La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Resumen

Un fluorescencia In situ (FISH) método fue desarrollado para detectar visualmente ARN genómico del virus utilizando microscopía de fluorescencia. Una sonda se hace con especificidad para el ARN viral que luego pueden ser identificados utilizando una combinación de hibridación y técnicas de inmunofluorescencia. Esta técnica ofrece la ventaja de identificar la localización del ARN viral o ADN en estado estacionario, el suministro de información sobre el control de eventos intracelulares de virus trata de personas.

Resumen

Los virus que infectan a las células provocan cambios específicos en las funciones celulares normales que sirven para desviar la energía y los recursos para la replicación viral. Muchos aspectos de la función de la célula huésped se comandado por virus, por lo general por la expresión de productos génicos virales que reclutan proteínas de la célula huésped y maquinarias. Por otra parte, los virus orgánulos de membrana específicos de ingeniería o una etiqueta en que las vesículas celulares y las proteínas motoras para apuntar las regiones de la célula (durante la infección de novo, virus cooptar las proteínas motoras moleculares para atacar el núcleo, más tarde, durante el ensamblaje del virus, se secuestran celulares mecanismos que ayuden en el montaje de los virus). Menos aún se entiende sobre cómo los virus, en particular los que tienen genomas de ARN, coordinar el tráfico intracelular de proteínas y componentes de ARN y cómo lograr el montaje de partículas infecciosas en loci específicos en la célula. El estudio de la localización del ARN se inició en el trabajo anterior. El desarrollo de bajos em eucariotasbryos y las células neuronales proporcionan información biológica importante, y también subrayó la importancia de la localización del ARN en la programación de las cascadas de expresión génica. El estudio en otros organismos y sistemas celulares ha generado información importante similar. Los virus son parásitos obligados y deben utilizar sus células huésped para replicarse. Así, es crítico para comprender cómo los virus de ARN dirigir sus genomas de ARN a partir del núcleo, a través del poro nuclear, a través del citoplasma y en uno de sus destinos finales, en partículas de virus progenie ^1.

FISH sirve como una herramienta útil para identificar los cambios en el estado de equilibrio de localización del ARN viral. Cuando se combina con inmunofluorescencia (IF) el análisis de ^{22 de} FISH / si los compañeros de análisis proporcionará información sobre la co-localización de las proteínas con el ARN viral ^3. Este análisis proporciona por tanto un buen punto de partida para poner a prueba para las interacciones proteína-ARN por bioquímicos o biofísicos^4,5, ya que las pruebas de co-localización por sí sola no es suficiente evidencia para estar seguro de una interacción. En el estudio de localización del ARN viral utilizando un método como este, abundante información ha sido obtenida en los dos eventos de tráfico de ARN virales y celulares ^6. Por ejemplo, el VIH-1 produce ARN en el núcleo de las células infectadas pero el ARN se traduce sólo en el citoplasma. Cuando una proteína viral clave falta (Ap) ^7, FISH del ARN viral, ha revelado que el bloque de la replicación viral se debe a la retención de los VIH-1 RNA genómico en el núcleo ^8.

A continuación, presentamos el método para el análisis visual de ARN genómico del virus in situ. El método hace uso de una sonda marcada con ARN. Esta sonda está diseñado para ser complementario al ARN genómico viral. Durante la síntesis in vitro de la sonda de ARN antisentido, la ribonucleótido que se modifica con digoxigenina (DIG) está incluido en un in vitro transcription reacción. Una vez que la sonda ha hibridado con el objetivo de ARNm en las células, las etapas subsiguientes de etiquetado de anticuerpos (Figura 1) revelará la localización del mRNA, así como proteínas de interés cuando se realiza PESCADO / SI.

Protocolo

1. Preparación de la sonda

1. Compendio 1 ug del vector en la transcripción in vitro, pKS (+) pol 236nt ⁹ con Kpn1 enzima a 37 ° C durante 1 hora y ejecutar el producto de ADN linealizado en un gel de agarosa. El fragmento debe ser de aproximadamente 2500 pb.
2. Cortar el fragmento del gel y se purifica mediante la Roche Micro Eluir kit de extracción de gel (todos los reactivos utilizados se enumeran en la Tabla 1). Lleve a cabo la elución final en 30 l de tampón de elución. Ejecutar 5 l del producto en un gel de agarosa para comprobar la purificación.
3. Mezcle una reacción de transcripción in vitro (ver receta a continuación) utilizando la Roche DIG RNA kit de etiquetado y se incuba a 37 ° C durante 2 horas.

En la reacción de transcripción in vitro:

Linealizado ADN	23 l
1X DIG RNA etiquetado mezcla (Roche)	4 l
1X Transcription tampón	8 l
20U RNasa OUT	1 l
80U T7 ARN polimerasa	4 l
Total	40 l

4. Añadir 228 U de DNasa I y se incuba a 37 ° C durante 15 min.
5. Se detiene la reacción por adición de EDTA pH 8,0 a una concentración final de 20 mM.
6. Purificar la reacción mediante el uso de las columnas vuelta rápida de Roche como se especifica por el fabricante.
7. Purificar la sonda por precipitación con tratada con DEPC 1/10 volúmenes de pH 3M de NaOAc 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol helado 95%. Mezclar e incubar a -80 ° C durante 30 min a una noche.
8. Centrifugar la sonda durante 15 min a 4 ° C a 15.000 x g.
9. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado en etanol helado al 70%. Se centrifuga de nuevo durante 5 min a 4 ° C a 15.000 x g.
10. Eliminar el sobrenadante y secar el precipitado. Resuspender el precipitado en 50 ul water (DNasa / RNasa libre) que contiene 10 U RNasa Invitrogen OUT.
11. Calcular la concentración de la sonda por espectrofotometría (ARN miden a 260 nm), y se diluye hasta una concentración de ng / l 5. Almacenar en alícuotas a -20 ° C para uso a corto plazo, o de -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Se recomienda llevar a cabo las comparaciones inter-ensayo para la conservación de una parte alícuota de este.

2. La fijación de la célula

1. Es importante inicialmente a las células adherentes de semillas sin tratar, sobre cubreobjetos de vidrio estériles para la confluencia final sobre la cosecha es de aproximadamente 70-80%. Para las células no adherentes, crecen de forma normal y cuando esté listo para recoger, los incuban con cubreobjetos que han sido tratados con w / v 0,01% de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Inc.) durante 1 hora. Para un típico 12-así placa de poliestireno de cultivo de tejidos (3,8 cm ^2), 150.000 células HeLa (por ejemplo) se sembraron en placas a 24 horas antes de la transfección. Las células no adherentes pueden ser infectadas o transfectadas como es habitual y se dejó anuncioaquí para cubreobjetos de vidrio antes de la fijación ^3.
2. Desechar los medios de comunicación y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato 1X preparada en agua doblemente destilada (DPBS) durante 1 min. Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-tratado 1X PBS también se pueden utilizar, sin embargo no tratada PBS no puede ya que puede contener enzimas RNasa.
3. Descartar el PBS y añadir un 4% de paraformaldehído, suficiente para cubrir completamente las células. Incubar durante 15-20 min.
4. Deseche el paraformaldeyhyde y lavar las células con 1X DPBS durante 1 min.
5. Desechar los DPBS y añadir 0,1 M glicina (disuelto en 1X DPBS). Incubar durante 10 min.
6. Deseche la glicina y lavar las células con 1X DPBS durante 1 min.
7. Deseche los DPBS y añadir 0,2% de Triton-X (disuelto en 1X DPBS). Incubar durante 5-10 minutos. Si la tinción de proteínas de la envoltura nucleolares o nuclear, permeabilizar con Triton X-100 por no más de 5 min o la localización de la proteína se convertirá difusa.
8. Desechar Triton X-100 y se lava una vez en1X DPBS durante 1 min.
9. Para almacenamiento a largo plazo, sustituir PBS con 70% de etanol y se almacena a 4 ° C durante un máximo de cuatro meses. Por otra parte, se lava una vez más con 1X DPBS y proceder a pescar.

3. Hibridación in situ fluorescente (FISH)

1. Si los cubreobjetos fueron almacenadas en etanol, sustituir el etanol con 1X DPBS y permitir que las células para rehidratar durante 30 min. La rehidratación se puede hacer durante la noche si los cubreobjetos se almacenan a 4 ° C.
2. Lavar los cubres con 1x DPBS durante 1 min.
3. Prepare las diapositivas para la incubación de los cubreobjetos, teniendo cuidado de limpiar y marcar bien.
4. Para un cubreobjetos de 18 mm, se añaden 50 l de solución de DNasa (25 unidades cubreobjetos, comercialmente disponibles) a la diapositiva. Añadir el cubreobjetos, asegurándose de poner de lado las células hacia abajo, y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
5. Lavar los cubres con 1x DPBS durante 1 min.
6. Añadir 50 l de mezcla de hibridación (ver receta a continuación) por cubreobjetos enun portaobjetos y se incuba el lado de células cubreobjetos fuera de servicio por 16-18 horas a 42 ° C. La incubación se debe realizar en una bandeja que contiene un 50% formamida, 2X SSPE mezcla (12,5 ml de formamida desionizada, 2,5 ml de 20X SSPE, 10 ml de agua).

Mezcla de hibridación (para un cubreobjetos, 50 l):

Cantidad de material	El material (a una concentración final)
25 l	Formamida,% 50 (desionizada; cualquier fuente)
5 l (de 10 mg / ml)	ARNt, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc.)
5 l (de 20X)	SSPE, 2X
5 l (de 50X)	Denharts, 5X
0,125 l (de 5 unidades)	RNasa OUT
5 l (25 ng de 5 ng / l)	Sonda
5 l	H 2 O DEPC, a la finalvolumen de 50 l

7. Incubar cubreobjetos lado de células en 50 l de formamida al 50% (diluida en 1X DPBS) durante 15 min a 42 ° C.
8. Lavar dos veces los cubreobjetos en 2X SSPE, mediante su incubación lado celda hacia abajo en 50 l SSPE 2X (20X SSPE diluida en 1X DPBS) durante 5 minutos cada uno a 42 ° C.
9. Lavar los cubreobjetos en 1X DPBS durante 1 min.

4. La tinción de inmunofluorescencia

1. Bloque los cubreobjetos colocándolos lado de células en 50 l solución 1X Roche bloqueo (10X solución Roche bloqueo diluida en 1X DPBS) durante 30 min.
2. Incubar el lado de células cubreobjetos en 50 l solución anticuerpo primario durante 1 hora a 37 ° C. Anti-DIG anticuerpos debe diluirse de acuerdo a la dirección del fabricante en 1X solución de bloqueo. Si otros anticuerpos se utilizan para teñir las proteínas, se pueden añadir a la concentración correcta siempre que todos los anticuerpos utilizados se derivan de especificación host diferenteIES.
3. Lavar los cubreobjetos durante 10 minutos en 1X DPBS.
4. Incubar el lado de células cubreobjetos en 50 l solución anticuerpo secundario durante 1 hora a 37 ° C. Alexa Fluor-anticuerpos conjugados (Invitrogen) se puede utilizar para generar una gama de colores y se utilizan en 1:500 en 1X solución de bloqueo, DPBS 1X.
5. Lavar los cubreobjetos dos veces durante 10 minutos cada uno en DPBS 1X.
6. Seque el lado de la célula cubreobjetos en papel Whatman. Asegúrese de cubrir los cubreobjetos para evitar la exposición a la luz y la decoloración.
7. Una vez que todo el líquido se evapora, montar los cubreobjetos sobre portaobjetos utilizando frescos 8 ImmunoMount l (Thermo Scientific, Inc.). Golpee suavemente el cubreobjetos abajo para eliminar cualquier burbuja de aire.
8. Aplicar esmalte de uñas a los bordes del cubreobjetos para asegurarla en su lugar.
9. La visualización de ARN y proteínas por técnicas de microscopía es también crítica para el éxito de esta técnica. Ajustes en el microscopio usado pueden ayudar o dificultar la visualización por lo que es clave que elajustes en el microscopio se establece correctamente y ser coherente con una muestra a otra en un experimento dado. Para los ajustes detallados de microscopía, la óptica y las combinaciones de anticuerpos por favor, vea las referencias ^1,10.

5. Los resultados representativos

Un ejemplo de virus ARN de tinción se puede ver en la Figura 2. El ARN viral del VIH-1 se ve en todo el citoplasma muestra difusamente en su mayor parte, aunque punctae citoplasmática pequeña no son infrecuentes. La especificidad puede verse comparando las células positivas a las células circundantes que muestran ninguna fluorescencia. Como se mencionó en la introducción, el VIH-1 que carece de la proteína reguladora Rev produce ARN que se mantengan en el núcleo: esto puede ser visualizado como una señal luminosa en el núcleo, y una falta de ARN señal de fluorescencia en el citoplasma. La sobreexpresión de proteínas celulares también es capaz de cambiar la distribución de los ARN virales de VIH-1. En la Figura 2 , la sobreexpresión de las proteínas implicadas en el tráfico de vesículas endosomal (por ejemplo, la interacción Rab7-lisosomal de proteínas (RILP) ¹¹ o N-terminal suprimido RILP (RILPN) ^11, y las proteínas que interfieren con la función motora dineína [por ejemplo, p50/dynamitin ^{1, 12],} interferir con la normal de estado estacionario localización del RNA genómico viral como se determina por análisis de FISH expresión RILP conduce a re-localización del RNA genómico viral a los microtúbulos organización central (COMT) ^13;. RILPN dispersa tarde endosomas dentro del citoplasma debido a la incapacidad para unirse a p150 ^encolada del complejo dineína motor ¹⁴ y los bloques p50/dynamitin la subunidad grande de dineína motor y comunicados finales endosomas sino también el RNA genómico viral del VIH-1 y proteínas estructurales de la periferia de la célula ¹ (Figura 2). La manipulación de la localización de estado estable del RNA genómico viral, un elemento clave para la capacidad de infección departículas del virus, sería la clave para el futuro desarrollo de la terapéutica. En nuestras manos, el ARN viral aparece en la celda tan pronto como 3 horas después de la transfección y la infección ¹⁰ y se convierte fácilmente observable por esta técnica de FISH por 12 horas.

Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo de FISH / si los compañeros de análisis. Las células se cultivaron en cubreobjetos y se fijaron con paraformaldehído. Los tratamientos de glicina y Triton X-se realizan antes de que las células son o bien utilizarse para FISH / SI o almacenado en etanol al 70% para el almacenamiento. Las células deshidratadas para el almacenamiento se rehidratan en 1X DPBS (tratada con DEPC PBS) antes de continuar con FISH / SI. Las células son tratadas con DNasa I y dejó durante la noche para hibridar con la sonda. Una vez que la hibridación es completa, las células se lavan con formamida, así como con SSPE, y un enjuague final de 1X DPBS. Solución de bloqueo se aplica a las células, seguido de incubación conlos anticuerpos primarios. Después del lavado, los anticuerpos secundarios se aplican. Dos lavados finales en 1X DPBS completar el procedimiento de tinción, donde a los cubreobjetos se secan y se montaron en portaobjetos para la imagen.

Figura 2. Los resultados representativos mediante FISH / SI co-análisis. A) del VIH-1 se transfectaron en células HeLa y en algunos casos con construcciones que causan la sobreexpresión de proteínas celulares (RILP, p50/Dynamitin y RILPΔN (una supresión amino-terminal mutante)) . PESCADO / si los compañeros de análisis se llevó a cabo: el ARN se identifica en verde, ya sea con o G3BP LÁMPARA1 (rojo) para diferenciar. B) El VIH-1 se expresa en células HeLa y se recoge en diferentes puntos temporales. La expresión del ARN viral se sigue en verde, mientras que la proteína celular, hnRNP A1, se tiñe de rojo. Barras de tamaño son 10 micras. Imágenes modificadas de las referencias ¹ (figuras selectas de grupo A; RILP, p50/Dynamitin y deltana RILP)y ¹⁷ (panel B).

Discusión

PESCADO / si los compañeros de análisis es un método confiable para visualizar el ARN viral en las células que ahora se ha ido perfeccionando ^9,15,16. En el transcurso de varios años, hemos desarrollado un método perfeccionado de la tinción de ARN. Esta técnica se puede utilizar en una amplia gama de tipos de células siempre que la sonda es específica para la diana de ARN ^17. En el etiquetado de la sonda con DIG, somos capaces de visualizar el ARN mediante tinción simple. Cuando la tinción de ARN y las proteínas se combinan otras, FISH / si los compañeros de los análisis de convertirse en una poderosa herramienta para observar las estructuras celulares y localización de la proteína / RNA.

La especificidad de la detección de RNA es bastante alta. Esto se ilustra en la Figura 2. En algunas de la obra original que se centró en la localización del ARN genómico viral, FISH estableció que la falta de Rev atrapado ARN viral en el núcleo ^18. Dado esto, la información abundante nuevo en genómica localización del ARN viral se ha obtenido mediante el Technique indica aquí. Por sobreexpresan proteínas celulares, las poblaciones de específicas y no todo-del ARN viral puede ser obligado a localizar a las diferentes regiones de la célula. Sobreexpresión RILP, que se asemeja al fenotipo obtenido cuando hnRNP A2 se agote por siRNA en VIH-1-células que expresan ^13, hace que el ARN para acumular visiblemente en el COMT. El RNA genómico viral puede ser empujada a la periferia de la célula mediante la desactivación de la proteína motora menos extremo, dineína: la sobreexpresión p50/Dynamitin o una caída de las cadenas pesadas de dineína ^{1 da como} resultado la liberación de ARN genómico del virus de dominios intracelulares a la periferia celular ( Figura 2). Un mutante de RILP, RILPΔN, que ya no se une el motor dineína, se dispersa endosomas (marcados por LÁMPARA1) en el citoplasma, ya que ya no se activa localizada en dominios juxtanuclear. Estos resultados apuntan a la noción de una población de plástico de VIH-1 RNA genómico y, en particular, de que grupos diferentes de VIH-1 genómicoARN existen con roles a veces identificables en el ciclo de replicación viral. Estas mismas ideas ya han sido identificados para la proteína codificada por este ARNm, Gag ^19.

Existen limitaciones en los usos de FISH / si los compañeros de los análisis que están relacionados con la elección de anticuerpos y disponibilidad. La optimización de la mejor combinación de anticuerpos primarios y secundarios, y sus concentraciones, se necesitará tiempo para optimizar (ver Tabla 1 y 2). Anticuerpos producidos a partir de hibridomas o producidos por las grandes empresas pueden tener concentraciones que varían según el lugar de 1:2 a 1:2000, pero asegúrese de seguir las directrices proporcionadas por el fabricante para obtener mejores resultados. El huésped en la que se produce el anticuerpo también debe tomarse en consideración. Ovejas de mezcla con anticuerpos de cabra también se debe evitar en anticuerpos primarios y secundarios en esta combinación resulta en un fondo elevado debido a la cruzada de especies de reconocimiento (datos no mostrados). Para Alexa-Fluor secondary anticuerpos, la concentración puede ser utilizado en 1:500 para casi cualquier anticuerpo en el conjunto. El otro inconveniente con FISH / si los compañeros de análisis como se describe en este informe es que captura el ARN en su ubicación en el estado estacionario, después que las células han sido fijados con paraformaldehído y permeabilized y detergente (figura 1).

Sin embargo, el ARN de imágenes en células vivas que se ha logrado a través de una variedad de medios de ^{20 a 22,} en su mayoría utilizando variaciones de genomas virales de ARN que son marcadas por las proteínas fluorescentes, tales como las buenas prácticas agrarias. Sin embargo, medios adicionales para identificar la localización del ARN en células vivas siguen a la superficie. Estos nuevos métodos implican el ARN marcado por medio de la espinaca ^{23, 24,} o SNAP mTrip ^2. Estas técnicas también sufren de algunos inconvenientes, incluyendo el requisito para permeabilizar las células antes de la adición de sustratos o un resto que debe ser diseñado para etiquetar el ARNm con el fin de detectar el ARNm por microscopía. De hecho, la mayor Advantage de análisis FISH descritas en este informe reside en el hecho de que el ARN es inalterado nativo que conduce a los resultados más fisiológicamente relevantes.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos de 18 mm	VWR	48380 046
16% de paraformaldehído	JT Baker	S898-07	Para hacer 4%: disolver 20 g en 500 ml 1XDPBS a 60 ° C con 5 gotas de NaOH. el pH a 7,2 el calor y almacenar a -20 ° C. No exceder los 70 ° C!
Triton X-	OmniPur	9400
Micro Eluir Gel Extraction Kit	Roche	D6294-02
DIG RNA Etiquetado Mix	Roche	11277073910
Transcripción T7 ARN polimerasa	Invitrogen	18033-019
Columnas Un paseo rápido	Roche	11814427001
DNasa I	Invitrogen	18047-019
1X DPBS	Gibco	14190-250
Formamida	EMD	FX0420-8
tRNA	Invitrogen	15401-021
RNasa OUT	Invitrogen	10777-019
Anticuerpos fluorescentes Enhancer Set para la detección DIG # 4 (solución de bloqueo)	Roche	1768506
Alexa Fluor secundaria de anticuerpos	Invitrogen	Ver Tabla 2
Horno de hibridación	Boekel Cienciacientífica	Modelo 24100
Portaobjetos	VWR	48300-047
Immunomount	Thermoscientific	9990402

Las especies de anticuerpos anti-DIG (dilución, empresa, número de catálogo)	Colores	Alexa Fluor usada (1:500)
Ratón (1:500; Sigma, B7405)	verde	Alexa Fluor 488 burro anti-ratón (Invitrogen, A21202)
	rojo	Alexa Fluor 594 burro anti-ratón (Invitrogen, A21203)
	azul	Alexa Fluor 647 burro anti-ratón (Invitrogen, A31571)
Ovejas (1:200; Roche, 11376623)	verde	Alexa Fluor 488 burro anti-oveja (Invitrogen, A11015)
	rojo	Alexa Fluor 594 burro anti-oveja (Invitrogen, A11016)
	azul	Alexa Fluor 647 burro anti-oveja (Invitrogen, A21448)