Glaswolle-Filter für die Konzentration auf Wasserbasis Viren-und Landwirtschaftsorganisation der Zoonose-Erreger

Zusammenfassung

Glaswolle-Filter wurden verwendet, um auf Wasserbasis Viren durch eine Reihe von Forschergruppen auf der ganzen Welt zu konzentrieren. Hier zeigen wir einen einfachen Ansatz für den Bau von Glaswolle-Filter und demonstrieren die Filter sind auch wirksam bei der Konzentration des wässrigen virale, bakterielle und Protozoen Pathogene.

Zusammenfassung

Der erste wichtige Schritt bei der Bewertung Krankheitserreger im Verdacht verunreinigtes Wasser ist die Konzentration. Konzentration Methoden sind in der Regel spezifisch für einen bestimmten Erreger Gruppe, zum Beispiel US-Umweltbehörde EPA-Methode 1623 für Giardia und Cryptosporidium ^1, die mehrere Methoden benötigt werden, wenn die Probenahme-Programm zielt auf mehr als einem Erreger-Gruppe bedeutet. Ein weiterer Nachteil der derzeitigen Methoden ist die Ausrüstung kann kompliziert und teuer sein, zum Beispiel die VIRADEL-Methode mit dem 1MDS Patronenfilter zum Konzentrieren Viren ^2. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Glaswolle-Filter für die Konzentration auf Wasserbasis Krankheitserreger zu konstruieren. Nach Filterelution, ist das Konzentrat zugänglich einer zweiten Konzentration Schritt, wie Zentrifugation, durch Pathogen Nachweis und zur Zählung von kulturellen oder molekularen Methoden gefolgt. Die Filter haben mehrere Vorteile. Die Konstruktion ist einfach und die Filter kann ein gebaut werdenny Größe für die Erfüllung spezifischer Anforderungen Probenahme. Die Filterteile sind kostengünstig, was es ermöglicht, eine große Anzahl von Proben ohne gravierende Auswirkungen auf ein Projektbudget zu sammeln. Große Volumina (einige 100 bis 1000 s L) können je nach der Höhe des Verstopfens von Probe Trübung konzentriert werden. Die Filter sind sehr portabel und mit minimaler Ausrüstung, wie eine Pumpe und Durchflussmesser, können sie im Bereich für die Probenahme fertigen Trinkwasser, Oberflächenwasser, Grundwasser und landwirtschaftliche Stichwahl durchgeführt werden. Schließlich ist Glaswolle effektive Filtration zum Konzentrieren einer Vielzahl von Erreger-Typen so nur eine Methode erforderlich ist. Hier berichten wir über Filter Wirksamkeit bei der Konzentration des wässrigen menschlichen Enteroviren, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum und Vogelgrippe-Virus.

Protokoll

1. Vorbereiten der Glaswolle

1. Vor und nach der Herstellung jeder Charge von Filtern, sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 10% Bleichmittel.
2. Handschuhe anziehen und Kleid. Sterilisieren Sie einen Eimer durch Autoklavieren bei 121 ° C und 15 psi für mindestens 20 Minuten. Legen Sie die Glaswolle in der sterilen Löffel.
3. Tränken Sie die Glaswolle mit Umkehrosmose-Wasser einweichen lassen und für 15 Minuten.
4. Lassen Sie das Umkehrosmose-Wasser aus dem Eimer.
5. Tränken Sie die Glaswolle mit 1 M HCl und einwirken lassen für 15 Minuten.
6. Lassen Sie das 1 M HCl aus dem Eimer.
7. Spülen Sie die Glaswolle mit Umkehrosmose-Wasser.
8. Gründlich mischen.
9. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Papier und wiederholen Sie die Umkehr-Osmose-Wasser zu spülen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht wird.
10. Abgießen Spülwasser.
11. Tränken Sie die Glaswolle mit 1 M NaOH und einwirken lassen für 15 Minuten.
12. Lassen Sie das 1 M NaOH aus dem Eimer.
13. Riederholen die Umkehrosmose spülen bis ein neutraler pH erreicht wird.
14. Abgießen Spülwasser.
15. Statt einer Schaufel kann eine Glaswolle Scheibe konstruiert werden, was ähnlich im Design einer Glaspipette Scheibe (Abbildung 1).
16. Abdecken Glaswolle vollständig mit steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf pH 6,8 eingestellt.
17. Einsatz vorbereitet Glaswolle sofort oder lagern bei 4 ° C. Es können bis zu zwei Wochen gelagert werden. Vor der Verwendung sicherstellen, dass der pH-neutral ist, da es im Laufe der Zeit steigen wird. Wenn der pH-Wert nicht neutral ist, mit sterilem Phosphat Nachspülen Kochsalzlösung (pH 6,8).

2. Montage des Glaswollefilter

1. Bohren Sie ein 11/16 cm großes Loch in die PVC-Kappen und Leitungswasser Fäden so die männlichen Adapter Nylon Beschläge in die Kappen aufgeschraubt werden kann. Dieser Schritt ist nur für die erste Anordnung erforderlich. Danach kann die Kappen seit Jahren verwendet werden. Bewerben TeflonKlebeband auf den Armaturen Nylon Gewinde und den Kappen.
2. Verpacken Sie das PVC-Rohr mit kleinen Stücken von Glaswolle. Verwenden Sie einen Stempel aus Metall, wie ein Auto Motorventil, zu dichte Packung. Verpackung erfordert keine große Kraft. Packen Sie fest genug, so dass die Glaswolle an seinem Platz bleibt und Kanäle nicht zu bilden. Jedoch nicht so dicht packen kann kein Wasser durch den Filter fließen. Wenn verpackt entsprechend sollte eine Fließgeschwindigkeit von 4 bis 5 Liter pro Minute erreichbar sein, wenn der Filter an Wasserhähne mit Druck zwischen 40-60 psi angebracht. Für die Größe der PVC-Rohr in diesem Protokoll angegeben, gewaschen ca. 85 Gramm verpackt und Glaswolle wird pro Rohr verwendet. Tara die leere PVC-Rohr auf einer Top-Loading-Balance und Pack mit gewaschenen Glaswolle, bis das Rohr Masse 85 Gramm erhöht.
3. Legen Polypropylen-Netz in die PVC-Kappen mit Übergangsnippel Nylon Beleuchtungskörper befestigt sind.
4. Teflonband um die Gewindeabschnitte der PVC-Rohr.
5. Schrauben Sie auf PVC-Kappen auf dem PVC-pIPE-Label und ein Filter Ende der Zufluss und das andere Ende der Abfluss. Dies ist wichtig für die spätere Elutionsschritt. Welches Ende ist beschriftet Zufluss spielt keine Rolle.
6. Push 60 ml steriler Phosphat-gepufferter Saline (pH = 6,8) in den Filter unter Verwendung eines Katheters gekippt Spritze. Überschüssiges herauskommen wird gegenüberliegenden Ende.
7. Wrap Enden fest mit Parafilm zu vermeiden undicht. Filter können bis zu 30 Tage gelagert werden bei 4 ° C

3. Sampling

1. Sterilisieren Schlauch für stichprobenartige Überprüfungen durch Eintauchen oder Umluftbetrieb Artikel für 30 Minuten in 0,525% NaClO (dh eine 10% ige Lösung von Standard Haushaltsbleiche) verwendet. Folgen dies durch Ablassen des Natriumhypochloritlösung und neutralisiert mit 0,05% Natriumthiosulfat, durch Zugabe von 25 ml einer 2% Lager wasserfreiem Natriumthiosulfat-Lösung auf einen Liter Wasser Umkehrosmose.
2. Für die Probe Wasser mit einem pH größer als 7,5, der pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 mit HCl. HCl-Konzentration kann im Bereich von 0,25M bis 1 M Vier Liter 0,5 M HCl ist in der Regel ausreichend für zwei 800-Liter-Proben, je nach Umgebungstemperatur des Wassers pH-Wert und Pufferkapazität. Inject HCI bei der Probenahme mit Hilfe einer Schlauchpumpe oder Venturi (Abbildung 2). Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe oder Venturi-Öffnung, um den Ziel-pH zu erreichen. Der pH am Entnahmeleitung Auslaß über ein Feld pH-Meter.
3. Verwenden Sie einen Vorfilter, wenn die Glaswollefilter Clogs von Wasser mit hoher Trübung. (Spezifikationen für den Vorfilter und sein Gehäuse sind in der Materialliste online.) Da Krankheitserreger können Teilchen, die durch den Vorfilter gefangen befestigt werden es zusammen mit dem Glaswollefilter müssen eluiert werden (siehe unten).
4. Stellen Sie den Durchfluss auf zwischen 2 und 4 Liter / Minute. Typisches Proben Volumen liegen zwischen 200 und 1.500 Liter.
5. Trennen Sie die Glaswolle-Filter und Speicher in einem Kunststoff-sterilen Beutel bei 4 ° C für bis zu 48 Stunden.

4. Elution

1. Bringen Sie den Filter aus Glaswolle mit einem Ringstehen mit der Probe Zufluss Ende nach unten in eine Polypropylen-Flasche. Eluiert entgegengesetzt zur Richtung des Probenstroms.
2. Push 80 ml sterile 3% Fleischextrakt in 0,05 M Glycin mit einem pH von 9,5 in den Filter.
3. Warten Sie 15 Minuten.
4. Push weitere 80 mL sterilem 3% Fleischextrakt in 0,05 M Glycin mit einem pH von 9,5 in den Filter.
5. Schieben Sie den Filter gründlich Luft, bis Schaum kommt aus dem Filtereingang.
6. Passen Sie die Eluat pH-Wert auf zwischen 7,0 und 7,5 mit 1 M HCl.
7. Shop Eluat bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden oder bei -20 ° C für längere Zeiträume.
8. Eluieren den Vorfilter, wenn eine solche verwendet wird. Schrauben Sie die Oberseite des Gehäuses Patrone und gießen Sie überschüssiges Wasser im Inneren des Gehäuses, während Sie den Vorfilter an Ort und Stelle mit sterilen Handschuhen.
9. Entfernen Sie den Vorfilter aus dem Gehäuse Patrone und schieben Sie sie in einen 15 "x 6" Zip-Lock Beutel.
10. Gießen 200 ml sterile 3% Fleischextrakt in 0,05 M glycine mit einem pH von 9,5 in den Beutel und abzudichten fest mit dem Zip-Verschluss.
11. Kehren Sie die Sackware Vorfilter mehrere Male, um sicherzustellen, wird die gesamte Oberfläche in Berührung kommt, mit der Rindfleisch-Extrakt.
12. Warten Sie 15 Minuten, gelegentlich invertierenden und Massieren der Sackware Vorfilter.
13. Öffnen Sie die Zip-Lock. Grip die Tasche um den Vorfilter dicht zu verdrängen, wie viel Rindfleisch-Extrakt wie möglich und ziehen Sie den Vorfilter mit sterilen Handschuhen,.
14. Gießen Sie die Rindfleischextrakt Eluat in einem Polypropylen-Flasche.
15. Stellen Sie die Eluat-Wert zwischen 7,0 und 7,5 mit 1 M HCl.
16. Shop Eluat bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden oder bei -20 ° C für längere Zeiträume. Der Vorfilter Eluat kann separat für Krankheitserreger untersucht werden oder in Kombination mit dem Glaswollefilter Eluat.

5. Repräsentative Ergebnisse

Erreger	Wassertrübung Level (NTU) ein	Erzielte beimpften / L b, c, d	% Wiederfindung ± 1 SD	Anzahl Unabhängige Studien
Enterovirus Poliovirus Sabin-III	0,5	500	81% ± 11	7
EnteroVirus-Poliovirus Sabin III	0,5	5000	67% ± 12	8
Enterovirus Poliovirus Sabin-III	215	500	59% ± 32	7
Enterovirus Poliovirus Sabin-III	215	5000	38% ± 22	6
Enterovirus Poliovirus Sabin-III	447	500	56% ± 18	8
Enterovirus Poliovirus Sabin-III	447	5000	63% ± 37	8
Cryptosporidium parvum	0,5	5	38% ± 14	7
Cryptosporidium parvum	0,5	50	53% ± 19	8
Weinenptosporidium parvum	215	5	40% ± 16	7
Cryptosporidium parvum	215	50	30% ± 6	6
Cryptosporidium parvum	447	5	33% ± 13	8
Cryptosporidium parvum	447	50	28% ± 11	8
Salmonella enterica	0,5	5	29% ± 24	7
Salmonella enterica	0,5	500	56% ± 16	8
Salmonella enterica	215	5	32% ± 24	7
Salmonella enterica	215	500	34% ± 11	6
Salmonella enterica	447	5	34% ± 18	8
Salmonella enterica	447	500	31% ± 24	8

1. Nephelometric Turbidity Unit
2. Enteroviren durch qPCR als genomische Kopien / L aufgezählt
3. C. parvum Oozysten durch Immunfluoreszenz als aufgezählt
4. S. enterica von Kultur als Kolonie-bildenden-Einheiten aufgezählt

Tabelle 1. Glaswolle Konzentration mit variierenden Wasser Trübungen und Erreger Dichten.

Erreger	Wasserprobe Location	Menge Gesetzte / L ein	Reco% sehr
Vogelgrippe H5N2	Sundi Lake, Anchorage Borough	2500	42,9%
Vogelgrippe H5N2	Minto Flats, Fairbanks North Star Borough	2500	36,7%
Vogelgrippe H5N2	Portage Valley, Anchorage Borough	2500	7,8%
Vogelgrippe H5N2	Potter Marsh, Anchorage Borough	2500	41,5%
Vogelgrippe H5N2	Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough	2500	15,5%

1. Gemessen an der qPCR als genomische Kopien / L

Tabelle 2. Glaswolle Konzentration des Vogelgrippevirus mit Wasser aus fünf Standorten in Alaska.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Glaswolle Unterlegscheibe. Das kann statt einem Eimer verwendet werden, das spart Zeit von Spülen. Das Konzept ist ähnlich einer Glaspipette Unterlegscheibe.

Abbildung 2. Glaswolle Filtration mit Säure Injektion durch Schlauchpumpe. Beachten Sie die "T"-Anschluss, wo die Pumpe-Schlauch führt Säure in die Probe Linie zwischen dem Wasserhahn und Glaswolle-Filter. pH-Einstellung ist nur erforderlich, wenn das Wasser abgetastet hat einen pH-Wert> 7,5.

Glaswolle-Filter sind effektiver bei der Konzentration Krankheitserreger aus dem Wasser mit einer breiten Palette von Trübung und Krankheitserreger Ebenen Dichten (Tabelle 1). Um dies zu testen, wurde 20 Liter entchlortes Leitungswasser mit getrocknetem Schlamm Lehmboden (0, 1,27, oder 2,75 g / L), um den gewünschten Grad der Trübung zu erreichen gemischt und dann ausgesät mit Krankheitserregern in verschiedenen Dichten. Das Wasserwurde durch ein Filter geleitet Glaswolle, wurden die konzentrierten Erreger im Eluat aufgezählt, und dieser Wert der Zähler in die Rückbildung in Prozent berechnet. Die Menge der Krankheitserreger in das Wasser, dh der Nenner der Berechnung der Wiederfindungsrate Prozent, ausgesät wurde von der ersten Aussaat der Erreger in eine negative Eluat dann das Aufzählen der Erreger bestimmt. Die negative Eluat wurde durch Durchleiten eines 20-Liter-geimpfte Probe durch einen Filter und Eluieren hergestellt. Die Quantifizierung der Erreger ausgesät in einer negativen Eluat vermeidet Unterschiede in der Erreger-Enumeration, die aus Matrix Unterschiede durch die Glaswolle-Filter erstellt führen könnte. Die Bedeutung dieser Schritt bei der Quantifizierung von Pathogenen qPCR wird in Lambertini et al. ^3. Ein 20-Liter-negativen Kontrollprobe wurde über Glaswolle Filtration zu bestimmen, gab es keine native Krankheitserreger vorhanden, die die prozentuale Ausbeute Berechnung durcheinander bringen könnten konzentriert. A 10 um nominale Porengröße Vorfilter wso verwendet werden, wenn die Trübung Ebene war ≥ 215 NTU.

Poliovirus wurde mittels real-time qPCR mit dem sekundären Konzentrations-und Nukleinsäure-Extraktion Verfahren und Primer und die Sonde in Lambertini et al. ³ quantifiziert. Cryptosporidium parvum wurde in der letzten konzentrierte Probevolumen (FCSV) von der sekundären Konzentration Verfahren für die Poliovirus erstellt quantifiziert . Oozysten wurden visualisiert durch Immunfluoreszenz (MERIFLUOR Cryptosporidium Giardia & Detection Kit, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, OH). Salmonella enterica in der FCSV wurde durch das Ausplattieren auf XLD Agar quantifiziert (Remel, Lenexa, KS) und Zählen Kolonie-bildenden- Einheiten.

Glaswolle-Filter sind effektiver bei der Konzentration des aviären Influenzaviren (Tabelle 2). Geringe Pathogenität Vogelgrippevirus (H5N2) wurde in Wasser von mehreren Standorten in Alaska ausgesät und die prozentuale Ausbeute berechnet wie beschrieben AbovE. Sekundäre Konzentration und Nukleinsäure-Verfahren wie für Poliovirus durchgeführt; das Virus wurde durch qPCR quantifiziert unter Verwendung der Primer und die Sonde bei Spackman et al ⁴ beschrieben.

Diskussion

Glaswolle-Filter wurden von verschiedenen Forscherteams ^3,5,6 benutzt worden, um menschliche enteralen Viren aus einer Vielzahl von Wasser-Quellen wie fertig Trinkwasser ^{7, 8,9} Grundwasser, Oberflächenwasser ^10, Meerwasser ^{11, 12} Abwasser konzentrieren, und ¹³ landwirtschaftliche Stichwahl. Hier berichten wir über die Filter sind auch wirksam bei der Konzentration des Vogelgrippevirus sowie die bakterielle und Protozoen Erreger Salmonella enterica (Serova...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz oder das Element	Firma	Katalog-Nummer
Salzsäure	Fisher Scientific	A144-500
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	BP359-212
Phosphate Buffered Saline Kochsalz Kaliumphosphat-zweibasischen Kaliumphosphat-einbasischen	Fisher Scientific Fisher Scientific Fisher Scientific	BP358-212 BP363-500 BP362-500
Natriumhypochlorit dh Haushaltsbleiche	Die Clorox Co.
Natriumthiosulfat, wasserfrei	Fisher Scientific	S 475-212
Rindfleisch-Extrakt, getrockneter	Becton, Dickinson and Company	211520
Glycine	Fisher Scientific	G46-500
Geölte Sodocalcic Glaswolle Oder R-11 unfaced Glasfaserisolierung	Isover ref = "http://www.jm.com" target = "_blank"> Johns Manville	Bourre 725 QN
Polypropylen-Netz	Industrie-Netting	xN4510
2 "x4" Sch 80 PVC Gewinderohr Nippel	Grainger	6MW35
2 "Sch 40 PVC-Kappe	Grainger	5WDW3
Männlich Adapter Nylon passend (1/2 "x1 / 2")	US Plastic Corp	62178
Flaschen für Eluat-1-Liter-	Fisher Scientific	03 bis 313-4F
60 ml Spritze	"Http://www.fishersci.com" target = "_blank"> Fisher Scientific	NC9661991
pH-Streifen	Whatman	2614 991
Vorfilter, Polypropylen, 10-Zoll-Patrone, 10 um	McMaster-Carr	4411K75
Vorfiltergehäuse	Cole-Parmer	S-29.820-10