Filtri di lana di vetro per la raccolta virus a base acquosa e agricole agenti patogeni zoonotici

Riepilogo

I filtri di lana di vetro sono stati utilizzati per concentrare i virus acquosa da un certo numero di gruppi di ricerca in tutto il mondo. Qui mostriamo un metodo semplice per la costruzione di filtri di lana di vetro e di dimostrare i filtri sono anche efficaci in concentrazione acquosa virali e patogeni batterici e protozoi.

Abstract

Il primo passo fondamentale per la valutazione dei livelli di agenti patogeni in sospetto di acqua contaminata è la concentrazione. Metodi di concentrazione tendono a essere specifica per un gruppo particolare agente patogeno, per esempio gli Stati Uniti Metodo Environmental Protection Agency 1623 per Giardia e Cryptosporidium ^1, il che significa che più metodi sono necessari se il programma di campionamento di mira più di un gruppo patogeno. Un altro svantaggio dei metodi attuali è l'apparecchiatura può essere complicato e costoso, per esempio il metodo VIRADEL con cartuccia filtrante per concentrare il virus 1MDS ^2. In questo articolo abbiamo descritto come creare filtri in lana di vetro per concentrare gli agenti patogeni a base acquosa. Dopo eluizione filtro, il concentrato è suscettibile ad una fase di seconda concentrazione, come centrifugazione, seguita da patogeno rilevamento e conteggio con metodi culturali o molecolari. I filtri sono diversi vantaggi. La costruzione è semplice ed i filtri possono essere costruiti ad unadimensioni ny per soddisfare le esigenze specifiche di campionamento. Le parti del filtro sono poco costosi, che permettono di raccogliere un gran numero di campioni senza incidere negativamente un bilancio del progetto. Grandi volumi di campione (100s a 1.000 s L) può essere concentrata a seconda del tasso di intasamento di torbidità. I filtri sono facilmente trasportabili e con attrezzatura minima, come una pompa e misuratore di portata, possono essere attuate in campo per il campionamento dell'acqua finito di bere, acque superficiali, sotterranee e scarichi agricoli. Infine, filtrazione lana di vetro è efficace per concentrare una varietà di tipi di patogeni così solo metodo è necessario. Qui riportiamo l'efficacia del filtro di concentrazione acquosa enterovirus umani, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, e il virus dell'influenza aviaria.

Protocollo

1. Preparare la lana di vetro

1. Prima e dopo aver fatto ogni partita di filtri, sterilizzare l'area di lavoro con una soluzione di candeggina al 10%.
2. Indossare guanti e camice. Sterilizzare un secchio in autoclave a 121 ° C e 15 psi per almeno 20 minuti. Posizionare la lana di vetro nel secchio sterile.
3. Saturare la lana di vetro con acqua ad osmosi inversa e lasciare macerare per 15 minuti.
4. Scolare l'acqua ad osmosi inversa dal secchio.
5. Saturare la lana di vetro con 1 M HCl e lasciate macerare per 15 minuti.
6. Scolare la M 1 HCl dal secchio.
7. Lavare la lana di vetro con acqua ad osmosi inversa.
8. Mescolare accuratamente.
9. Controllare il pH utilizzando carta pH e ripetere l'acqua osmosi inversa risciacquo fino a pH neutro si ottiene.
10. Versare l'acqua di risciacquo.
11. Saturare la lana di vetro con 1 M NaOH e si lascia macerare per 15 minuti.
12. Scolare la M 1 NaOH dal secchio.
13. Ripetere l'osmosi inversa risciacquo fino a pH neutro si ottiene.
14. Versare l'acqua di risciacquo.
15. Invece di un secchio, una rondella lana di vetro può essere costruito, che è simile nel disegno ad una rondella pipetta di vetro (Figura 1).
16. Coprire la lana di vetro completamente con fosfato sterile Buffered Saline (PBS) a pH 6,8.
17. Utilizzare la lana di vetro preparata immediatamente o conservare a 4 ° C. Può essere conservato per un massimo di due settimane. Prima dell'uso, assicurarsi che il pH è neutro in quanto aumenterà nel tempo. Se il pH non è neutro, ri-sciacquare con fosfato sterile salina tamponata (pH 6,8).

2. Il montaggio del filtro in lana di vetro

1. Praticare un foro 11/16 di pollice nei tappi in PVC e fili di rubinetto in modo che i maschi raccordi in nylon adattatori possono essere avvitati i tappi. Questo passaggio è necessario solo per la prima assemblea. Successivamente, i tappi possono essere usati per anni. Applicare Teflonnastro per i fili di nylon e raccordi a vite per i tappi.
2. Riporre il tubo in PVC con piccoli pezzi di lana di vetro. Utilizzare uno stantuffo metallico, come una valvola motore di un'auto, per il confezionamento stretto. Imballaggio non richiede grande forza. Confezione abbastanza stretto in modo che la lana di vetro rimane al suo posto e canali non si formano. Tuttavia, non viene imballato in modo così stretto acqua non può passare attraverso il filtro. Quando imballato opportunamente, una portata di 4 a 5 litri al minuto deve essere raggiungibile quando il filtro è fissato a rubinetti con pressioni comprese tra 40-60 psi. Per le dimensioni di tubo in PVC di cui al presente protocollo, circa 85 grammi lavato e lana di vetro imballato è usato per pipe. Tare il tubo vuoto PVC su un top-loading equilibrio e pacco con lana di vetro lavata fino a quando la massa del tubo aumenta 85 grammi.
3. Inserire la rete in polipropilene nei tappi in PVC con raccordi maschio in nylon adattatore collegato.
4. Applicare il nastro di teflon alle parti filettate del tubo in PVC.
5. Avvitare tappi in PVC alla p PVCipe e etichetta un'estremità filtro l'afflusso e l'altra estremità del deflusso. Questo è importante per la successiva fase di eluizione. Che fine viene etichettato afflusso non importa.
6. Spingere 60 mL di soluzione salina tamponata con fosfato sterile (pH = 6.8) nel filtro utilizzando un catetere punta siringa. Eccesso uscirà all'estremità opposta.
7. Wrap termina strettamente con Parafilm per evitare perdite. I filtri possono essere memorizzati fino a 30 giorni a 4 ° C.

3. Campionamento

1. Sterilizzare tubi utilizzati per il campionamento da parte di ricircolo o immergendo gli elementi per 30 minuti in NaClO 0,525% (cioè, una soluzione al 10% di candeggina standard). Segui questa drenando la soluzione di ipoclorito e neutralizzare con tiosolfato di sodio 0,05%, ottenuto aggiungendo 25 mL di una soluzione al 2% di sodio tiosolfato anidro stock di un litro d'acqua ad osmosi inversa.
2. Per esempio l'acqua con un pH maggiore di 7,5, regolare il pH a tra 6,5 ​​e 7,0 con HCl. HCl concentrazione può variare da 0,25M a 1 M. quattro litri 0,5 M HCl è generalmente sufficiente per due campioni di 800 litri, a seconda del pH ambientale dell'acqua e la capacità di buffering. Iniettare HCl durante il campionamento utilizzando una pompa peristaltica o Venturi (Figura 2). Regolare la velocità della pompa o l'apertura Venturi per raggiungere l'obiettivo di pH. Misurare il pH all'uscita linea del campione usando un pH-metro campo.
3. Utilizzare un prefiltro se gli zoccoli in lana di vetro filtro da acqua con elevata torbidità. (Specifiche per il prefiltro e la sua sede sono in linea nell'elenco Materiali.) Poiché patogeni può essere collegato a particelle intrappolate dal prefiltro deve essere eluito con il filtro di lana di vetro (vedi sotto).
4. Regolare il flusso tra 2 e 4 litri al minuto. Volumi di campione tipici sono tra 200 e 1.500 litri.
5. Scollegare il filtro di lana di vetro e riporlo in un sacchetto di plastica sterile a 4 ° C per un massimo di 48 ore.

4. Eluizione

1. Applicare il filtro di lana di vetro ad un anellostand con l'estremità rivolta verso il basso afflusso di campione in una bottiglia di polipropilene. Eluire opposta alla direzione del flusso del campione.
2. Premere 80 ml di estratto di carne sterile 3% in 0,05 M glicina con un pH di 9,5 nel filtro.
3. Attendere 15 minuti.
4. Premere un'altra 80 mL di sterile estratto di carne 3% in 0,05 M glicina con un pH di 9,5 nel filtro.
5. Spingere il filtro d'aria che fino a schiuma fuoriesce dal filtro in ingresso.
6. Regolare il pH dell'eluato a tra 7,0 e 7,5 con 1 M HCl.
7. Eluato Conservare a 4 ° C per un massimo di 24 ore oa -20 ° C per lunghi periodi di tempo.
8. Eluire il prefiltro se viene utilizzato. Svitare la parte superiore della cartuccia fuori sede e versare tutta l'acqua residua all'interno del corpo mentre si tiene il prefiltro in posizione con le mani protette da guanti sterili.
9. Togliere il prefiltro dalla cartuccia dell'alloggiamento e farla scorrere in un 15 "x 6" zip-lock bag.
10. Versare 200 ml di estratto di carne sterile 3% in M ​​0,05 glycine con un pH di 9,5 nel sacco e sigillare saldamente con la zip-lock.
11. Invertire il prefiltro insaccato diverse volte per garantire l'intera superficie viene a contatto con l'estratto di carne.
12. Attendere 15 minuti, a volte invertendo e massaggiando il prefiltro insaccato.
13. Aprire lo zip-lock. Afferrare il sacchetto attorno al prefiltro strettamente a spremere come estratto di carne il più possibile e tirare la prefiltro con guanti sterili,.
14. Versare l'eluato estratto di carne in una bottiglia di polipropilene.
15. Regolare il pH dell'eluato a tra 7,0 e 7,5 con HCl 1M.
16. Eluato Conservare a 4 ° C per un massimo di 24 ore oa -20 ° C per lunghi periodi di tempo. L'eluato prefiltro può essere analizzato separatamente per i patogeni o in combinazione con l'eluato filtro lana di vetro.

5. Risultati rappresentativi

Patogeni	Water Level torbidità (NTU) a	Importo Seeded / L b, c, d	Recupero% ± 1 SD	Trials Numero indipendenti
Enterovirus-Poliovirus Sabin III	0,5	500	81% ± 11	7
Enterovirus-Poliovirus Sabin III	0,5	5000	67 ± 12%	8
Enterovirus-Poliovirus Sabin III	215	500	59% ± 32	7
Enterovirus-Poliovirus Sabin III	215	5000	38% ± 22	6
Enterovirus-Poliovirus Sabin III	447	500	56 ± 18%	8
Enterovirus-Poliovirus Sabin III	447	5000	63% ± 37	8
Cryptosporidium parvum	0,5	5	38 ± 14%	7
Cryptosporidium parvum	0,5	50	53 ± 19%	8
Piangereptosporidium parvum	215	5	40 ± 16%	7
Cryptosporidium parvum	215	50	30% ± 6	6
Cryptosporidium parvum	447	5	33 ± 13%	8
Cryptosporidium parvum	447	50	28% ± 11	8
Salmonella enterica	0,5	5	29% ± 24	7
Salmonella enterica	0,5	500	56 ± 16%	8
Salmonella enterica	215	5	32% ± 24	7
Salmonella enterica	215	500	34% ± 11	6
Salmonella enterica	447	5	34 ± 18%	8
Salmonella enterica	447	500	31% ± 24	8

1. Unità di torbidità nefelometrico
2. Enterovirus enumerate da qPCR come copie genomiche / L
3. C. parvum enumerati mediante immunofluorescenza di oocisti
4. S. enterica enumerati dalla cultura come formanti colonie-unità

Tabella 1. Concentrazione di lana di vetro con la torbidità dell'acqua e densità diversi agenti patogeni.

Patogeni	Campione d'acqua Location	Importo Seeded / L a	Reco% molto
Influenza aviaria H5N2	Sundi Lake, Anchorage Borough	2500	42,9%
Influenza aviaria H5N2	Minto Flats, Fairbanks North Star Borough	2500	36,7%
Influenza aviaria H5N2	Portage Valley, Anchorage Borough	2500	7,8%
Influenza aviaria H5N2	Potter Marsh, Anchorage Borough	2500	41,5%
Influenza aviaria H5N2	Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough	2500	15,5%

1. Misurato da qPCR come copie genomiche / L

Tabella 2. Concentrazione in lana di vetro del virus dell'influenza aviaria utilizzando l'acqua da cinque siti in Alaska.

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Figura 1. Schema di rosetta lana di vetro. Questo può essere usato al posto di un secchio, risparmiando tempo di risciacquo. Il concetto è simile ad una rondella pipetta di vetro.

Figura 2. Lana di vetro di filtrazione con iniezione di acido da pompa peristaltica. Nota: il connettore "T", dove il tubo della pompa acida introduce nella linea di campione tra il rubinetto dell'acqua e la lana di vetro filtro. regolazione del pH è necessaria solo se l'acqua ha un pH campionata> 7,5.

I filtri di lana di vetro sono efficaci agenti patogeni in concentrazione da acqua con una vasta gamma di livelli di torbidità e densità patogeni (Tabella 1). Per verificare ciò, 20 litri di acqua di rubinetto senza cloro è stato mescolato con il terreno limo argilla secca (0, 1,27 o 2,75 g / L) per raggiungere il livello desiderato di torbidità e poi seminati con agenti patogeni a varie densità. L'acquaè stato passato attraverso un filtro lana di vetro, i patogeni concentrati nell'eluato erano enumerate, e questo valore era il numeratore nel calcolo percentuale di recupero. La quantità di agenti patogeni seminati in acqua, che è, il denominatore del calcolo recupero percentuale, è stato determinato prima semina dei patogeni in un eluato negativo di elencare i patogeni. L'eluato negativo è stato preparato facendo passare una seminata campione di 20 litro attraverso un filtro e eluendo. Quantificare gli agenti patogeni seminate in un eluato negativo evita differenze di enumerazione degli agenti patogeni che potrebbero derivare da differenze matrice creata dal filtro di lana di vetro. L'importanza di questo passo, nel quantificare i patogeni di qPCR è discusso in Lambertini et al. ^3. Un campione di 20 litro controllo negativo è stata concentrata mediante filtrazione in lana di vetro per determinare non ci fossero native presenti agenti patogeni che potrebbero confondere il calcolo percentuale di recupero. A 10 um dimensione nominale dei pori prefiltro wcome quando il livello torbidità era ≥ 215 NTU.

Poliovirus è stato quantificato in tempo reale utilizzando la concentrazione qPCR secondario e procedure di estrazione di acidi nucleici e inneschi e le sonde descritte in Lambertini et al. ^3. Cryptosporidium parvum è stato quantificato nel volume finale del campione concentrato (FCSV) creato dalla concentrazione procedura secondaria di poliovirus . Oocisti sono state visualizzate mediante immunofluorescenza (MeriFluor Cryptosporidium e Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, OH). Salmonella enterica è stato quantificato in FCSV da piastrato su agar XLD (Remel, Lenexa, KS) e conteggio delle colonie di formazione- unità.

I filtri di lana di vetro sono efficaci a concentrare virus dell'influenza aviaria (Tabella 2). Virus a bassa patogenicità dell'influenza aviaria (H5N2) è stato seminato in acqua da diverse località in Alaska e la percentuale di recupero calcolato come descritto Above. Concentrazione secondario e procedure di acidi nucleici sono stati eseguiti come per poliovirus, il virus è stato quantificato qPCR utilizzando i primer e sonde descritte in Spackman et al ^4.

Discussione

I filtri di lana di vetro sono stati utilizzati da vari gruppi di ricerca a concentrarsi ^3,5,6 virus enterici umani da una varietà di fonti d'acqua, come acqua potabile finito ^{7, 8,9} acque sotterranee, acque di superficie ^{10, 11} di acqua di mare, acque reflue ^12, e scarichi agricoli ^13. Qui riportiamo i filtri sono efficaci anche a concentrare il virus dell'influenza aviaria così come i patogeni batterici e protozoi Salmonella enterica (sierotipo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente o prodotto	Azienda	Numero di catalogo
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144-500
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	BP359-212
Soluzione tampone fosfato Cloruro di sodio Potassio fosfato bibasico Potassio fosfato monobasico-	Fisher Scientific Fisher Scientific Fisher Scientific	BP358-212 BP363-500 BP362-500
Ipoclorito di sodio per esempio, candeggina	Il Clorox Co.
Tiosolfato di sodio, anidro	Fisher Scientific	S 475-212
Estratto di carne, essiccata	Becton, Dickinson and Company	211520
Glycine	Fisher Scientific	G46-500
Oliato lana di vetro sodocalcic O R-11 isolante in fibra di vetro a vista	Isover ref = target "http://www.jm.com" = "_blank"> Johns Manville	Bourre 725 QN
Mesh in polipropilene	Industrial Netting	xN4510
2 "x4" Sch 80 PVC raccordo tubo filettato	Grainger	6MW35
2 "Sch 40 PVC cap	Grainger	5WDW3
Maschio nylon Raccordo adattatore (1/2 "x1 / 2")	US Plastic Corp.	62178
Bottiglie di esempio per eluato-1 litro	Fisher Scientific	03-313-4F
60 mL siringa	Target "http://www.fishersci.com" = "_blank"> Fisher Scientific	NC9661991
pH strisce	Whatman	2614 991
Prefiltro, polipropilene, cartuccia da 10 pollici, 10 pm	McMaster-Carr	4411K75
Prefiltro custodia	Cole-Parmer	S-29.820-10