집중 Waterborne 바이러스와 농업 Zoonotic 병원균에 대한 유리 양모 필터

요약

유리 양모 필터는 전세계 연구 그룹의 숫자 waterborne 바이러스를 집중하는 데 사용되었습니다. 여기 글라스울 필터를 구축하기위한 간단한 접근 방식을 보여 주며 필터도 waterborne 바이러스성, 세균성 및 protozoan 병원균을 집중 효과입니다 보여줍니다.

초록

의심 오염된 물에 병원체 수준을 평가의 중요한 첫 번째 단계는 농도입니다. 농도 방법은 예를 들어, 샘플링 프로그램이 하나 이상의 병원체 그룹을 대상으로하는 경우 여러 가지 방법이 필요합니다 의미한다 Giardia와 Cryptosporidium ^1에 대한 미국 환경 보호청 방법 1623 특정 병원체 그룹에 대한 구체적인 경향이 있습니다. 현재 방법의 또 다른 단점은 장비 예를 들어, 바이러스에게 ² 집중에 대한 1MDS 카트리지 필터 VIRADEL 방법 복잡하고 비쌀 수있다. 이 문서에서는 waterborne 병원균을 집중을위한 글라스 울 필터를 구성하는 방법에 대해 설명합니다. 필터는 용출 후 원액은 문화적 또는 분자 방법에 의해 병원균 감지 및 열거 다음과 같은 원심 분리와 같은 두 번째 농도 단계, 의무가있다. 필터는 몇 가지 장점이 있습니다. 건설 간단하고 필터를 만들 수 있습니다특정 샘플링 요구 사항을 충족을위한 NY 크기. 필터 부분은 가능한 심하게 프로젝트 예산에 영향을주지 않고 샘플의 다수를 수집하고, 저렴합니다. 대형 샘플 볼륨 (100s 1,000의 패)은 샘플 탁도에서 막힘의 비율에 따라 집중하실 수 있습니다. 필터는 매우 휴대용이며, 펌프 및 유량계 등 최소한의 장비로, 그들은 완성된 식수, 표면 물, 지하수 및 농업 결선을 샘플링을 위해 현장에서 구현할 수 있습니다. 마지막으로, 글라스 울 여과은 하나의 방법이 필요하므로 병원체 종류의 다양한 집중을위한 효과적입니다. 여기 waterborne 인간 enterovirus, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum 및 조류 독감 바이러스를 자세하게 필터 효과에 대한 리포트입니다.

프로토콜

1. 글라스 울 준비

1. 필터의 각 일괄 처리 전에시키고 이후 10 %의 표백제 용액으로 작업 영역을 소독.
2. 장갑과 가운 입어. 최소한 20 분 동안 121 ° C와 15 PSI에 autoclaving하여 양동이를 소독. 멸균 양동이에 유리 양모를 놓습니다.
3. 역삼투 물로 글라스 울을 포화 및 15 분 동안 흠뻑 젖어 보자.
4. 양동이에서 역삼투 물을 배수.
5. 1 M HCL로 글라스 울을 포화 및 15 분 동안 흠뻑 젖어 보자.
6. 양동이에서 1 M HCL 드레인.
7. 역삼투 물로 글라스 울을 씻어.
8. 철저하게 섞는다.
9. 산도 용지를 사용하여 산도를 확인하고 중성 산도가 달성될 때까지 역삼투 물 린스 반복한다.
10. 헹굼 물을 붓고.
11. 1 M NaOH로 글라스 울을 포화 및 15 분 동안 흠뻑 젖어 보자.
12. 양동이에서 1 M NaOH 드레인.
13. R중성 산도가 달성되기 전까지 역삼투 린스 epeat.
14. 헹굼 물을 붓고.
15. 대신 양동이로, 글라스 울 세척기는 디자인 유리 피펫 세척기 (그림 1)과 비슷있는 건설 수 있습니다.
16. 멸균 인산과 완전히 유리 양모를 맡아 식염수 (PBS)는 산도를 6.8로 조정 버퍼.
17. 4에서 준비한 유리 즉시 양털 또는 상점을 사용 ° C. 그것은 최대 2 주 동안 사용자에게 위해 저장할 수 있습니다. 사용하기 전에, 그것이 시간이지나면서 상승하므로 산도 중립한지 확인하십시오. 산도가 중성이 아닌 경우, 멸균 인산과 다시 헹굼 (산도 6.8) 염분 버퍼.

2. 유리 양모 필터 조립

1. 남성 어댑터 나일론 피팅은 대문자로 엉망 수 있도록 PVC 모자와 탭 스레드로 16분의 11 인치 구멍을 드릴 다운합니다. 이 단계는 첫 번째 어셈블리를 위해 꼭 필요한 사항입니다. 이후 마개는 년간 사용하실 수 있습니다. 테플론을 적용나일론 피팅 스레드와 뚜껑의 나사에 테이프.
2. 글라스 울 작은 조각으로 PVC 파이프를 싸. 꽉를 싣고, 자동차 엔진 밸브와 같은 금속 플런저를 사용하십시오. 포장은 큰 힘을 필요로하지 않습니다. 꽉 충분한 글라스 울은 제자리에 유지되도록 싸서 채널을 형성하지 않습니다. 그러나 너무 단단히 물이 필터를 통해 흐를 수를 포장하지 않습니다. 적절하게 포장되면 분당 4-5리터의 유속은 필터가 40-60 PSI 사이의 압력으로 물을 도청에 부착되었을 때 달성해야합니다. 이 프로토콜에 명시된 PVC 파이프의 크기의 경우 약 85g은 씻어과 포장 글라스 울은 파이프마다 사용됩니다. 포장 재료의 중량은 파이프 질량 85 그램 한물간 글라스 울로 최고로드 균형과 팩을에 빈 PVC 파이프 증가 때까지.
3. 첨부 남성 어댑터 나일론 피팅과 PVC 마개로 폴리 프로필렌 메쉬를 삽입합니다.
4. PVC 파이프의 나사 부분에 테플론 테이프를 적용합니다.
5. PVC p로 PVC 모자에 나사IPE 및 레이블 하나의 필터 끝에 유입하고 다른 쪽 끝을 유출. 이것은 용출 단계 나중에 중요하다. 어떤 끝이 유입 상관 없어요 표시됩니다.
6. 멸균 인산의 60 ML은 카테터를 사용하여 필터로 (산도 = 6.8)을 식염수 버퍼 푸시는 주사기 줬지. 초과는 반대 끝이 나올 것이다.
7. 포장은 누수 방지하기 Parafilm과 밀접하게 끝납니다. 필터는 4 ° C.에 30 일 이내에 저장될 수

3. 샘플링

1. 0.525 % NaClO (즉, 일반 가정용 표백제의 10 % 용액)에 30 분간 항목을 순환하거나 immersing하여 샘플링에 사용되는 튜브를 소독. 차아 염소 산염 용액을 배수하여이 작업을 따라 역삼투 물의 일리터에 2 %의 주식 무수 나트륨 thiosulfate 용액의 25 ML을 추가하여 만든 0.05 % 나트륨 thiosulfate로 무력화.
2. 7.5보다 큰 산도와 견본 물의 경우 HCL과 6.5 사이 7.0으로 산도를 조정합니다. HCL 농도 범위는 수 0.25에서한 M. 포 리터에 M 0.5 M HCL은 일반적으로 물이 주변 산도와 버퍼링 용량에 따라 두 800리터 샘플, 충분합니다. 연동 펌프 또는 Venturi을 (그림 2)를 사용하여 샘​​플링 기간 동안 HCL을 주사. 펌프 속도 또는 대상 산도를 달성하기위한 Venturi 개구부를 조정합니다. 필드 산도 측정기를 사용하여 샘​​플 라인 콘센트에서 산도를 측정합니다.
3. 글라스 울 필터 나막신 경우 높은 탁도와 물에서 prefilter을 사용합니다. (prefilter과 주택 사양 자료 목록을 온라인에 있습니다.) 병원균은 그것이 (아래) 유리 양모 필터와 함께 eluted해야 prefilter에 의해 갇힌 입자에 장착할 수 있기 때문에.
4. 둘 사이 4리터 / 분으로 유량을 조정합니다. 일반 샘플 볼륨 200 사이 1천5백리터 있습니다.
5. 최대 48 시간 동안 4 ° C에서 플라스틱 무균 봉투에 유리 양모 필터와 저장소를 분리합니다.

4. 용리

1. 접사 링에 유리 양모 필터샘플 유입 엔드 폴리 프로필렌 병으로 하향 지적과 함께하라. 샘플 흐름의 방향을 반대로 Elute.
2. 필터로 9.5의 산도와 0.05 M 글리신에 무균 3 % 쇠고기 추출물의 80 ML 밀어.
3. 15 분 정도 기다리십시오.
4. 필터로 9.5의 산도와 0.05 M 글리신에 무균 3 % 쇠고기 추출물의 또 다른 80 ML 밀어.
5. 거품이 필터 입구에서 나오는 공기까지 철저한 필터를 누르십시오.
6. 1 M HCL과 7.0 사이 7.5에 eluate의 산도를 조정합니다.
7. 매장 4에 eluate ° C에서 시간의 긴 기간 동안 최대 24 시간까지 또는 -20 ° C에서.
8. 하나를 사용하는 경우 prefilter을 Elute. 나사가 빠지다가 주택 카트리지의 상단과 멸균 장갑 낀 손으로 장소에 prefilter을 누른 상태 하우징 내부에 모두 잔류 물을 부어.
9. 주택 카트리지에서 prefilter를 제거하고 15 "X 6"지퍼 잠금 가방에 그것을 풀.
10. 0.05 M g의 무균 3 % 쇠고기 추출물 200 ML을 부어가방에 9.5의 산도와 지퍼 잠금 장치로 안전하게 도장 lycine.
11. 전체 표면 쇠고기 추출물과 접촉되도록 빌어 prefilter를 여러 번 반전.
12. 15 분 기다려 가끔씩 반전하고 빌어 prefilter을 마사지.
13. 지퍼 잠금 장치를 엽니다. prefilter 주변 그립 가방이 꽉 가능한 한 많은 쇠고기 추출물로 짜낸하고, 멸균 장갑 낀 손으로 prefilter을 당겨합니다.
14. 폴리 프로필렌 병에 쇠고기 추출물의 eluate 하거라.
15. 1M HCL과 7.0 사이 7.5에 eluate의 산도를 조정합니다.
16. 매장 4에 eluate ° C에서 시간의 긴 기간 동안 최대 24 시간까지 또는 -20 ° C에서. prefilter의 eluate는 별도로 병원균에 대한 분석이나 유리 양모 필터 eluate과 결합 할 수 있습니다.

5. 대표 결과

병원체	물의 탁도 수준 (NTU)	금액 시드 / L B, C, D	% 복구 ± 1 SD	숫자 독립 평가판
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III	0.5	500	81% ± 11	7
힘들어바이러스 Poliovirus 세이빈 III	0.5	5000	67% ± 12	8
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III	215	500	59% ± 32	7
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III	215	5000	38% ± 22	6
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III	447	500	56% ± 18	8
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III	447	5000	63% ± 37	8
Cryptosporidium parvum	0.5	5	38% ± 14	7
Cryptosporidium parvum	0.5	50	53% ± 19	8
울어ptosporidium parvum	215	5	40% ± 16	7
Cryptosporidium parvum	215	50	30% ± 6	6
Cryptosporidium parvum	447	5	33% ± 13	8
Cryptosporidium parvum	447	50	28% ± 11	8
살모넬라 enterica	0.5	5	29% ± 24	7
살모넬라 enterica	0.5	500	56% ± 16	8
살모넬라 enterica	215	5	32% ± 24	7
살모넬라 enterica	215	500	34% ± 11	6
살모넬라 enterica	447	5	34% ± 18	8
살모넬라 enterica	447	500	31% ± 24	8

1. Nephelometric 탁도 단위
2. 게놈 사본 / L로 qPCR가 열거 Enteroviruses
3. C. parvum은 oocysts로 immunofluorescence가 열거
4. S. enterica는 식민지 - 성형 단위로 문화가 열거

다양한 수상 turbidities 및 병원균 밀도와 표 1. 유리 양모 농도.

병원체	물 샘플 위치	금액 시드 / L	% Reco 대단히
조류 독감 H5N2	Sundi 호수, 앵커리지 자치구	2500	42.9 %
조류 독감 H5N2	Minto 플래 츠, 페어 뱅크스 노스 스타 자치구	2500	36.7 %
조류 독감 H5N2	운반 밸리, 앵커리지 자치구	2500	7.8 %
조류 독감 H5N2	포터 마쉬, 앵커리지 자치구	2500	41.5 %
조류 독감 H5N2	윌로우 호수, 유콘-Koyukuk의 자치구	2500	15.5 %

1. 게놈 사본 / L로 qPCR로 측정

조류 독감 바이러스의 표 2. 유리 양모 농도는 알래스카에서 다섯 사이트에서 물을 사용합니다.

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그림 1. 글라스 울 와셔의 다이어그램. 이것은 rinsing에서 시간을 절약하는 대신 양동이에 사용될 수있다. 개념은 유리 피펫 세척기와 비슷합니다.

연동 펌프에 의한 산성 주입과 그림 2. 유리 울 여과. 펌프 튜브가 물이 수돗물과 글라스울 필터 사이의 샘플 라인에 산성을 소개하는 "T"커넥터가 있습니다. 샘플 물이 산도에게> 7.5가있는 경우에만 산도 조정이 필요합니다.

유리 양모 필터는 탁도 수준과 병원균 밀도 (표 1) 다양한으로 물로부터 병원균을 집중에 효과적입니다. 이것을 테스트하려면 dechlorinated 수돗물 20리터은 탁도의 원하는 수준을 달성하기위한 건조 미사 롬 토양 (0, 1.27, 또는 2.75 G / L)과 혼합하고 다양한 밀도의 병원균으로 놓는되었다. 물글라스 울 필터 통과되었다 eluate에 집중 병원균은 열거하고,이 값은 퍼센트 복구 계산에서 분자였다되었다. , %의 복구 계산의 분모입니다 물,,에 놓는 병원균의 양을 먼저 다음 병원체를 열거하는 부정적인 eluate로 병원균을 퍼뜨리고에 의해 결정되었다. 부정적인 eluate는 필터를 통해 unseeded 20리터 샘플을 전달하고 eluting에 의해 준비되었다. 부정적인 eluate에 놓는 병원균을 Quantifying 것은 유리 양모 필터에 의해 만들어진 매트릭스의 차이에서 발생할 수있는 병원균 열거의 차이가 발생하지 않습니다. qPCR에 의한 병원균을 quantifying이 단계의 중요성은 Lambertini 외에 설명되어 있습니다. ^3. 20리터 부정적인 컨트롤 샘플 퍼센트 복구 계산을 먹이고 수도 네이티브 병원균의 존재가 없었 결정하는 글라스 울 여과를 통해 집중되었다. 10 μm의 공칭 기공 크기 prefilter w탁도 수준이 ≥ 215 NTU 때 같이 사용됩니다.

Poliovirus은 Lambertini 외에 설명되어. ³ 차 농축 및 핵산 추출 절차 및 primers와 프로브를 사용하여 실시간 qPCR에 의해 계량되었다. Cryptosporidium parvum은 poliovirus를위한 보조 농도 절차에서 만든 최종 농축 시료 부피 (FCSV) 논리적으로 양이되었다 . Oocysts은 immunofluorescence (MeriFluor Cryptosporidium 및 Giardia 탐지 키트, 메리디안 생명 과학 주식 회사, 신시내티, OH)에 의한 시각 있었다. 살모넬라 enterica는 XLD 한천로 도금하여 FCSV 논리적으로 양이 (Remel, Lenexa, KS) 및 집계되었다 식민지 - 성형 - 단위.

유리 양모 필터는 조류 독감 바이러스 (표 2) 집중에 효과적입니다. 낮은 pathogenicity 조류 독감 바이러스 (H5N2)는 알래스카의 여러 위치에서 물에 놓는 및 abov을 설명한대로 %의 복구 계산전자. 차 집중과 핵산 절차 poliovirus 대한으로 수행되었다; 바이러스 Spackman 외에 설명된 primers와 프로브를 사용 qPCR하여 계량되었다 ^4.

토론

유리 양모 필터와 같은 완료 식수 ⁷ 지하수 ^8,9, 표면 물 ^10, 바다 물 ^11, 폐수 ¹² 등 물의 다양한 소스에서 인간 장용 바이러스를 집중 여러 연구 팀으로 ^3,5,6에서 사용하고있다 농업 결선 ^13. 여기 필터는 또한 조류 인플루엔자 바이러스뿐 아니라 세균 및 병원체 protozoan 각각 살모넬라 enterica (serovar Typhimurium)와 Cryptosporidium parvum을 ...

자료

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쇠고기 추출물, desiccated	Becton, 디킨스와 회사	211,520
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기름을 바른 sodocalcic 글라스울 또는 R-11 unfaced 유리 섬유 절연	Isover 심판 = "http://www.jm.com"대상 = "_blank"> 존스 맨빌	Bourre 725 QN
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2 "X4"SCH 80 PVC 스레드 파이프 니플	Grainger	6MW35
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남성 어댑터 나일론 피팅 (1 / 2 "1 개 / 2")	미국 플라스틱 주식 회사	62,178
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