צמר זכוכית מסננים וירוסים waterborne ריכוז פתוגנים zoonotic חקלאיים

Summary

צמר זכוכית מסננים שימשו לרכז וירוסים waterborne על ידי מספר קבוצות מחקר ברחבי העולם. כאן אנו מצביעים על גישה פשוטה לבניית צמר זכוכית מסננים ולהפגין המסננים הם גם יעילים ריכוז waterborne ויראליים, גורמי מחלה חיידקיים protozoan.

Abstract

הצעד הראשון מפתח בהערכת רמות פתוגן במים מזוהמים חשד הוא ריכוז. שיטות הריכוז נוטים להיות ספציפית עבור קבוצת פתוגן מסוים, למשל ארה"ב הסוכנות להגנת הסביבה שיטת 1623 עבור Giardia ו Cryptosporidium ^1, כלומר מספר שיטות נדרשים אם תוכנית דגימה מכוונת יותר מקבוצה אחת הפתוגן. עוד חיסרון של השיטות הקיימות הוא הציוד יכול להיות מסובך ויקר, למשל שיטת VIRADEL עם מסנן את מחסנית 1MDS לריכוז וירוסים ^2. במאמר זה נתאר כיצד לבנות צמר זכוכית מסננים לריכוז פתוגנים waterborne. לאחר elution מסנן, תרכיז הוא נוח לשלב ריכוז 2, כגון צנטריפוגה, ואחריו זיהוי ספירה הפתוגן ועל ידי שיטות התרבות או המולקולרית. מסננים את מספר יתרונות. בנייה קלה את המסננים ניתן לבנות עלניו יורק גודל הדגימה בדרישות ספציפיות. החלקים סינון זולים, כך שניתן לאסוף מספר רב של דגימות ללא קשות להשפיע על תקציב הפרויקט. כרכים מדגם גדול (100s של עד 1,000 ל ') יכול להיות מרוכזים בהתאם בשיעור של סתימת מן העכירות המדגם. המסננים הם ניידים מאוד עם ציוד מינימלי, כגון משאבה מד זרימת, הם יכולים להיות מיושם בשטח של הדגימה שתייה המוגמר, מים עיליים, מי תהום, נגר חקלאי ו. לבסוף, צמר זכוכית סינון יעיל לרכז מגוון סוגי פתוגן זאת רק שיטה אחת היא הצורך. כאן אנו מדווחים על יעילות הסינון ריכוז enterovirus האדם waterborne, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, וירוס שפעת העופות.

Protocol

1. הכנת צמר זכוכית

1. לפני ואחרי ביצוע כל אצווה של מסננים, לחטא את אזור העבודה עם פתרון אקונומיקה 10%.
2. לבש כפפות חלוק. לעקר דלי ידי מעוקר ב 121 מעלות C ו-PSI 15 לפחות 20 דקות. מניחים את צמר זכוכית דלי סטרילי.
3. להרוות את צמר זכוכית עם מים אוסמוזה הפוכה ולתת לספוג במשך 15 דקות.
4. מסננים את המים אוסמוזה הפוכה מן הדלי.
5. להרוות את צמר זכוכית עם 1 M HCl ולתת להשרות למשך 15 דקות.
6. מסננים את 1 M HCl מדלי.
7. שוטפים את צמר זכוכית עם מים אוסמוזה הפוכה.
8. מערבבים היטב.
9. בדוק את ה-pH בעזרת נייר pH וחזור מים אוסמוזה הפוכה לשטוף עד pH נייטרלי מושגת.
10. יוצקים את המים ולשטוף.
11. להרוות את צמר זכוכית עם 1 M NaOH ולתת להשרות למשך 15 דקות.
12. מסננים את 1 M NaOH מדלי.
13. REPEAT אוסמוזה הפוכה לשטוף עד pH נייטרלי מושגת.
14. יוצקים את המים ולשטוף.
15. במקום דלי, מכונת צמר זכוכית ניתן לבנות, אשר דומה בעיצוב ל מכונת כביסה כוס פיפטה (איור 1).
16. כיסוי צמר זכוכית סטרילית לחלוטין עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) מותאם pH 6.8.
17. שימוש בצמר זכוכית מוכן מיד או בחנות ב 4 ° C. זה ניתן לאחסן עד שבועיים. לפני השימוש, יש לוודא pH נייטרלי כפי שהוא יעלה עם הזמן. אם ה-pH אינו נייטרלי, מחדש לשטוף עם פוספט סטרילית שנאגרו מלוחים (pH 6.8).

2. הרכבת מסנן צמר זכוכית

1. לקדוח חור 11/16 סנטימטר לתוך כמוסות PVC, חוטים ברז כך ניילון אביזרי גברים מתאם יכול להיות מוברג לתוך כמוסות את. צעד זה נחוץ רק להרכבה 1. לאחר מכן, כובעים יכולים לשמש במשך שנים. החל טפלוןקלטת את הנושאים אביזרי ניילון ולדפוק את כובעי.
2. ארוז את צינור PVC עם חתיכות קטנות של צמר זכוכית. השתמש הבוכנה מתכת, כמו שסתום מנוע של מכונית, לארוז חזק. האריזה אינה דורשת כוח רב. לארוז חזק מספיק כדי צמר זכוכית נשאר במקום וערוצי לא יוצרים. עם זאת, לא לארוז כל כך חזק המים לא יכולים לזרום דרך פילטר. כאשר ארוז כראוי, קצב הזרימה של 4 עד 5 ליטר לדקה צריך להיות בר השגה, כאשר המסנן מחובר ברזי מים עם לחצים בין 40-60 psi. עבור גודל של צינור PVC צוין בפרוטוקול זה, כ 85 גרם שטף צמר זכוכית ארז משמש לכל צינור. טרה צינור ריק PVC על איזון העליונה הטעינה ואת חבילת צמר זכוכית עם שטף עד המסה מקטרת מגדיל 85 גרם.
3. הכנס רשת פוליפרופילן לתוך כמוסות PVC עם גברים ניילון אביזרי מתאם המצורפת.
4. החל סרט טפלון לחלקים הליכי של צינור PVC.
5. לדפוק על כמוסות PVC כדי עמ 'PVCIPE ואחד תווית סוף מסנן יבוא, ואת הקצה השני יצוא. זה חשוב לשלב מאוחר יותר elution. איזה סוף מתויג יבוא לא משנה.
6. לדחוף 60 מ"ל של פוספט סטרילית שנאגרו מלוחים (pH = 6.8) לתוך מסנן באמצעות קטטר היטה המזרק. עודף ייצא בסוף ההפוך.
7. גלישת מסתיים באופן הדוק עם Parafilm כדי למנוע דליפה. מסננים ניתן לאחסן עד 30 יום ב 4 ° C.

3. דגימה

1. לעקר צינור המשמש הדגימה על ידי הסירקולציה המחודשת או לטבול פריטים עבור 30 דקות של 0.525% NaClO (כלומר, פתרון של 10% אקונומיקה בית רגיל). בצע זאת על ידי ייבוש פתרון hypochlorite ולנטרל עם thiosulfate נתרן 0.05%, על ידי הוספת 25 מ"ל של המניה 2% נטול מים פתרון thiosulfate נתרן ליטר אחד של מים אוסמוזה הפוכה.
2. מים עם pH מדגם גדול מ 7.5, להתאים את ה-pH על בין 6.5 ו 7.0 עם HCl. ריכוז HCl יכול לנוע בין 0.25M ל 1 יג ארבעה ליטר 0.5 מ 'HCl הוא בדרך כלל מספיק עבור שני מדגמים 800 ליטר, תלוי pH הסביבה של מים קיבולת חציצה. להזריק HCl במהלך הדגימה באמצעות משאבת peristaltic או ונטורי (איור 2). להתאים את מהירות המשאבה או פתיחת ונטורי כדי להשיג את ה-pH היעד. למדוד את ה-pH בנקודת היציאה מדגם הקו באמצעות מד pH בתחום.
3. השתמש prefilter אם צמר זכוכית כפכפים לסנן מהמים עם עכירות גבוהה. (מפרט prefilter והשיכון שלו נמצאים באינטרנט חומרים הרשימה.) כי גורמי מחלה יכולים להיות מחוברים על ידי חלקיקים לכודים prefilter יש eluted יחד עם מסנן צמר זכוכית (ראה להלן).
4. להתאים את קצב הזרימה בין 2 ל 4 ליטר / דקה. כרכים מדגם אופייניים הם בין 200 ל 1500 ליטר.
5. נתק את צמר זכוכית המסנן חנות בתוך שקית פלסטיק סטרילית ב 4 ° C עד 48 שעות.

4. Elution

1. להדביק צמר זכוכית מסנן הטבעתלעמוד עם סוף יבוא המדגם מצביע כלפי מטה לתוך בקבוק פוליפרופילן. Elute הפוך כיוון הזרימה המדגם.
2. לדחוף 80 מ"ל של תמצית בשר בקר סטרילית של 3% מ 0.05 גליצין עם PH של 9.5 לתוך מסנן.
3. חכו 15 דקות.
4. לדחוף עוד 80 מ"ל של תמצית בשר בקר סטרילית של 3% מ 0.05 גליצין עם PH של 9.5 לתוך מסנן.
5. לדחוף יסודית האוויר המסנן עד קצף יוצא של כניסת המסנן.
6. להתאים את ה-pH בין 7.0 ל eluate ו 7.5 עם 1 M HCl.
7. חנות eluate ב 4 ° C עד 24 שעות או ב -20 מעלות צלזיוס במשך תקופות זמן ארוכות יותר.
8. Elute prefilter אם נעשה שימוש. להתיר את החלק העליון של מחסנית הדיור לשפוך את כל המים שיורי בתוך הדיור תוך החזקת prefilter במקום בידיים עטויות כפפות סטריליות.
9. הסר את prefilter מהמחסנית הדיור ומכניס אותו 15 "x 6" לשקית חסינת.
10. יוצקים 200 מ"ל של תמצית סטרילית בשר בקר 3% ב 0.05 מ 'זlycine עם pH של 9.5 לשקית ולאטום היטב עם מנעול-zip.
11. הפוך prefilter בשקית מספר פעמים על מנת להבטיח את פני השטח כולו בא במגע עם תמצית בשר בקר.
12. חכו 15 דקות, היפוך מדי פעם מעסה prefilter בשקית.
13. פתח את בעלת רוכסן. גריפ שקית סביב prefilter בחוזקה לסחוט כמו תמצית בשר כמה שיותר ולמשוך את prefilter בידיים עטויות כפפות סטריליות.
14. יוצקים את eluate תמצית בשר לתוך בקבוק פוליפרופילן.
15. להתאים את ה-pH בין 7.0 ל eluate ו -7.5 עם 1M HCl.
16. חנות eluate ב 4 ° C עד 24 שעות או ב -20 מעלות צלזיוס במשך תקופות זמן ארוכות יותר. Eluate prefilter ניתן לנתח בנפרד או בשילוב עם פתוגנים eluate צמר זכוכית המסנן.

5. נציג תוצאות

הפתוגן	עכירות המים רמות (NTU)	Seeded / L כמות B, C, D	שחזור% ± SD 1	מספר ניסויים בלתי תלויים
Enterovirus-poliovirus סבין III	0.5	500	81% ± 11	7
Enteroוירוסים poliovirus סבין III	0.5	5000	67% ± 12	8
Enterovirus-poliovirus סבין III	215	500	59% ± 32	7
Enterovirus-poliovirus סבין III	215	5000	38% ± 22	6
Enterovirus-poliovirus סבין III	447	500	56% ± 18	8
Enterovirus-poliovirus סבין III	447	5000	63% ± 37	8
Cryptosporidium parvum	0.5	5	38% ± 14	7
Cryptosporidium parvum	0.5	50	53% ± 19	8
לבכותptosporidium parvum	215	5	40% ± 16	7
Cryptosporidium parvum	215	50	30% ± 6	6
Cryptosporidium parvum	447	5	33% ± 13	8
Cryptosporidium parvum	447	50	28% ± 11	8
סלמונלה enterica	0.5	5	29% ± 24	7
סלמונלה enterica	0.5	500	56% ± 16	8
סלמונלה enterica	215	5	32% ± 24	7
סלמונלה enterica	215	500	34% ± 11	6
סלמונלה enterica	447	5	34% ± 18	8
סלמונלה enterica	447	500	31% ± 24	8

1. עכירות Nephelometric היחידה
2. Enteroviruses המנויים ידי QPCR כמו עותקים הגנומי / ל '
3. ג parvum מנה ידי immunofluorescence כמו שביצים
4. ס enterica מנה התרבות כמושבה יוצרי יחידות

1. שולחן זכוכית עם צמר ריכוז turbidities מים שונים וצפיפות הפתוגן.

הפתוגן	דגימת מים מיקום	סכום seeded / ל '	% Reco מאוד
שפעת העופות H5N2	Sundi אגם, Anchorage בורו	2500	42.9%
שפעת העופות H5N2	מינטו דירות, פיירבנקס כוכב הצפון בורו	2500	36.7%
שפעת העופות H5N2	Portage Valley, Anchorage בורו	2500	7.8%
שפעת העופות H5N2	פוטר מארש, Anchorage בורו	2500	41.5%
שפעת העופות H5N2	אגם ערבה, יוקון, Koyukuk בורו	2500	15.5%

1. כפי שהיא נמדדת על ידי QPCR עותקים הגנומי / ל '

2. לוח זכוכית צמר ריכוז של וירוס שפעת העופות באמצעות מים חמישה אתרים באלסקה.

les/ftp_upload/3930/3930fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
באיור 1. תרשים של מכונת צמר זכוכית. זה יכול לשמש במקום בדלי, תוך חיסכון בזמן מן השטיפה. הרעיון דומה מכונת כביסה פיפטה מזכוכית.

איור 2. צמר זכוכית סינון עם הזרקת חומצה על ידי משאבת peristaltic. שים לב "T" שם המחבר מציג את צינורות משאבת החומצה לתוך קו מדגם בין ברז מים וצמר פילטר זכוכית. התאמת ה-pH יש צורך רק אם המים שנדגמו יש pH> 7.5.

צמר זכוכית מסננים יעילים ריכוז פתוגנים מן המים עם מגוון רחב של רמות עכירות וצפיפות פתוגן (טבלה 1). כדי לבחון זאת, 20 ליטר מי ברז dechlorinated היה מעורב באדמה יבשים טין טין (0, 1.27, או 2.75 גר '/ ל') כדי להשיג את הרמה הרצויה של עכירות ואז זרע עם פתוגנים בצפיפויות שונות. מיםעבר דרך פילטר צמר זכוכית, פתוגנים את מרוכזות eluate פורטו, וערך זה המונה בחישוב התאוששות אחוזים. כמות של פתוגנים שנזרעו למים, כלומר, את המכנה של חישוב אחוזים התאוששות, נקבע על ידי 1 הזרעת פתוגנים אל eluate שלילית ואז ספירת פתוגנים. Eluate שלילית הוכן על ידי העברת דגימת unseeded 20 ליטר דרך פילטר ואת משחררי. לכימות פתוגנים שנזרעו ב eluate שלילית נמנע הבדלים ספירה הפתוגן העלולות להיגרם כתוצאה מהפרשי מטריקס שנוצרו על ידי מסנן צמר זכוכית. חשיבותו של שלב זה, כאשר לכימות פתוגנים על ידי QPCR נדון Lambertini et al. ^3. 20 פקד ליטר מדגם שלילית התרכזה באמצעות סינון צמר זכוכית, כדי לקבוע שלא היו נוכחים פתוגנים יליד שיכול לבלבל את החישוב התאוששות אחוזים. 10 מיקרומטר הנומינלי גודל הנקבוביות prefilter Wמשמש כאשר רמת העכירות היה ≥ 215 NTU.

Poliovirus היה לכמת ידי QPCR בזמן אמת באמצעות ריכוז משני גרעין מיצוי הליכים חומצה primers ו החללית המתואר Lambertini et al. ^3. Cryptosporidium parvum היה לכמת בהיקף המדגם הסופי מרוכזת (FCSV) שנוצר על ידי תהליך ריכוז משני poliovirus . שביצים היו דמיינו ידי immunofluorescence (MeriFluor Cryptosporidium & Giardia איתור קיט, מרידיאן מדעי החיים, Inc, Cincinnati, OH). סלמונלה enterica היה לכמת ב FCSV ידי ציפוי על אגר XLD (Remel, Lenexa, KS) ועוד היד נטויה המושבה יוצרי- יחידות.

צמר זכוכית מסננים יעילים ריכוז נגיפי שפעת העופות (טבלה 2). פתוגניות נמוכה שפעת העופות הנגיף (H5N2) היה זרע לתוך המים ממקומות שונים באלסקה התאוששות אחוז מחושב כמתואר abovה. ריכוז משני הליכים חומצות גרעין בוצעו באשר שנגיף הפוליו, נגיף היה לכמת ידי QPCR באמצעות primers ו בדיקה המתוארים Spackman ואח' ^4.

Discussion

צמר זכוכית מסנני כבר בשימוש על ידי צוותי מחקר מספר ^3,5,6 להתרכז וירוסים אנטרי אדם ממגוון רחב של מקורות המים כגון מי שתייה סיים ^{7, 8,9} מי תהום, מים עיליים ^10, מי ים ^11, שפכים ^12, ו נגר חקלאי ^13. כאן אנו מדווחים על המסננים הם גם יעילים ריכוז נגיף ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב או פריט	חברה	מספר קטלוגי
מימן כלורי	פישר סיינטיפיק	A144-500
נתרן הידרוקסידי	פישר סיינטיפיק	BP359-212
פוספט שנאגרו מלוחים נתרן כלורי אשלגן פוספט dibasic אשלגן פוספט monobasic	פישר סיינטיפיק פישר סיינטיפיק פישר סיינטיפיק	BP358-212 BP363-500 BP362-500
Hypochlorite נתרן כלומר, אקונומיקה משק הבית	Clorox ושות
Thiosulfate נתרן, נטול מים	פישר סיינטיפיק	S 475-212
תמצית בשר בקר מיובש	בקטון, דיקינסון החברה	211520
גליצין	פישר סיינטיפיק	G46-500
משומנת כוסית sodocalcic צמר או R-11 בידוד פיברגלס unfaced	Isover ref = "http://www.jm.com" target = "_blank"> Johns Manville	Bourre 725 qn
רשת פוליפרופילן	התעשייה בנוטינג	xN4510
2 "x4" Sch 80 PVC הפטמה צינור מושחל	Grainger	6MW35
2 "Sch 40 PVC מכסה	Grainger	5WDW3
מתאם זכר ניילון הולם (1/2 "X1 / 2")	ארה"ב פלסטיק קורפ	62178
לדוגמה בקבוקים של ליטר 1-eluate	פישר סיינטיפיק	03-313-4F
60 מ"ל במזרק	"Http://www.fishersci.com" target = "_blank"> פישר סיינטיפיק	NC9661991
ה-pH רצועות	Whatman	2614 991
Prefilter, פוליפרופילן, 10 מחסנית אינץ', 10 מיקרומטר	מקמאסטר-קאר	4411K75
Prefilter הדיור	קולמן בן הזוג	S-29820-10