psi durante al menos 20 minutos. Colocar la lana de vidrio en la cubeta estéril.
3. Saturar la lana de vidrio con agua de ósmosis inversa y deje en remojo durante 15 minutos.
4. Vacíe el agua de ósmosis inversa del cubo.
5. Saturar la lana de vidrio con HCl 1 M y deje en remojo durante 15 minutos.
6. Escurrir el HCl 1 M de la cubeta.
7. Lavar la lana de vidrio con agua de ósmosis inversa.
8. Mezclar bien.
9. Comprobar el pH con papel pH y repetir el agua de ósmosis inversa enjuague hasta un pH neutro se consigue.
10. Vierta el agua de enjuague.
11. Saturar la lana de vidrio con 1 M NaOH y deje en remojo durante 15 minutos.
12. Escurrir el NaOH 1 M de la cubeta.
13. Repita la ósmosis inversa enjuague hasta un pH neutro se consigue.
14. Vierta el agua de enjuague.
15. En lugar de un cubo, una arandela de lana de vidrio puede ser construida, que es similar en diseño a una lavadora de vidrio pipeta (Figura 1).
16. Cubrir la lana de vidrio completamente con fosfato estéril salino tamponado (PBS) se ajustó a pH 6,8.
17. El uso de lana de vidrio preparada inmediatamente o se almacena a 4 º C. Se puede almacenar por hasta dos semanas. Antes de utilizarlo, asegúrese de que el pH es neutro, ya que se incrementará con el tiempo. Si el pH no es neutral, vuelva a enjuagar con solución salina estéril tamponada de fosfato (pH 6,8).

2. Montaje del filtro de lana de vidrio

1. Haga un agujero 11/16 pulgadas en las tapas de PVC y los hilos grifo por lo que los accesorios de adaptador macho de nylon pueden ser atornillados en las tapas. Este paso es necesario sólo para la primera asamblea. Posteriormente, las tapas pueden ser utilizados para años. Aplique teflónla cinta en las roscas de los tornillos y herrajes de nylon a las tapas.
2. Paquete de la tubería de PVC con pequeños trozos de lana de vidrio. Use un émbolo metálico, como una válvula de motor de un coche, para empacar apretado. Embalaje no requiere mucha fuerza. Pack suficientemente ajustado para que la lana de vidrio se mantiene en su lugar y no forman canales. Sin embargo, no se empaquetan tan fuertemente el agua no puede fluir a través del filtro. Cuando embalado apropiadamente, con un caudal de 4 a 5 litros por minuto debe ser alcanzable cuando el filtro está unido a los grifos de agua con presiones entre 40-60 psi. Por el tamaño de tubo de PVC se especifica en este protocolo, aproximadamente 85 gramos de lana lavada y lleno de vidrio se utiliza por tubo. Tara el vacío tubería de PVC en un equilibrio de carga superior y un paquete de lavado de lana de vidrio hasta que la masa aumenta tubo de 85 gramos.
3. Inserte la malla de polipropileno en las tapas de PVC con accesorios masculinos del adaptador de nylon atadas.
4. Aplique cinta de teflón a las partes roscadas de la tubería de PVC.
5. Tapas de rosca de PVC a la página de PVCIPE y la etiqueta de un extremo del filtro del flujo de entrada y el otro extremo de la salida. Esto es importante para la posterior etapa de elución. Lo cual se denomina entrada no importa.
6. Empuje 60 ml de solución salina estéril tamponada de fosfato (pH = 6,8) en el filtro utilizando un catéter con punta de jeringa. El exceso va a salir el extremo opuesto.
7. Envuelva bien termina con Parafilm para evitar fugas. Los filtros pueden ser almacenados hasta por 30 días a 4 ° C.

3. Muestreo

1. Esterilizar tubería utilizada para el muestreo por recirculación o sumergiendo los elementos durante 30 minutos en% NaClO 0,525 (es decir, una solución al 10% de cloro de uso doméstico estándar). Sigue este drenando la solución de hipoclorito y neutralizar con tiosulfato de sodio al 0,05%, fabricado por la adición de 25 ml de un stock de 2% anhidro solución de tiosulfato de sodio a un litro de agua por ósmosis inversa.
2. Para la muestra de agua con un pH superior a 7,5, ajustar el pH entre 6,5 y 7,0 con HCl. Concentración de HCl puede variar desde 0,25M a 1 M. Cuatro litros HCl 0,5 M es generalmente suficiente para dos muestras de 800 litros, dependiendo del pH del ambiente del agua y la capacidad de almacenamiento en búfer. Inyectar HCl durante el muestreo utilizando una bomba peristáltica o venturi (Figura 2). Ajustar la velocidad de la bomba o abertura Venturi para lograr el pH deseado. Medir el pH a la salida de línea de la muestra utilizando un medidor de pH campo.
3. Utilice un filtro previo si se bloquea la lana de vidrio de filtro de agua con alta turbidez. (Las especificaciones para el prefiltro y su alojamiento están en la lista de materiales en línea.) Debido a que los patógenos se puede unir a las partículas atrapadas por el prefiltro debe eluyó junto con el filtro de lana de vidrio (véase más adelante).
4. Ajustar el flujo a entre 2 y 4 litros por minuto. Generalmente, los volúmenes de la muestra son entre 200 y 1.500 litros.
5. Desconecte el filtro de lana de vidrio y guardar en una bolsa de plástico estéril a 4 ° C durante un máximo de 48 horas.

4. Elución

1. Coloque el filtro de lana de vidrio para un anilloreposar con el extremo afluencia muestra apuntando hacia abajo en una botella de polipropileno. Eluir opuesto de la dirección de flujo de la muestra.
2. Empuje 80 ml de extracto de carne de vaca estéril 3% en 0,05 M de glicina con un pH de 9,5 en el filtro.
3. Espere 15 minutos.
4. Empujar otro 80 ml de extracto de carne de vaca estéril 3% en 0,05 M de glicina con un pH de 9,5 en el filtro.
5. Empujar aire a fondo el filtro hasta que la espuma que sale de la entrada del filtro.
6. Ajustar el pH a eluido entre 7,0 y 7,5 con HCl 1 M.
7. Tienda eluato a 4 ° C durante hasta 24 horas o menos -20 ° C durante períodos más largos de tiempo.
8. Eluir el prefiltro si se usa uno. Desatornille la parte superior del cartucho de la vivienda y se vierte toda el agua residual en el interior de la vivienda mientras se mantiene el pre-filtro en su lugar con las manos enguantadas estériles.
9. Quite el filtro previo del cartucho de la vivienda y el deslizamiento en una de 15 "x 6" bolsa zip-lock.
10. Verter 200 ml de extracto de carne de vaca estéril 3% en 0,05 M glicina con un pH de 9,5 en la bolsa y sellar con seguridad con el cierre de cremallera.
11. Invertir la bolsa prefiltro varias veces para asegurar toda la superficie entra en contacto con el extracto de carne.
12. Espere 15 minutos, invirtiendo en ocasiones y el masaje del prefiltro en sacos.
13. Abra el zip-lock. Adherencia de la bolsa alrededor del prefiltro herméticamente para exprimir como extracto de carne tanto como sea posible y tire el prefiltro con estériles manos enguantadas,.
14. Verter el eluato extracto de carne en una botella de polipropileno.
15. Ajustar el pH a eluido entre 7,0 y 7,5 con HCl 1M.
16. Tienda eluato a 4 ° C durante hasta 24 horas o menos -20 ° C durante períodos más largos de tiempo. El eluato prefiltro puede ser analizado por separado para los agentes patógenos o combinado con el filtro de vidrio eluato lana.

5. Los resultados representativos

Patógeno	Nivel de agua de turbidez (NTU) una	Cantidad Sembrado / L b, c, d	Recuperación% ± 1	Número de ensayos independientes
Enterovirus-poliovirus Sabin III	0.5	500	81% ± 11	7
Enterovirus poliovirus Sabin III	0.5	5000	67% ± 12	8
Enterovirus-poliovirus Sabin III	215	500	59% ± 32	7
Enterovirus-poliovirus Sabin III	215	5000	38% ± 22	6
Enterovirus-poliovirus Sabin III	447	500	56% ± 18	8
Enterovirus-poliovirus Sabin III	447	5000	63% ± 37	8
Cryptosporidium parvum	0.5	5	38% ± 14	7
Cryptosporidium parvum	0.5	50	53% ± 19	8
Llorarptosporidium parvum	215	5	40% ± 16	7
Cryptosporidium parvum	215	50	30% ± 6	6
Cryptosporidium parvum	447	5	33% ± 13	8
Cryptosporidium parvum	447	50	28% ± 11	8
Salmonella enterica	0.5	5	29% ± 24	7
Salmonella enterica	0.5	500	56% ± 16	8
Salmonella enterica	215	5	32% ± 24	7
Salmonella enterica	215	500	34% ± 11	6
Salmonella enterica	447	5	34% ± 18	8
Salmonella enterica	447	500	31% ± 24	8

1. Unidades de Turbidez Nefelométrica
2. Los enterovirus se enumeran por qPCR como copias genómicas / L
3. C. parvum por inmunofluorescencia como se enumeran los ooquistes
4. S. enterica dividido por la cultura como formadoras de colonias de unidades

Tabla 1. Vidrio concentración de lana con turbidez del agua y densidades diferentes patógenos.

Patógeno	Localización de la Muestra de agua	Cantidad Granados / L a	Reco% muy
La gripe aviar H5N2	Sundi Lago, Municipio de Anchorage	2500	42,9%
La gripe aviar H5N2	Minto Pisos, Fairbanks North Star Borough	2500	36,7%
La gripe aviar H5N2	Portage Valley, condado de Anchorage	2500	7,8%
La gripe aviar H5N2	Potter Marsh, del condado de Anchorage	2500	41,5%
La gripe aviar H5N2	Willow Lake, Yukon-Koyukuk Municipio	2500	15,5%

1. Medido por qPCR como copias genómicas / L

Tabla 2. La concentración de lana de vidrio de los virus de la gripe aviar, utilizando el agua de cinco sitios en Alaska.

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Figura 1. Diagrama de la lavadora de lana de vidrio. Esto puede ser usado en lugar de un cubo, ahorrando tiempo de aclarado. El concepto es similar a una lavadora pipeta de vidrio.

Figura 2. Vidrio filtración lana con inyección de ácido por la bomba peristáltica. Tenga en cuenta la "T" donde la tubería de la bomba introduce ácido en la línea de muestreo entre el grifo del agua y el filtro de lana de vidrio. el ajuste del pH es necesaria sólo si la muestra de agua tiene un pH> 7,5.

Filtros de lana de vidrio son eficaces en la concentración de agentes patógenos de agua con una amplia gama de niveles de turbidez y densidades de patógenos (Tabla 1). Para probar esta, 20 litros de agua del grifo sin cloro se mezcló con limo seco suelo franco (0, 1,27, o 2,75 g / l) para alcanzar el nivel deseado de turbidez y luego se siembra con densidades diferentes agentes patógenos. El aguase pasó a través de un filtro de lana de vidrio, los patógenos concentrados en el eluato se enumeraron, y este valor era el numerador en el cálculo de recuperación por ciento. La cantidad de agentes patógenos sembradas en el agua, es decir, el denominador del cálculo porcentaje de recuperación, se determinó por primera siembra los patógenos en un eluato negativo, entonces la enumeración de los patógenos. El eluato negativo se preparó haciendo pasar una cabeza de serie 20 litros de muestra a través de un filtro y eluyendo. La cuantificación de los patógenos sembradas en un eluato negativo evita diferencias en la enumeración de patógeno que podría derivarse de diferencias de la matriz creada por el filtro de lana de vidrio. La importancia de esta etapa cuando la cuantificación de los patógenos por qPCR se discute en Lambertini et al. ^3. Una muestra de 20 litros de control negativo se concentró por filtración de lana de vidrio para determinar que no eran patógenos presentes nativo que podrían confundir el cálculo de porcentaje de recuperación. Un 10 micras de tamaño de poro nominal prefiltro wtal como se utiliza cuando el nivel de turbidez fue ≥ 215 NTU.

Poliovirus se cuantificó por PCR cuantitativa en tiempo real utilizando la concentración de secundaria y los procedimientos de extracción de ácidos nucleicos y los cebadores y la sonda se describe en Lambertini et al. ^3. Cryptosporidium parvum se cuantificó en el volumen final de la muestra concentrada (FCSV) creado por el procedimiento de concentración secundaria de los poliovirus . Los ooquistes fueron visualizados por inmunofluorescencia (Cryptosporidium y Giardia MERIFLUOR Kit de detección, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, OH). Salmonella enterica se cuantificó en el FCSV en placas en agar XLD (Remel, Lenexa, KS) y contando con la formación de colonias- unidades.

Filtros de lana de vidrio son eficaces en la concentración de virus de influenza aviar (Tabla 2). Virus de baja patogenicidad de la influenza aviar (H5N2) se sembró en el agua de varias localidades de Alaska y el porcentaje de recuperación calculado como se describe Above. Concentración secundaria y procedimientos de ácidos nucleicos se realizaron como para el poliovirus, el virus se cuantificó por qPCR utilizando los cebadores y sondas descritas en Spackman et al ^4.

Discusión

Filtros de lana de vidrio han sido utilizados por diversos equipos de investigación ^3,5,6 para concentrar virus entéricos humanos a partir de una variedad de fuentes de agua tales como agua potable terminado ^7, el agua subterránea ^8,9, el agua superficial ^{10, 11} de agua de mar, las aguas residuales ^12, y escorrentía agrícola ^13. Aquí mostramos los filtros también son eficaces en la concentración de virus de influenza aviar, así como los agentes p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre de reactivo o elemento	Empresa	Número de catálogo
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	A144-500
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	BP359-212
Tampón fosfato salino Cloruro de sodio Fosfato potásico dibásico- Fosfato potásico monobásico-	Fisher Scientific Fisher Scientific Fisher Scientific	BP358-212 BP363-500 BP362-500
El hipoclorito de sodio, es decir, cloro de uso doméstico	La Compañía Clorox
El tiosulfato de sodio, anhidro	Fisher Scientific	S 475-212
Extracto de carne, desecado	Becton, Dickinson and Company	211520
Glicina	Fisher Scientific	G46-500
Lana de vidrio engrasado sodocalcic O R-11 de fibra de vidrio aislamiento no revestido	Isover ref = "http://www.jm.com" target = "_blank"> Johns Manville	Bourre 725 QN
Malla de polipropileno	Redes Industriales	xN4510
2 "x 4" PVC Sch 80 niple roscado	Grainger	6MW35
2 "cédula 40 de PVC tapa	Grainger	5WDW3
Adaptador macho de nylon (1/2 "x1 / 2")	EE.UU. Plastic Corp.	62178
Recipientes de las muestras de efluente de 1 litro	Fisher Scientific	03 a 313-4F
60 ml jeringa	"Http://www.fishersci.com" target = "_blank"> Fisher Scientific	NC9661991
tiras de pH	Whatman	2614 991
Prefiltro, polipropileno, 10 cartuchos pulgadas, 10 m	McMaster-Carr	4411K75
Prefiltro de vivienda	Cole-Parmer	S-29820-10